Name: Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer een protocol voor de dissectie van EDL- en soleusspieren bij ratten voor immunofluorescentie en morfometrische analyse van neuromusculaire knooppunten. Deze methode maakt gedetailleerde visualisatie van synaptische structuren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Veel dank aan CSIC en PEDECIBA voor de financiële steun die aan dit werk is verleend; aan Natalia Rosano voor haar manuscriptcorrecties; aan Marcelo Casacuberta die de video maakt en aan Nicolás Bolatto voor het lenen van zijn stem ervoor.

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de nationale wet nr. 18611 voor de verzorging van dieren die voor experimentele doeleinden worden gebruikt. Het protocol werd goedgekeurd door het Institutioneel Ethisch Comité (CEUA IIBCE, Protocolnummer 004/09/2015).
1. Spierdissectie (Dag 1)
OPMERKING: Maak voor aanvang 40 ml 0,5% paraformaldehyde (PFA), pH 7,4 in dulbecco's fosfaatoplossing (DPBS). Maak optioneel 20 ml van 4% PFA. Bereid 5 ml aliquots en vries in bij -20 °C. Ontdooi op de dag van dissectie een aliquot van 4% en voeg 35 ml DPBS toe om 40 ml 0,5% PFA te verkrijgen.
<ol><li>
Isolatie van EDL (fast-twitch spier)
	<ol>
<li>Euthanaseer een rat. Plaats het dier met de buik naar boven gericht. Maak een eerste incisie met behulp van een chirurgisch mes tussen de tenen naar de achterpoot. OPMERKING: In dit geval werd een intraperitoneale injectie van 90:10 mg/Kg ketamine:xylazine gegeven om de rat te euthanaseren, maar andere anesthesiemogelijkheden zijn ook toegestaan.</li>
		<li>Pel de huid af en trek deze naar boven totdat de rattenknie wordt blootgesteld.</li>
		<li>Om de EDL te vinden, volgt u de voetpezen tot aan het ringvormige ligament. Dit ligament omcirkelt twee pezen. Knip het ligament tussen de twee pezen met eenbandige schaar (of iets dergelijks). Identificeer de EDL-pees door beide op te tillen en kies degene die de tenen naar boven laat bewegen.</li>
		<li>Snijd de pees met een uniband schaar. Begin vervolgens, terwijl u de pees vasthoudt met een fijn biologisch pincet, langzaam de EDL-spier te scheiden van de tibialis-anterieure, de peroneus brevis en peroneus longus40 (zie figuur 1A). OPMERKING: Zorg ervoor dat de spier zonder schade wordt gescheiden. Doe dit door de rest van de laterale spieren door te snijden om een pad tussen hen te openen (de EDL heeft geen oppervlakkige locatie) terwijl u de EDL-spier vasthoudt en optilt.</li>
		<li>Om de spier volledig te isoleren, snijdt u de pees die aan de rattenknie is bevestigd met eenbandschaar.</li>
		<li>Dompel de ontlede spier onder in 5 ml 0,5% PFA en laat 24 uur bij 4 °C staan. Niet eventueel de spier in een stuk karton en draai deze met de spier naar beneden. Dompel het vervolgens volledig onder in 8 ml van de fixatieve oplossing. Deze stap helpt bij het behouden van de spier langwerpig tijdens het fixatieproces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolatie van soleus (slow-twitch spier)
	<ol>
<li>Draai het dier om (de buik is nu naar beneden gericht). Snijd door de huid de calcaneale pees met behulp van een chirurgisch mes.</li>
		<li>Met behulp van het biologische pincet en de unibandschaar scheidt u de gastrocnemiusspier van de botten, waardoor een "gespierd deksel" ontstaat. De soleus zal zich aan de binnenkant van het spierdeksel zijn. Het kan worden geïdentificeerd omdat het rood van kleur is en een platte morfologie heeft.</li>
		<li>Bereik en til met een biologisch pincet de soleuspees die boven de gastrocnemius ligt (zie figuur 1B).</li>
		<li>Snijd de pees met een uniband schaar. Til de hele spier op terwijl u enkele van de zwakke aanhechtingspunten (d.w.z. neurovasculaire elementen) snijdt. Ten slotte, om de soleusspier volledig te bevrijden, snijdt u de soleus fascicle die de calcaneale pees vormt met een uniband schaar.</li>
		<li>Herhaal stap 1.1.6 om ontlede soleusspier te repareren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Geplaagde vezelbereiding (Dag 2)
