Het vastleggen van actief geproduceerde microbiële vluchtige organische stoffen uit mens-geassocieerde monsters met vacuümondersteunde sorptie-extractie

Dit protocol stelt ons in staat om vluchtige metabolieten en actief geproduceerde vluchtige stoffen uit microbiële organismen in verschillende biologische monsters gemakkelijk te concentreren en te identificeren. VASE is een gebruiksvriendelijkere methode om vluchtige stoffen met een lage abundantie te concentreren. Het enige wat je nodig hebt is een monster onder bijna-vacuüm, en laat de natuurkunde de rest doen.

Toegang tot vluchtige analyse van klinische monsters heeft belangrijke implicaties voor de ontdekking van metabole biomarkers in een aantal verschillende ziektetoestanden. De pathogene drijvende kracht en infectie of het succes van antibacteriële therapie kan bijvoorbeeld worden gedetecteerd met vluchtige analyse van speeksel-, sputum- of ademmonsters. Om fecale monsters te bereiden, voegt u gedurende drie minuten een milliliter gedeïoniseerd water toe aan 100 milligram uitwerpselen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en vortex.

Bewaar de monsters op ijs wanneer ze niet in gebruik zijn. Voeg 485 milliliter BHI-medium met 20 millimolaire 13C glucose of BHI met 30% deuterium toe aan 15 microliter fecaal en watermengsel, zodat het uiteindelijke volume van het monster 500 microliter is. Bereid monsters voor in technische drievoud.

Om rioolwatermonsters te bereiden, voegt u 500 microliter rioolwater toe aan 500 microliter BHI-medium met 13C glucose of 30% deuterium voor een totaal volume van één milliliter. Bereid monsters in drievoud en bewaar ze op ijs. Om speekselmonsters te bereiden, voegt u 50 microliter speeksel toe aan 500 microliter BHI-medium met 13C glucose of 30% deuterium voor een totaal volume van 550 microliter.

Bereid monsters in drievoud en bewaar ze op ijs. Om sputummonsters te bereiden, voegt u 15 microliter sputum toe aan een injectieflacon. Bereid monsters in drievoud en bewaar ze op ijs.

Plaats lege VOA-injectieflacons op de koude plaat en plaats de koude plaat op ijs in de bioveiligheidskap. Schakel de 5600 SPEU in en stel deze in op de gewenste temperatuur. Label VOA-injectieflacons van 20 milliliter volgens monsters, replicaties en HSP-ID's met behulp van een waterbestendige marker die bestand is tegen water in het geval condensatie zich vormt aan de buitenkant van de injectieflacon terwijl u op ijs bent.

Schroef in de bioveiligheidskap de witte dop op de injectieflacon los, pipetteer snel het monster in de injectieflacon en monteer de dekselvoering, zwarte dop en HSP. Plaats de injectieflacon met het monster en HSP terug op de koude plaat. Zodra alle monsters in de glazen injectieflacons zijn voorbereid, schakelt u de vacuümpomp in, plaatst u de injectieflacons onder vacuüm en verwijdert u de vacuümbron.

Controleer de druk na het plaatsen van alle monsters onder vacuüm met behulp van de manometer. Als er een injectieflacon lekt, zorg er dan voor dat de dop goed is vastgeschroefd en dat de witte O-ringen van de HSP- en dekselvoeringen correct op hun plaats zitten. Plaats injectieflacons in de SPEU voor de geoptimaliseerde tijd en temperatuur met roeren bij 200 RPM.

Extraheer culturen gedurende een uur bij 70 graden Celsius en extraheer stabiele isotype-tastende experimenten met fecale, rioolwater-, speeksel- en sputummonsters gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius. Plaats de koude plaat op min 80 graden Celsius voor gebruik nadat de extractieperiode is voltooid. Wanneer de extractie is voltooid, plaatst u monsters gedurende 15 minuten op de koude plaat om waterdamp uit de HSP- en flaconkopruimte te halen en brengt u de HSP's vervolgens over naar hun mouwen.

Stel de volgorde van monsters in op de Entech-software. Open het programma en selecteer 5800 en Volgorde in de opties rechts van het vervolgkeuzemenu Instrument. Sla de volgordetabel op, selecteer Uitvoeren aan de linkerkant en vervolgens Start met leeg in Desorber als de lege HSP niet de desorber is.

