Laboratoriumproeven met kleine kooien van genetisch gemanipuleerde anophelinemuggen

Het hier beschreven protocol is geschikt om de prestaties van transgene muggen en vergelijkingen met wilde tegenhangers in een kleine laboratoriumkooiproeven te evalueren. De proeven met kleine kooien zijn belangrijk om empirische waarden te bieden die zullen helpen bij de implementatie van nieuwe technologieën voor de eliminatie van malaria. De kooiproeven kunnen worden aangepast aan andere experimentele ontwerpen en zijn geschikt om de dynamiek van een dreiging van een wenstrans-gen te beoordelen.

Na de introductie transgene individuen. Begin de eerste fase van het experiment door drie kooien van 0,216 kubieke meter in drievoud op te zetten. En het toevoegen van 60 second-instar wild type larven aan elke kooi gedurende drie opeenvolgende weken.

Voorzie volwassen vrouwtjes in elke kooi elke week van verdoofde muizen als bloedmeelbron. En een ovipositiecontainer drie dagen na de bloedmaaltijd. Broed wekelijks eieren uit elke kooi.

Selecteer van week vier tot acht willekeurig 60 second-instar L2-larven om terug te keren naar hun respectievelijke kooien. Wijs in week negen willekeurig één set drievoudige kooien toe als controles en één set voor elke gewenste afgifteverhouding. Voeg wekelijks 60 poppen van het wilde type met 30 mannetjes en 30 vrouwtjes toe aan de controlekooien.

Zorg voor een één op één verhouding in elke respectievelijke kooi door wekelijks 30 transgene mannelijke poppen toe te voegen, samen met 60 poppen van het wilde type. Voor een verhouding van één tot 0,1 voegt u wekelijks 300 transgene mannelijke poppen toe aan elke respectieve kooi, samen met 60 poppen van het wilde type. Herhaal het toevoegen van muggenpoppen in de kooi, het verstrekken van bloedmeel en het uitbroeden van eieren elke week.

Selecteer in totaal 300 larven uit elke kooi willekeurig voor screening. Screen de larven onder een stereomicroscoop met fluorescentiefilters voor de expressie van de fluorescerende dominante marker in larvale en popstadia. Scoor het geslacht van de resulterende poppen.

Gebruik in het gene drive-experiment een barrièrestrategie door muggen in een veilige insectary te houden en standaard operationele procedures met regelmatige monitoring te volgen. Bereid een kooi voor met twee sets drievoudige kooien van 0,216 kubieke meter voor elke gewenste transgene tot wilde mannelijke afgifteverhouding. Om een mannelijke afgifteverhouding van één op één te bereiken, voegt u 120 transgene mannetjes, 120 mannetjes van het wilde type en vrouwtjes in het popstadium toe aan elke replicatiekooi.

Geef een bloedmaaltijd met behulp van verdoofde muizen aan vier tot zeven dagen oude vrouwtjes in elke kooi. Na het uitkomen van eieren in een larvale tray, selecteert u ongeveer 240 eerste instar L1-larven willekeurig uit elke kooi en voedt u ze op om poppen te maken voordat u terugkeert naar hun respectieve kooien. Selecteer en screen larven op oogmarker en geslachtsfenotype zoals eerder beschreven.

Stel een kooiopstelling samen van drievoudige kooien van 0,005 kubieke meter met een gelijk aantal mannetjes en vrouwtjes voor elke specifieke afgifteverhouding van transgenen tot mannetjes van het wilde type. Gebruik een kunstmatig voedingsapparaat om de vier tot zeven dagen oude vrouwtjes in elke kooi op twee opeenvolgende dagen bloedmaaltijden te geven. Voeg drie dagen na de tweede bloedmaaltijd een ovipositiecontainer toe en verwijder de containers na drie dagen.

Na het scoren van alle doden en de levende volwassenen die in de kooi achterblijven op geslacht, bewaar ze bij min 80 graden Celsius voor moleculaire analyse. Broed eieren uit en ren selecteer 200 L1-larven en zet de larven opzij om nieuwe kooien voor de volgende generatie te bevolken. Selecteer vervolgens willekeurig nog eens 500 larven uit elke kooi die opzij is gezet voor screening.

Kweek de geselecteerde 200 larven tot pop en 500 larven tot L4 instar stadium. Breng pop uit 200 trays terug om een nieuwe kooi te vullen. Screen willekeurig geselecteerde larven voor oogmarker en geslachtsfenotype Zoals voorheen.

In de representatieve analyse wordt de verwachte fenotypedynamiek van de best presterende replicaties getoond voor de verschillende populatievervangende kooiproevenprotocollen. De resultaten toonden het lineair toenemende aandeel larven met DsRed marker fenotype over zeven generaties. De één-op-één niet-drive release bereikte iets meer dan 80% transgene introductie binnen zeven generaties.

De gene drive protocollen bereikten dit binnen drie tot vier generaties. Dit bevestigt dus dat een enkele afgifte van een gene drive-systeem efficiënter kan zijn voor transgeninintroductie. Aan het einde van de waarneming had de verspreiding van het transgen een bijna volledige introductie bereikt in gene drive-systemen.

Belangrijke parameters, zoals de leeftijdsstructuur van de populatie, de grootte van de kooi en andere, variëren afhankelijk van het doel van het experiment en de specifieke doelstellingen. Experimenten om fitnessparameters zoals vruchtbaarheid en vruchtbaarheid te beoordelen, kunnen worden uitgevoerd. Verdere meer empirische gegevens uit de kooiproeven kunnen worden gebruikt om wiskundige modellen van populatiedynamiek te parametriseren.