<ol><li>Spoel na 24 uur fixatie de spieren met 6 ml DPBS-oplossing 3x gedurende elk 10 minuten voordat u de spiervezels isoleert.</li>
	<li>Om de vezels te isoleren, zet je een spier op een microscoopschuif. Houd met behulp van een stereomicroscoop voorzichtig een van de pezen vast met één biologisch pincet. Begin vervolgens met het andere biologische pincet de pees langzaam te knijpen om de spiervezels te scheiden. Trek daarna het geknepen weefsel langzaam omhoog naar de tegenoverliggende spierpees. Het zal nodig zijn om deze actie meerdere keren te herhalen totdat meerdere kleine, geïsoleerde bundels worden verkregen.</li>
	<li>Plaats ze voorzichtig op een voorbehandelde glijbaan (verzand). Het is noodzakelijk om alle vezels op orde te houden, zodat ze elkaar niet overlappen. Op dit punt, lucht-droog de vezels voor 24 uur.</li>
</ol>3. Immunofluorescentie
<ol><li>
Primaire antilichaam incubatie (Dag 3) OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. De meest efficiënte manier om de verschillende oplossingen te verwijderen zonder vezels van de dia los te maken, is door een insulinespuit te gebruiken.<ol>
<li>Om het immunostainingproces te starten, omringt u de gedroogde geïsoleerde spiervezels met een pappen om een waterdichte barrière te creëren.</li>
		<li>Om de spiervezels te hydrateren, voegt u 200 μL gedestilleerd water toe gedurende 5 minuten en verandert u het water vervolgens in 200 μL DPBS voor de volgende incubatie van 5 minuten. Begin op dit punt met het labelen van immunofluorescentie.</li>
		<li>Incubeer vezels met 300 μL van een blokkeerbuffer (BB) met 50 mM glycine, 1% BSA en 1% Triton X-100 gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Vervang BB door het primaire antilichaam in een door de fabrikant voorgestelde concentratie. Gebruik de BB om het antilichaam te verdunnen. Dit experiment gebruikte 400 μL SMI 32 of SMI 31 die niet-gefosforyleerde (Nf) of gefosforyleerde (Fos-Nf) neurofilament H bij 1/800 verdunning herkenden om de NMJ presynaptische component te detecteren. OPMERKING: Wanneer u besluit het hele presynaptische element te herkennen in plaats van neurofilamentfosforylatie te evalueren, kiest u antilichamen tegen synapsine, synaptofysine of SV2a die eerder met succes werden gebruikt.</li>
		<li>Incubeer de vezels met de primaire antilichaamverdunning bij 4 °C 's nachts (optioneel kan incubatie worden uitgevoerd bij 37 °C gedurende 1 uur). In beide gevallen is het belangrijk om de incubatie uit te voeren met behulp van een vochtige kamer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunofluorescentie: Secundaire antilichaam incubatie (Dag 4)
	<ol>
<li>Verwijder het primaire antilichaam en spoel de vezels 3x gedurende 10 minuten elk met 500 μL DPBS en de laatste keer met BB.</li>
		<li>Verwijder deze laatste wasbeurt en voeg het fluorescerend gelabelde secundaire antilichaam verdund in BB toe. Voor dit experiment werd 500 μL geitenantimuis Alexa Fluor 488 gebruikt bij 1/1000 verdunning in BB. Om het postsynaptische element van de NMJ's te bekijken, werd 1:300 α-Bungarotoxine (Btx) biotine-XX geconjugeerd toegevoegd aan de secundaire antilichaamverdunning. OPMERKING: De toevoeging van Btx-biotine XX maakt betere signaal-ruisbeelden mogelijk zodra deze zijn gedetecteerd met streptavidine die het signaal versterkt. Bovendien verhoogde streptavidinevervoeging met verschillende fluoroforen kleurcombinaties in co-labeling-assays. Als alternatief maakt btx met fluorescerend label het verkrijgen van afbeeldingen van vergelijkbare kwaliteit mogelijk.</li>
		<li>Incubeer het secundaire antilichaam en de Btx gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 1 uur bij 37 °C beschermd tegen licht.</li>
		<li>Verwijder het secundaire antilichaam en de Btx. Was 3x gedurende 10 minuten elk met 500 μL DPBS en de laatste spoeling met BB.</li>
