Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Het kleinschalige plasmamembraanisolatieprotocol en mGFPHis double tag bieden een economische, snelle, betrouwbare en eenvoudige methode om membraaneiwitten te karakteriseren in het eukaryote modelorganisme Saccharomyces cerevisiae. Het grootste voordeel van deze technologie is het gemak en de snelheid waarmee de expressieniveaus van membraaneiwitten, de activiteiten van de ATP en het reinigingsmiddel dat het meest geschikt is voor hun zuivering kunnen worden bepaald. Deze technologie is zeer gebruiksvriendelijk.

Een belangrijk punt om te onthouden is echter om cellen te oogsten als OD 600 van 2, wat zorgt voor een lage mitochondriale besmetting en de hoogst mogelijke ATPase-activiteiten. Begin met het voorkweken van een enkele gistkolonie in 10 milliliter YPD-medium bij 30 graden Celsius gedurende zeven tot acht uur met 200 rotaties per minuut. Gebruik 10 milliliter voorcultuur om 40 milliliter vers YPD-medium te enten.

Incubeer vervolgens de cellen 's nachts bij 30 graden Celsius met 200 rotaties per minuut totdat de celdichtheid een OD 600 van één tot drie bereikt. Oogst de volgende dag 40 optische dichtheidseenheden, of ODU, van logaritmische gezichtscellen door te centrifugeren op 4, 200 keer G per vijf minuten bij vier graden Celsius. Cellen opnieuw opschorten en wassen met 40 milliliter ijskoud steriel dubbel gedestilleerd water.

Herhaal het wassen met één milliliter ijskoud water met centrifugaalisatie tussen de wasstappen. Suspensie de pellet opnieuw in een milliliter ijskoud steriel water en breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter die voorgekoeld is op ijs. Oogst cellen op 3,300 keer G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius.

Aspirateer het supernatant en suspensie de celkorrel opnieuw in 500 microliter homogenisatorbuffer vers aangevuld met één millimolar fenal methylsulfaar Neal fluoride, of PMSF. Bewaar de celsuspensie bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Ontdooi de cellen op ijs gedurende ongeveer een uur.

Voeg vervolgens ijskoude silicaparels met een diameter van 0,5 millimeter toe aan de 500 microliter van de celsuspensie om een totaal volume van één milliliter te bereiken. Om de cellen te breken, vortex de celsuspensie op maximale schudintensiteit gedurende één minuut, gedurende zes cycli, met een afkoelingsperiode van drie minuten op ijs na elke cyclus. Maak na het vortexen een dun gaatje aan de onderkant van de buis met een verwarmd scalpelmes en verzamel het gebroken celhomogenaat in een andere ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met een draaisnelheid op lage snelheid gedurende 10 seconden.

Centrifugeer het verzamelde celhomogenaat op 5, 156 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om celresten te verwijderen. Breng 450 microliter supernatant over in een ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg een milliliter ijskoude homogeniseerbuffer toe, aangevuld met één millimolaire verse PMSF. Om plasmamembranen te oogsten, centrifugeer je de celsuspensie op 17, 968 keer G gedurende een uur bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant en voeg 100 microliter homogenisator toe, vers aangevuld met één millimolaire PMSF. Maak vervolgens de plasmamembraankorrel los door te roeren met de pipetpunt van 100 microliter en suspensie de pellet opnieuw op en neer door het pipetteren te herhalen. Meet de eiwitconcentratie van het plasmamembraanpreparaat met een eiwittestkit die compatibel is met buffers die het reductiemiddel en het reinigingsmiddel bevatten.

Bewaar de plasmamembranen bij min 80 graden Celsius, of bewaar ze op ijs voor onmiddellijk gebruik. Giet vier tot vijf milliliter scheidingsgel in het geassembleerde gelapparaat tot twee centimeter van de bovenkant. Leg er voorzichtig één tot twee milliliter 0,1% SDS op en laat de polyacryryamidegel 60 minuten op kamertemperatuur uitzetten.

Verwijder na een uur de 0,1% SDS-laag van de gepolymeriseerde scheidingsgel en spoel de gel af met dubbel gedestilleerd water om sporen van SDS te verwijderen. Giet het stapelgelmengsel op de scheidingsgel. Plaats een kam in de stapelgel en verwijder eventuele luchtbellen rond de kam.

