Micro-injectie methode voor Anopheles gambiae embryo's

Dit protocol is belangrijk omdat het een specifieke micro-injectiemethode biedt voor een Anopheles gambiae, die historisch moeilijk te transformeren is met behulp van gangbare genetische manipulatietechnieken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het op betrouwbare wijze transgene Anopheles gambiae creëert. De toepassingen van deze techniek strekken zich uit tot nieuwe strategieën voor de eliminatie van malaria door het vergemakkelijken van de creatie van muggen die geschikt zijn voor populatieonderdrukking of wijziging van wild-type Anopheles gambiae populaties.

Deze methodologie kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende muggensoorten. Onze micro-injectietechnologie vergt geduld en oefening. Er is een leercurve.

Gebruik om te beginnen een aspirator om 20 tot 30 vrouwtjes in een transparante conische buis van 50 milliliter te plaatsen. Zorg ervoor dat de buis aan beide uiteinden wordt opengesneden en aan het ene uiteinde bedekt is met latex tandfolie en aan het andere uiteinde met nylon gaas en filtreerpapier, waar muggen hun eieren leggen. Plaats de met muggen gevulde buis in een kleine petrischaal gevuld met dubbel gedestilleerd water en plaats de buis en schaal vervolgens gedurende 45 minuten in een incubator bij 28 graden Celsius.

Haal de buis uit de couveuse en steek de buis in een lege kooi. Tik zachtjes op de buis om muggen naar buiten te laten vliegen. Verwijder de buis uit de kooi zodra alle muggen eruit zijn gevlogen.

Wanneer de buis vrij is van muggen, schroeft u de onderste ring los, verwijdert u het nylon en gebruikt u een tang om het filterpapier met de eieren voorzichtig uit de buis te verwijderen. Leg het met eieren beladen filterpapier in een plastic petrischaaltje met daarin een laag met water bevochtigd filtreerpapier. Plaats een membraan op een schone glasplaat en gebruik een schone tang om het membraan te bedekken met een stuk filterpapier, waardoor ongeveer een millimeter van het membraanfilter onbedekt blijft.

Maak het filterpapier nat met gedeïoniseerd water en gebruik vervolgens de borstel om voorzichtig 30 tot 50 embryo's naar de rand van het membraan over te brengen en de eieren verticaal langs het membraan uit te lijnen. Oriënteer de eieren in dezelfde richting, zodat wanneer eieren onder de micro-injectiemicroscoop worden waargenomen, het achterste uiteinde zich in een neerwaartse positie bevindt en een hoek van 15 graden vormt met de naald. Bekleed de hele rand van het membraan met eieren.

Gebruik een microloader tip om de naalden te vullen met twee microliter DNA mengsel. Steek de naald in de naaldhouder en sluit de automatische drukpompslang aan. Lijn de naald zo uit dat deze een hoek van 15 graden maakt met het vlak van de dia.

Open de naaldpunt door het eerste ei voorzichtig aan te raken en steek vervolgens de punt van de naald tot ongeveer 10 micrometer in de achterste paal. Een succesvolle injectie zal leiden tot een kleine beweging van het cytoplasma in het ei. Gebruik de coaxiale faseregelaars van de microscoop om naar het volgende ei te gaan om de injectie voort te zetten.

Om ervoor te zorgen dat de punt van de naald open blijft en niet verstopt is, drukt u op de injecteerknop voordat u een ander embryo binnengaat en visualiseert u het kleine druppeltje bij de opening van de naald. Als de naald verstopt raakt, drukt u op de knop Wissen om de naald te wissen en herhaalt u de druppelvisualisatietest. Pas de druk indien nodig aan als de opening van de naaldpunt iets groter wordt om ervoor te zorgen dat de druppelgrootte klein blijft.

Injecteer ongeveer 40 tot 50 eieren met één naald. Nadat de injecties zijn voltooid, spoelt u de eieren af in een glazen container bekleed met filtreerpapier en gevuld met 50 milliliter gedeïoniseerd water. Met behulp van dit protocol werd een autonoom gengestuurd systeem ingebracht in de kiembaan van een laboratoriumstam G3 van Anopheles gambiae.

Het systeem is ontworpen om de kardinaalsortoloog, of Agcd, op het derde chromosoom in deze soort te richten. Het plasmide pCO37 wordt getoond. Het bevat Streptococcus pyogenes Cas9 endonuclease onder controle van de regulerende elementen van het nanos gen ortholoog.

Daarnaast heeft het een geleidings-RNA onder controle van een U6-genpromotor en de 3XP3 CFP dominante markercassette die het cyaan fluorescerende eiwit tot expressie brengt. Moleculaire benaderingen verifieerden de nauwkeurige inbrenging van ongeveer 10 kilo basenparen DNA, die werd aangeduid als AgNosCd-1. Uitgebreide follow-upanalyses toonden aan dat AgNosCd-1 zeer efficiënt was bij het aandrijven, weinig resistente allelen creëerde en geen grote genetische belasting had als gevolg van de integratie en expressie van het gene drive-systeem.

Homozygote gene drive met muggen waren mutanten met functieverlies, met larven, poppen en nieuw ontstane volwassenen met een rood-ogenfenotype. Bij het proberen van dit protocol is het cruciaal om op 88 te blijven voor een goede uitkomst om lichtgrijze eieren te verlichten en witte eieren te vermijden.