		<li>Incubeer met 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 bij 1/1000 verdunning met BB gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voeg op dit punt, indien gewenst, een sonde toe om de kernen tegen te gaan, zoals diaminophenylindole bij een uiteindelijke concentratie van 1 μg/ml.</li>
		<li>Verwijder de incubatieoplossing en was vezels 3x gedurende 10 minuten elk met 500 μL DPBS. Monteer vervolgens de vezels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage
	<ol>
<li>Plaats 4 stippen transparante nagellak op de microscoopschuif alsof het de hoekpunten van een vierkant zijn. Laat ze 1-2 min drogen. Dit zijn de punten waar de coverslips zullen rusten, waardoor weefselverplettering wordt voorkomen.</li>
		<li>Verwijder de laatste DPBS-was en voeg voldoende montagemedia (~ 200 μL) toe om de vezels te bedekken; vermijd uitdroging. OPMERKING: Gebruik Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glycerol in een 4:1 (v:v) om 10 ml van de montagemediamix te bereiden.</li>
		<li>Gebruik een pipetpunt van 200 μL om de montagemedia voorzichtig over de vezels te verspreiden om een volledige onderdompeling van alle vezels te garanderen. Verwijder luchtbellen voordat u het afdekglas plaatst.</li>
		<li>Plaats de afdeklip op de monsters om het ontstaan van luchtbellen te voorkomen. Deze beweging kan worden gedaan met behulp van een tang.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microscopie en morfometrische analyse
<ol><li>Beeld de geplaagde vezelpreparaten met behulp van laser confocale microscopie.</li>
	<li>Neem een reeks optische secties (30 μm Z-stapels) over de hele synaps met behulp van een interval van één micrometer. Gebruik het Btx-signaal om de stapel in te stellen. Afbeelding ten minste 15-20 NMJ's voor elke spieraandoening met een resolutie van 2048 px x 2048 px. Deze methode is gekozen om beelden te verkrijgen met voldoende optische kwaliteit en resolutie voor de morfometrische analyse.</li>
	<li>Gebruik de projectiebeelden van stapels met analysesoftware om de metingen uit te voeren. OPMERKING: Hoewel de uitgelegde morfometrische analyse handmatig werd uitgevoerd, zijn er twee recent ontwikkelde image J-gebaseerde tools voor het bestuderen van veel verschillende aspecten van pre- en postsynaptische NMJ-morfologie33,34.</li>
	<li>Als u de totale NMJ-gebiedswaarden wilt verkrijgen, selecteert u de buitenrand (buitencontour van het bevlekte gebied, zie figuur 2)van de eindplaat met behulp van het gereedschap Photoshop Magnetic lasso en bepaalt u het aantal geselecteerde pixels in het histogramvenster. Vervolgens kunnen de pixelgebieden worden geconverteerd naar vierkante micrometers met behulp van de schaal die is opgegeven door de confocale software.</li>
	<li>Selecteer met hetzelfde lassogereedschap de binnenrand (contouren van het bevlekte gebied binnen de eindplaat, zie figuur 2)en bepaal het niet-bevlekte gebied in de hele structuur (of leeg gebied) zoals hierboven beschreven (stap 4.4.). De waarden van het postsynaptische gebied worden verkregen nadat het totale oppervlak is afgetrokken van het lege gebied van elke NMJ.</li>
	<li>Verkrijg het Presynaptische gebied, dat wordt gedefinieerd als het gebied met anti-neurofilament immunofluorescentie, op een vergelijkbare manier als het totale NMJ-gebied. OPMERKING: Al deze parameters zijn gebruikt om de Post-Synaptic Density index (Postsynaptic Area/Total Area) en de NMJ Coverage (Presynaptic Area/Postsynaptic Area) te bepalen. Een hogere Postsynaptische dichtheidsindex impliceert een dichtere - of compactere - eindplaat, terwijl een kleinere NMJ-dekking een veel slechtere interactie tussen zenuwterminal en eindplaat weerspiegelt (beide compatibel met een denervatieproces). In het hier getoonde geval werden, aangezien gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde vormen van neurofilamenten werden gedetecteerd op zenuwterminalniveau, de fosforylated/non-phosphorylated presynaptic signal ratio en de phosphorylated/non-phosphorylated coverage ratio berekend.</li>
</ol>