Houd er rekening mee dat HSP's worden afgehandeld door de SPR voor elk monster in de reeks. Laat de SPR opwarmen. Sta de SPR toe om alle voorbeelden automatisch uit te voeren.

De volgorde aan de GC-MS-kant registreert de gegevens automatisch in afzonderlijke bestanden. Voeg een piek toe aan de verwerkingsmethode door Kalibreren te selecteren, gevolgd door Compound bewerken, Naam en Compound invoegen onder Externe standaardsamenstelling. Voeg de naam van de verbindingen, retentietijd en kwantitatief signaaldoelion toe.

Voeg de drie grootste pieken toe, waaronder verbindingen met een waarschijnlijkheid van meer dan 75%, zodat de uitlijning van elk identificerend ion van de verbinding in het midden van de piek ligt. Sla het op door OK te selecteren, gevolgd door Methode en Opslaan. Zodra de procesmethode is ingesteld, gaat u verder met Quantitate en Calculate en vervolgens View en QEDIT Quant Result om de gegevens te kwantificeren.

Hier werd vacuümondersteunde sorptie-extractie gevolgd door thermische desorptie op een GC-MS om de vluchtige profielen van bacteriële mono- en coculturen te onderzoeken en actief geproduceerde vluchtige stoffen te identificeren met stabiele isotoop die uit menselijke uitwerpselen, speeksel, rioolwater en sputummonsters tast. De mono- en coculturen bestonden uit de bacteriesoorten staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa en acinetobacter baumannii. 43 geannoteerde vluchtige moleculen werden gedetecteerd uit de mono- en coculturen op 24- en 48-uurstijdpunten.

Er was meer opname van 13C in volledig gelabelde vluchtige moleculen in vergelijking met het deuterium. 13C werd opgenomen in 2-butanone, 3-hydroxy, 2, 3-butanedione diacetyl, azijnzuur en fenol voor alle fecale, riool- en speekselmonsters. Aceton, butaanzuur en propaanzuur werden gedetecteerd als gelabeld in speeksel en rioolwater.

terwijl dimethyltrisulfide en disulfidedimethyl werden verrijkt in zowel fecale als speekselmonsters. De vluchtige stoffen 1-propanol, 2-butanon, benzofenon, ethanol en methylthiolacetaat werden alleen verrijkt in rioolwater en 2, 3-pentanedion in speeksel. Deuterium werd opgenomen in de vluchtige stoffen azijnzuur, benzaldehyde, 4-methyl-dimethyltrisulfide en fenol uit speeksel- of rioolwatermonsters.

Azijnzuur, dimethyltrisulfide, aceton en propanol 2-methyl waren overvloediger aanwezig in de gekweekte sputummonsters dan niet-gekweekte sputummonsters. Een gepermuteerde multivariate analyse van varianten, een PERMANOVA, werd uitgevoerd op een Bray-Curtis afstandsmatrix van de vluchtige abundanties van de cystic fibrosis sputum monsters. We ontdekten dat de proefpersoon die de steekproef doneerde 51% van de variatie in 13C-gelabeld gekweekt sputum en 33% van de variatie in ongecultiveerd sputum verklaart.

Hier wordt het succes aangetoond van stabiele isotoopetikettering met 13C glucose in vluchtige stoffen uit gekweekte sputummonsters verzameld van zeven mensen met cystische fibrose. Vluchtige stoffen met een hogere 13C-opname voor de meerderheid van de monsters worden getoond in paneel 5A, die met een lager percentage 13C-opname in de meerderheid van sputummonsters bevinden zich in paneel 5B en moleculen met een lagere 13C procent conversie in een minderheid van de sputummonsters worden weergegeven in paneel 5C. Controleer altijd de druk van uw injectieflacon na ongeveer een minuut.

Een gebroken vacuüm verslaat de gevoeligheid en snelheid van de VASE-methode. Na deze procedure, als stabiele isotooponderzoek is uitgevoerd, kan het DNA uit het resterende materiaal worden geëxtraheerd om microbiële organismen of soorten te identificeren die mogelijk hebben bijgedragen aan de productie van de vluchtige moleculen. Deze methode is ook nuttig bij het detecteren van vluchtige stoffen uit elk monstertype zonder isotopenonderzoek.

Met voordelen van gevoeligheid en laag monstervolume kunnen veel toepassingen profiteren van deze techniek.