Laat de stapelgel vervolgens 60 minuten op kamertemperatuur staan. Verwijder de kam en spoel vervolgens de gelsleuven af met water. Doe de gel in de geltank en vul de geltank tot de bovenkant met loopbuffer.

Meng vijf tot 10 microliter plasmamembraanmonsters met gelijke volumes van twee keer de eiwitbeladende kleurstof en laad het monstermengsel onmiddellijk in afzonderlijke gelsleuven, ondergedompeld in een lopende buffer. Laad eiwitmoleculaire gewichtsmarkers in het bereik van 10 tot 245 Kilodalton in een aparte sleuf om de grootteschatting van individuele eiwitfragmenten mogelijk te maken. Voer gel-elektroforese uit bij 200 volt totdat de blauwe ladingskleurstof de bodem van de gel bereikt.

Onderzoek de gel op in-gel GFP-fluorescentie met een gelbeeldvormingssysteem. Na de fluorescerende beeldvorming fixeren eiwitten in 10 tot 20 milliliter eiwitgelfixerende oplossing door de gel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur zachtjes te roeren. Spoel de twee keer gedurende 10 minuten met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water en plaats de gel in 10 milliliter colloïdale Kumasi-vlekoplossing met zacht schudden gedurende een uur bij kamertemperatuur om eiwitbanden te visualiseren.

Voor een betere visualisatie van eiwitbanden, de-kleuring van de gel een of twee keer in 20 milliliter dubbel gedestilleerd water gedurende een uur voordat beelden worden opgenomen met het gelbeeldvormingssysteem. Een hoge frequentie van transformatie van Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta werd bereikt met het positieve controleplasmide PS2. Er werden geen Eurocell Prototron-transformanten verkregen voor de negatieve controle.

Ongeveer 50 URA-cel prototrofe CDR1-mGFPHis-transformatiemiddel werd verkregen na het incuberen van getransformeerde AD Delta Delta-cellen op CSM minus URA-platen gedurende drie dagen. Kleine transformant die niet op YPG-agarplaten kan groeien, werd geëlimineerd. CDR1-mGHPHis monsters met verschillende concentraties werden gekwantificeerd met in-gel fluorescentie.

De mGFP-fluorescentie-intensiteiten waren lineair over het gehele concentratiebereik met minimale achtergrondfluorescentie. Het variëren van de celdichtheid gaf aan dat het breken van 40 ODU van cellen de hoogste kwaliteit plasmamembranen met de hoogste CDR1 ATPase-activiteit opleverde. De opbrengst van de plasmamembranen nam echter toe in verhouding tot toenemende celdichtheden.

Het vermogen van 31 detergentia met verschillende eigenschappen om CDR1-mGHPHis op te ruimen uit ruwe plasmamembranen van AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis-cellen werden getest met SDS-pagina. Beta en alpha DDM En Fos-choline 13 waren de beste wasmiddelen om CDR1-mGHPHis op te slokken. Echter, Fos-choline 13 veroorzaken gedeeltelijke hydrolyse van CDR1-mGHPHis.

Ruw plasmamembraaneiwit opgelost met 1% wasmiddel werd gescheiden met behulp van een superos zes verhoogde uitsluitingskolom van 10 300 GL. Chromatogrammen van Maltosiden en LMNG geëxtraheerde eiwitten toonden de meeste CDR1-mGHPHis ontglipte als een mooi gevormde Gaussische piek op 15,5 millimeter CDR1-mGHPHis opgelost met glucose bevattende detergentia zinspeelde als een geaggregeerde of brede geaggregeerde piek. De hogere pieken voor DDM gaven aan dat een groot deel van DMN G oplosbare CDR1-mGHPHis gedenatureerd kan zijn.

In de FSCC chromatogrammen voor zwitterionische Fos-cholines en twee niet-ionische detergentia alleen Digitonin en gaf een vergelijkbaar chromatogram als DDM. Fos-choline 13 gaf een symmetrische scherp gevormde piek, maar het zinspeelde op een significant lager elutievolume dan dat voor DDM. De geoptimaliseerde dubbele tag verbeterde ook de zuiveringsopbrengst en hielp bij het bepalen van de lokalisatie, handel en thermische stabiliteit van membraaneiwitten.

De heterologe expressietechnologie kan ook worden gebruikt bij high throughput drug screening en de gedetailleerde karakterisering van vele andere membraaneiwitten.