<ol><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+Glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).</li>
<li>Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+efficacy+and+synaptic+depression+by+glial+cells+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 21, 847-855 (1998).</li>
<li>Cappello, V., Francolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+Junction+Dismantling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).</li>
<li>Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+decreased+activity+elicits+specific+morphological+adaptations+of+the+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).</li>
<li>Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habitual+exercise+enhances+neuromuscular+transmission+efficacy+of+rat+soleus+muscle+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ.</a> Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).</li>
<li>Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+influences+adaptations+of+the+neuromuscular+junction+to+endurance+training%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training.</a> Neuroscience. 190, 56-66 (2011).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Arnold, A. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+remodeling+of+the+neuromuscular+junction+by+skeletal+muscle+PGC-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α.</a> Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).</li>
<li>Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+presynaptic+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+repeatedly+observed+in+living+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice.</a> Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).</li>
<li>Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+early+morphological+changes+at+denervated+and+paralyzed+endplates+in+fast+and+slow+muscles+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse.</a> Brain Research. 248, 382-386 (1982).</li>
<li>Rosenheimer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+stress+and+exercise+on+age+related+changes+in+end-plates+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture.</a> Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).</li>
<li>Andonian, M. H., Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+endurance+exercise+on+the+morphology+of+mouse+neuromuscular+junctions+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing.</a> Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).</li>
<li>Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+nerve+terminal+morphologic+plasticity+induced+by+small+changes+in+the+locomotor+activity+of+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat.</a> Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).</li>
<li>Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exercise+training+of+different+intensities+on+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology.</a> Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).</li>
<li>Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exercise+in+maintaining+the+integrity+of+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).</li>
<li>Andonian, M. H., Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+alters+the+morphology+of+fast-+and+slow-twitch+rat+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction.</a> International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).</li>
<li>Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+modulates+neuromuscular+junction+of+C57BL%5C6N+in+ageing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice.</a> Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).</li>
<li>Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+physical+training+on+morphology+of+motor+nerve+terminals+in+rat+extensor+digitorum+longus+and+soleus+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles.</a> Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).</li>
<li>Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+training+increases+acetylcholine+receptor+quantity+at+neuromuscular+junctions+of+adult+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle.</a> Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).</li>
<li>Deschenes, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+resistance+training+on+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology.</a> Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).</li>
<li>Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+Junction+as+an+Entity+of+Nerve-Muscle+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication.</a> Cells. 8 (8), 906-921 (2019).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis-A+model+of+corticofugal+axonal+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread.</a> Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+Evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man.</a> Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+as+a+distal+axonopathy%3A+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).</li>
<li>Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type+classifications%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type classifications.</a> Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+variability+is+greater+at+developing+than+mature+mouse+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions.</a> Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), 160240(2016).</li>
<li>Waerhaug, O., Lømo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+causing+different+properties+at+neuromuscular+junctions+in+fast+and+slow+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles.</a> Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).</li>
<li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+postsynaptic+folds+to+the+safety+factor+for+neuromuscular+transmission+in+rat+fast-+and+slow-twitch+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles.</a> Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).</li>
<li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-Analyser%3A+high-throughput+morphological+screening+of+neuromuscular+junctions+identifies+subtle+changes+in+mouse+neuromuscular+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levator+auris+longus+preparation+for+examination+of+mammalian+neuromuscular+transmission+under+voltage+clamp+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57482(2018).</li>
<li>Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+adult+mouse+muscle-nerve+preparation+for+studying+the+firing+properties+of+muscle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51948(2014).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4460(2013).</li>
<li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51162(2014).</li>
<li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+are+rich+in+non-phosphorylated+neurofilaments%3A+cross-species+comparison+and+alterations+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+and+development+of+compartmentalized+innervation+in+rat+extensor+digitorum+longus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle.</a> Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).</li>
<li>Cipriani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+a+mouse+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease+type+4C%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072(2018).</li>
<li>Boido, M., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junctions+as+key+contributors+and+therapeutic+targets+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).</li>
<li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor de dissectie van twee skeletspieren van ratten (een langzame twitch en de andere fast-twitch), vezelspierisolatie en immunofluorescentiedetectie van pre- en postsynaptische markers om NMJ-veranderingen en assemblage- / demontageprocessen kwantitatief te beoordelen. Dit soort protocol kan nuttig zijn in knaagdiermodellen41,42 om NMJ te evalueren tijdens fysiologische of pathologische processen zoals hie...

