Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Dit protocol biedt een hoge doorvoer en betrouwbare samenstelling voor NHEJ-analyse die de prevalentie en relatieve hoeveelheid indelmutaties in gen-bewerkte muggenpopulaties kan bepalen. In vergelijking met de volgende generatie, of Sanger-sequencing, heeft ddPCR een snellere doorlooptijd voor resultaten, waardoor een snelle en volledige analyse van genetische variatie naar veld voor genetisch gemodificeerde organismen mogelijk is. Deze methode moet algemeen toepasbaar zijn op alle experimentele systemen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Thai Pham, een stafonderzoeksmedewerker van het yang-lab. Bereid om te beginnen 25 microliter van de digitale druppel PCR of ddPCR-monstermix door ddPCR-supermix, voorwaartse en omgekeerde primers, HEX- of FAM-sondes, DNA en water toe te voegen in de verhoudingen die in de tekst worden beschreven. Meng vervolgens de reactie grondig door vortexing.

Gebruik een meerkanaalspifflp van 50 microliter om 20 microliter van het ddPCR-monstermengsel in de middelste rij van de patroon te plaatsen. Gebruik vervolgens een meerkanaalspion van 200 microliter om 70 microliter van de olie in de onderste rij te laden zonder bubbels te genereren tijdens het pipetteren. Plaats de pakking, raak alleen de randen aan, vermijd het midden, het geconcavedeerde gebied en plaats de plaat vervolgens stevig in de druppelgenerator en sluit het deksel om de run te starten.

Om het onderdompelingsmengsel van de bovenste rij van de patroon over te brengen naar de 96-putplaat, gebruikt u een meerkanaalspipet en laat u 40 microliter vloeistofmonster gedurende drie tot vijf seconden onder een hoek van 30 tot 45 graden vallen. Laat het mengsel vervolgens gedurende meer dan drie seconden langzaam in de put vallen in een hoek van 45 graden, zodat het vanaf de zijkant naar beneden kan vallen, en ga dan naar de tweede stop van de pipet om de vloeistof volledig te verdrijven. Gebruik folie heat seals, sluit de platen gedurende vijf seconden af op 180 graden Celsius.

Plaats de verzegelde plaat in de thermocycler en stel de PCR-voorwaarden voor NHEJ-afgifterichtlijnen in door de initiële denaturatie gedurende 10 minuten op 95 graden Celsius in te stellen. Stel vervolgens 40 cycli van 94 graden celsius gedurende 30 seconden in om te denatureren, 55 graden celsius van één minuut om te gloeien en 60 graden celsius gedurende twee minuten om uit te breiden. Na 40 cycli zet je de hold op 98 graden celsius gedurende 10 minuten en de laatste hold op vier graden celsius.

Gebruik een hellingssnelheid van twee graden celsius per seconde voor alle stappen. De gloeitemperatuur zal variëren, afhankelijk van de gebruikte sondes of primer. Plaats de plaat stevig in de druppellezer met de A1 goed gelabeld linksboven.

Open het programma en stel de plaat in door FAM aan te wijzen als het bekende referentiekanaal en HEX als het onbekende kanaal voor elke put. Wijzig vervolgens de naam voor elk voorbeeld. Voer het druppelleesexperiment uit als directe kwantificering terwijl u de sjabloon opslaat.

Wijs de juiste experimentele parameters aan voor software-analyse, namelijk voorbeeldinformatie, supermix, doelnaam, doeltype, signaalkanaal één en kanaal twee. Stel vervolgens de drempel voor het aantal druppels in boven 10.000 voor betrouwbare resultaten. Controleer vervolgens het aantal druppels voor elke put in het druppeltabblad en zorg ervoor dat ze allemaal boven de 10.000 zijn.

Controleer ten slotte de 1D-amplitude voor een efficiënte signaalscheiding van negatieven. Markeer in de plaateditor de hele plaat en stel het experimenttype in op drop-off. Stel het WT-doel in als referentie en geef kanaal één aan voor FAM en kanaal twee voor HEX.

Stel het NHEJ-doel in als onbekend en wijs kanaal één aan voor FAM en kanaal twee als geen. Stel op het tabblad 2D-amplitude de clusterdrempels in met de grafiekgereedschappen voor elk monster. De staart wordt normaal gesproken geassocieerd met het WT-cluster voor NHEJ-assays.

Klik onder het tabblad Verhouding op het tandwielpictogram in de rechterbovenhoek van de grafiek en selecteer de fractionele abundantie om een punt uit te zetten dat overeenkomt met het percentage NHEJ-gebeurtenissen. 15 verschillende getrokken monsters van 10 muggen bevatten elk verschillende NHEJ-allelen, werden geanalyseerd en geïdentificeerd met behulp van de drop-off-test en de resultaten toonden aan dat alle 15 monsters 100% Indel-allelen droegen. In een ander experiment werden 11 getrokken monsters van wilde muggen en NHEJ-muggen met verschillende NHEJ-percentages onderzocht met dit ddPCR-protocol.

De resultaten toonden aan dat het geïdentificeerde percentage relatief dicht bij de indeldetectie door ampliconanalysetechniek lag. Pipetteer langzaam om bubbels te voorkomen en laat alle geëmulgeerde druppels langs de wand van de putten druppelen.