De zoogdier neuromusculaire verbinding (NMJ) is een grote cholinerge tripartiete synaps bestaande uit de motor neuron zenuw einde, de postsynaptische membraan op de skelet spiervezel, en de terminale Schwann cellen1,2,3. Deze synaps vertoont een hoge morfologische en functionele plasticiteit4,5,6,7,8,zelfs tijdens de volwassenheid wanneer NMJ's dynamische structurele wijzigingen kunnen ondergaan. Sommige onderzoekers hebben bijvoorbeeld aangetoond dat motorische zenuwuiteinden voortdurend van vorm veranderen op de micrometerschaal9. Er is ook gemeld dat de morfologie van de NMJ reageert op functionele vereisten, gewijzigd gebruik, veroudering, oefening of variaties in motorische activiteit4,10,11,12,13,14,15. Training en gebrek aan gebruik vertegenwoordigen dus essentiële stimulansen om bepaalde kenmerken van de NMJ te wijzigen, zoals de grootte, lengte, dispersie van synaptische blaasjes en receptoren, evenals zenuwterminalvertakking14,16,17,18,19,20.
Bovendien is aangetoond dat elke structurele verandering of degeneratie van deze vitale verbinding kan leiden tot motorneuronceldood en spieratrofie21. Er wordt ook gedacht dat veranderde communicatie tussen zenuwen en spieren verantwoordelijk kan zijn voor de fysiologische leeftijdsgebonden NMJ-veranderingen en mogelijk voor de vernietiging ervan in pathologische toestanden. Neuromusculaire junction ontmanteling speelt een cruciale rol bij het begin van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), een neurodegeneratieve ziekte die een van de beste voorbeelden is van verminderd spier-zenuwspel3. Ondanks de talrijke studies uitgevoerd op motorneurondisfunctie, wordt nog steeds gediscussieerd of de verslechtering waargenomen in ALS optreedt als gevolg van de directe schade in het motorneuron en zich vervolgens uitstrekt tot de cortico-spinale projecties22; of als het moet worden beschouwd als een distale axonoopathie waarbij degeneratie begint in de zenuwuiteinden en vordert naar het motorneuron somas23,24. Gezien de complexiteit van ALS-pathologie is het logisch om te overwegen dat er een mix van onafhankelijke processen plaatsvindt. Aangezien NMJ de centrale speler is van het fysiopathologische samenspel tussen spier en zenuw, vertegenwoordigt de destabilisatie ervan een cruciaal punt in de oorsprong van de ziekte dat relevant is om te worden geanalyseerd.
Het neuromusculaire systeem van zoogdieren is functioneel georganiseerd in discrete motorische eenheden, bestaande uit een motorneuron en de spiervezels die uitsluitend door de zenuwterminal worden geinvat. Elke motorunit heeft vezels met vergelijkbare of identieke structurele en functionele eigenschappen25. Motorneuron selectieve rekrutering maakt het mogelijk om de spierrespons op functionele eisen te optimaliseren. Nu is het duidelijk dat skeletspieren van zoogdieren uit vier verschillende vezeltypen bestaan. Sommige spieren worden genoemd volgens de kenmerken van hun meest voorkomende vezeltype. Bijvoorbeeld, de soleus (een achterste spier van de achterste ledemaat betrokken bij het behoud van de lichaamshouding) draagt een meerderheid van slow-twitch eenheden (type 1) en wordt herkend als een langzame spier. In plaats daarvan bestaat extensor digitorum longus (EDL) in wezen uit eenheden met vergelijkbare fast-twitch-eigenschappen (type 2-vezels) en staat bekend als een snelle spier die gespecialiseerd is in phasische bewegingen die nodig zijn voor voortbeweging. Met andere woorden, hoewel volwassen spieren plastic van aard zijn vanwege de hormonale en neurale invloeden, bepaalt de vezelsamenstelling het vermogen om verschillende activiteiten uit te voeren, zoals te zien is in soleus dat continue activiteit met lage intensiteit ervaart en EDL die een snellere enkele twitch vertoont. Andere kenmerken die variabel zijn tussen verschillende soorten spiervezels zijn gerelateerd aan hun structuur (mitochondriale inhoud, uitbreiding van sarcoplasmatisch reticulum, dikte van de Z-lijn), myosine ATPase-gehalte en myosine zware kettingsamenstelling26,27,28,29.
Voor knaagdier NMJ's zijn er significante verschillen tussen spieren28,29. Morfometrische analyses uitgevoerd in soleus en EDL van ratten toonden een positieve correlatie aan tussen het synaptische gebied en de vezeldiameter (d.w.z. het synaptische gebied in soleus langzame vezels is groter dan in EDL snelle vezels), maar de verhouding tussen NMJ-gebied en vezelgrootte is vergelijkbaar in beide spieren30,31. Ook, met betrekking tot de zenuwterminals, waren de eindplaat absolute gebieden in type 1 vezels lager dan in type 2 vezels, terwijl de normalisatie door vezeldiameter gebieden van zenuwterminals in type 1 vezels de grootste32maakte.
Er zijn echter maar weinig studies gericht op morfometrische analyse om het bewijs van veranderingen in sommige NMJ-componenten33,34 aante tonen . Vanwege de relevantie van de NMJ in de functie van het organisme, waarvan de morfologie en fysiologie in verschillende pathologieën worden gewijzigd, is het dus belangrijk om dissectieprotocollen van verschillende soorten spieren te optimaliseren met voldoende kwaliteit om de visualisatie van de hele NMJ-structuur mogelijk te maken. Het is ook noodzakelijk het optreden van pre - of postsynaptische veranderingen in verschillende experimentele situaties of omstandigheden zoals veroudering of oefening35,36,37,38te evalueren . Bovendien kan het nuttig zijn om subtielere veranderingen in NMJ-componenten te bewijzen, zoals veranderde neurofilamentfosforylatie in de terminale zenuwuiteinden zoals gerapporteerd in ALS39.

```html
<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope met koel lichtverlichting</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Roterende platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekglazen (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Premium (Plus) microscoopglazen</td><td>PORLAB</td><td>PC-201-16</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>F.S.T</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Uniband LA-4C Schaar 125mm</td><td>E.M.S</td><td>77910-26</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp chirurgische mesjes #10</td><td>Sakira Medical</td><td>1567</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp steriele spuit (1 ml)</td><td>Sakira Medical</td><td>1569</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen</td><td>E.M.S</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;l of 200 &mu;l pipette</td><td>Finnpipette</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800 - AiryScan</td><td></td></tr><tr><td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H ratten</td><td>Taconic</td><td>2148-M</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Amresco</td><td>167</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Gepuurd anti-Neurofilament H (NF-H), gefosforyleerd Antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Voorheen Covance # SMI 31P</td></tr><tr><td>Gepuurd anti-Neurofilament H (NF-H), niet-gefosforyleerd Antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>801701</td><td>Voorheen Covance # SMI-32P</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-Muis IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxine, biotin-XX-conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>B1196</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine, Alexa Fluor 555-conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>S32355</td><td></td></tr><tr><td>Diaminofenylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td></td></tr></tbody></table>
```

dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

De neuromusculaire verbinding (NMJ) is een gespecialiseerd contactpunt tussen de motorische zenuw en de skeletspier. Deze perifere synaps vertoont een hoge morfologische en functionele plasticiteit. Bij tal van aandoeningen van het zenuwstelsel is NMJ een vroeg pathologisch doelwit dat resulteert in neurotransmissiefalen, zwakte, atrofie en zelfs in spiervezeldood. Vanwege de relevantie ervan kan de mogelijkheid om bepaalde aspecten van de relatie tussen NMJ-componenten kwantitatief te beoordelen, helpen om de processen in verband met de assemblage / demontage ervan te begrijpen. Het eerste obstakel bij het werken met spieren is om de technische expertise op te doen om snel te identificeren en te ontleden zonder hun vezels te beschadigen. De tweede uitdaging is om hoogwaardige detectiemethoden te gebruiken om NMJ-beelden te verkrijgen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve analyses uit te voeren. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol voor het ontleden van extensor digitorum longus en soleus spieren van ratten. Het verklaart ook het gebruik van immunofluorescentie om pre- en postsynaptische elementen van nmj's met hele montering te visualiseren. Verkregen resultaten tonen aan dat deze techniek kan worden gebruikt om de microscopische anatomie van de synapsis vast te stellen en subtiele veranderingen in de status van sommige van zijn componenten onder fysiologische of pathologische omstandigheden te identificeren.

Dit protocol biedt een eenvoudige methode om spiervezels van twee verschillende soorten spieren te isoleren en te immunostaineren (snelle en langzame spieren, zie figuur 1). Met behulp van de juiste markers en / of sondes kunnen NMJ-componenten worden gedetecteerd en geëvalueerd vanuit een kwantitatief oogpunt om enkele van de morfologische veranderingen te beoordelen die kunnen optreden als gevolg van ziekteprogressie of een specifieke medicamenteuze behandeling. In deze studie werden presy...

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire verbindingen met hele montering. Deze video toont een protocol om EDL- en soleusspieren effectief en veilig te ontleden met een herhaalbare aanpak. Deze video leert ook hoe je neuromusculaire verbindingen met een hele montering kunt verkrijgen met als doel synaptische componenten met 3D-integriteit te herkennen om een nauwkeurige morfometrische analyse mogelijk te maken.Om de spieren te ontleden, zijn deze chirurgische instrumenten nodig. Om de procedure te starten, plaatst u het dier met de buik naar boven gericht. Maak een eerste incisie met behulp van een chirurgisch mes tussen de tenen naar de achterpoten.Pel de huid af en trek omhoog totdat de rechterknie wordt blootgesteld. Om de EDL te vinden, volgt u de voetpezen naar het ringvormige ligament. Dit ligament omcirkelt twee pezen.Knip het ligament door met de Uniband schaar tussen de twee pezen. Identificeer de EDL-pees door beide op te tillen en te zien welke de tenen naar boven laat bewegen. Snijd de pees met een schaar.Terwijl u de pees vasthoudt met een biologisch pincet, begint u de EDL-spier langzaam te scheiden van de andere spieren van de achterpoten. Scheiding van de spier zonder schade te veroorzaken kan worden gedaan door verschillende sneden te maken op de rest van de laterale spieren om een pad tussen hen te openen, terwijl de spier wordt vastgehouden en opgetild van het splijtende gedeelte van de EDL-pees. Om de spier volledig te isoleren, snijdt u de pees die aan de rattenknie is bevestigd met een Uniband-schaar.Dompel de ontleedde spier onder in de fixatieve oplossing en laat deze 24 uur bij vier graden Celsius staan. Over het algemeen is het nuttig om een langwerpige spier te hebben. Gebruik hiervoor karton en nietjes om de spier te bevestigen voor fixatie.Om de soleusspier te isoleren, draait u het dier om. Snijd door de huid de calcaneale pees met behulp van een chirurgisch mes. Met behulp van het biologische pincet en de Uniband-schaar scheidt u de gastrocnemiusspier van de botten, waardoor een gespierd deksel ontstaat.De soleus zal zich aan de binnenkant van het spierdeksel zijn. Het kan worden geïdentificeerd omdat het rood en plat is. Met een biologisch pincet bereik en til je de soleuspees op die boven de gastrocnemius ligt.Knip de pees door met een Uniband schaar. Til de hele spier op terwijl u enkele van de zwakke aanhechtingspunten snijdt. Snijd ten slotte, om de soleusspier volledig te bevrijden, het soleusblaasje dat de calcaneale pees vormt.Herhaal de fixatiestap zoals gedaan met de EDL-spier. Om deze methode te gebruiken, is het belangrijk om de nietjes aan de pezen te beveiligen en niet aan de spier. Zodra de 24-uursperiode van fixatie is verstreken, spoelt u de spieren in DPBS-oplossing voordat u begint met het isoleren van de spiervezels.Om de vezels te isoleren, houdt u voorzichtig een van de pezen vast met één biologisch pincet. Begin dan met het andere biologische pincet langzaam de pees te knijpen om de spiervezels te scheiden. Om de vezels te isoleren, trekt u langzaam omhoog naar de tegenoverliggende spierpees.Het zal nodig zijn om deze actie meerdere keren te herhalen totdat u meerdere, kleine, geïsoleerde bundels krijgt. Eenmaal gescheiden in kleine geïsoleerde bundels, plaatst u ze voorzichtig in een voorbehandelde verzande glijbaan. Het is noodzakelijk om alle vezels ordelijk te houden, zodat ze elkaar niet overlappen.Op dit punt kunnen de vezels 24 uur aan de lucht worden gedroogd. Na 24 uur begint u met de immunostaining. Om een waterdichte barrière te creëren, gebruikt u een PAP-pen om de geïsoleerde spiervezels in de voorbehandelde dia te omringen.Dit is een voorbeeld van een confocale afbeelding met hoge resolutie die kan worden verkregen volgens het hier beschreven protocol. Linksboven wordt het post-synaptische element weergegeven en rechtsboven het presypenticumelement, terwijl de onderste afbeeldingen de synaptische componenten schematisch weergeven om de parameters te illustreren die zullen worden gebruikt voor morfometrische analyse. De tweede dia toont het samenvoegen van de pre- en post-synaptische signalen met de kernvlek van de API.Verschillen tussen de neuromusculaire verbindingen van transgene dieren en niet-transgene dieren zijn duidelijk zichtbaar. De morfometrische analyse van neuromusculaire verbindingen toont bewijs van het post-synaptische signaal bij transgene dieren en lijkt compacter te zijn, voornamelijk als gevolg van een verminderd totaal oppervlak van neuromusculaire verbindingen. Zoals hier getoond, wordt het neuromusculaire knooppunt pre-synaptisch gebied van het transgene dier verminderd.De kleinste gedetecteerde was degene die werd gevonden met een antifosforylated neurofilament signaal, zoals bijvoorbeeld te zien is in afbeelding B. De laatste afbeelding toont de resultaten met betrekking tot de status van neuromusculaire verbindingen met hele monturen. Met behulp van de dekkingsindex werd vastgesteld dat de transgene neuromusculaire verbindingen gedeeltelijk gedenervateerd werden gevonden.Het kan ook bepalen dat de dekking en nexus van het gefosforyleerde neurofilament lager is dan verkregen wanneer een niet-gefosforyleerd neurofilament wordt gedetecteerd. Het voorgestelde protocol maakt het mogelijk om hoogwaardige neuromusculaire junctionpreparaten te verkrijgen van langzame en snelle spiervezels. Pre- en postsyn synaptische neuromusculaire verbindingscomponenten werden geïdentificeerd door specifieke sondes of antilichamen en vervolgens afgebeeld in confocale of superresolutie confocale microscopie, waardoor morfometrische analyse op micrometrische schaal mogelijk werd.

dissection-single-skeletal-muscle-fibers-for-immunofluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

Visualiseren individuele cellen in dicht opeengepakte weefsels, zoals terminal Schwann-cellen (SC) op neuromusculaire verbindingen (NMS), is een uitdaging. "Sequential foto-bleken" laat de afbakening van een enkele terminal SC's, bijvoorbeeld in de triangularis sterni spier explantatie, een handige zenuw-spier voorbereid, indien sequentiële bleken kan worden gecombineerd met time-lapse imaging...

Sequential Photo-bleken om Single Schwann cellen afbakenen op de neuromusculaire junctie

Source: Marinello, M., et al. Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the preparation, immunostaining, and imaging of neuromuscular junctions in rat muscle tissue using confocal and super-resolution microscopy to visualize and analyze presynaptic and postsynaptic structures.

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

In deze video demonstreren we een protocol voor dissectie van de transversus abdominis spier van de muis en gebruiken we immunofluorescentie en microscopie om neuromusculaire verbindingen te visualiseren.

Dissectie van de Transversus Abdominis Spier voor Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

De neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gewijzigd in een verscheidenheid aan omstandigheden die soms kunnen resulteren in synaptische falen. Dit rapport beschrijft op fluorescentiemicroscoop gebaseerde methoden om dergelijke structurele veranderingen te kwantificeren.

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.

Minimaal invasieve spier insluiten (MIME) - een roman experimentele techniek ter vergemakkelijking van de Donor-cel-gemedieerde Myogenesis

Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.

Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

Het protocol toont een methode om ruimtelijke correlatie tussen de pre-synaptische terminals, post-synaptische receptoren en peri-synaptische Schwann-cellen in de mediale gastrocnemius-spier van de rat te onderzoeken met behulp van fluorescerende immunohistochemie met verschillende biomarkers, namelijk neurofilament 200, vesiculaire acetylcholinetransporter, alfa-bungarotoxine en S100.

Visualisatie van de morfologische kenmerken van neuromusculaire overgang in rat mediale gastrocnemiusspier

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.

Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen

Leer een protocol voor de dissectie van EDL- en soleusspieren bij ratten voor immunofluorescentie en morfometrische analyse van neuromusculaire knooppunten. Deze methode maakt gedetailleerde visualisatie van synaptische structuren mogelijk.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg (Video) | JoVE Journal

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Meer video's verkennen