Name: Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Leer dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie voor endocytische recycling in zoogdiercellen. Deze methode isoleert recycling-endosomen om eiwittransport te bestuderen en is toepasbaar op weefsel- en celmonsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Research Grants Council Hong Kong, CUHK direct grant scheme, United College endowment fund en de TUYF Charitable Trust. De cijfers in dit werk zijn aangepast van onze vorige publicatie, "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" gepubliceerd in het FASEB Journal in oktober 2020.

1. Celkweek en transfectie van zoogdieren
<ol><li>Plaat 2 x 106 cellen in een 100 mm kweekschaal. Gebruik vier gerechten voor elke transfectie. OPMERKING: Het aantal benodigde cellen kan variëren voor verschillende cellijnen. Optimalisatie kan nodig zijn voordat u doorgaat naar de isolatiestap.</li>
	<li>De volgende dag transfecteer de cellen met Lipofectamine volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>2. Celoogst
<ol><li>Gooi het kweekmedium 48 uur na de transfectie weg.</li>
	<li>Was de cellen tweemaal met ijskoude PBS (10 mM natriumfosfaten, 2,68 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride).</li>
	<li>Voeg 1 ml ijskoude PBS+ (PBS aangevuld met 0,5x proteaseremmercocktail en 0,5x fosfataseremmercocktail) toe aan elk gerecht.</li>
	<li>Verzamel de cellen met een celschraper en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 ml.</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugeren met behulp van een zwenkbakrotor op 400 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel voorzichtig in 5 ml homogenisatiebuffer (HB; 250 mM sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4, 1 mM EDTA aangevuld met 0,03 mM cycloheximide, 1x proteaseremmer cocktail en 1x fosfataseremmer cocktail).</li>
	<li>Verzamel de cellen door centrifugering bij 1.300 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Resuspend de celkorrel in 1 ml HB.</li>
	<li>Homogeniseer de cellen met een Dounce homogenisator voor 15-20 slagen. OPMERKING: Andere homogenisatiemethoden, bijvoorbeeld het passeren van het monster door een spuit, kunnen worden gebruikt. De homogenisatie-efficiëntie kon worden onthuld door het homogenaat te observeren onder een fasecontrastmicroscoop.</li>
	<li>Breng het homogenaat over in een centrifugeerbuis van 2 ml. OPMERKING: Oogst 50 μL homogenaat met 12,5 μL 5x monsterbuffer en label het als totaal lysaat.</li>
	<li>Voeg 0,7 ml HB toe aan het homogenaat.</li>
	<li>Spin het verdunde homogenaat gedurende 10 minuten bij 4 °C op 2.000 x g. OPMERKING: De pellet bevat kernen en ongebroken cellen.</li>
	<li>Verzamel 1,5 ml van het supernatant en herhaal stap 2.12 eenmaal.</li>
	<li>Verzamel 1,4 ml van het supernatant en label het als postnucleair supernatant (PNS).</li>
</ol>3. Voorbereiding van de dichtheidsgradiëntkolom
<ol><li>Breng 1,2 ml PNS over in een ultracentrifugebuis.</li>
	<li>Voeg 1 ml 62% sucrose-oplossing (2,351 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) toe aan het monster en meng goed door zachtjes te pipetteren. OPMERKING: De resulterende oplossing is een 40,6% sucrose-oplossing.</li>
	<li>Voeg 3,3 ml 35% sucrose-oplossing (1,177 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) voorzichtig toe aan het monster.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 2,2 ml 25% sucrose-oplossing (0,806 M sucrose, 3 mM imidazool bij pH 7,4) toe aan de 35% sucrose-oplossing. OPMERKING: De brekingsindex van de sucrose-oplossingen van 62%, 40,6%, 35% en 25% bij kamertemperatuur is respectievelijk 1,44, 1,40, 1,39 en 1,37. De brekingsindexen van de sacharoseoplossingen kunnen met een refractometer worden gecontroleerd om de precisie en consistentie van het experiment te waarborgen.</li>
	<li>Vul de ultracentrifugatiebuis met HB. OPMERKING: Bewaar de voorbereide kolom met dichtheidsgradiënt tijdelijk bij 4 °C.</li>
</ol>4. Fractionering en terugwinning van recycling endosoomhoudende fractie
<ol><li>Centrifugeer de kolom bij 210.000 x g gedurende 3 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel 12 fracties (elk 1 ml) zorgvuldig, te beginnen vanaf de bovenkant van de helling. OPMERKING: De recycling-endosomen moeten worden gevonden op het grensvlak tussen 35% en 25% sucrose-oplossingen. De verzamelde fracties kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C.</li>
	<li>Verdun alle fracties met 1 ml verdunningsbuffer (3 mM imidazool bij pH 7,4, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugeer het verdunde monster bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Zuig het supernatant op en voeg 50 μL 1x monsterbuffer toe om de fracties te oogsten.</li>
	<li>Analyseer het eiwitgehalte in de fracties door western blotting.</li>
</ol>

<ol><li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiener+Medizinische+Wochenschrift%22%5BJournal%5D)">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li>
<li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li>
<li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li>
<li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li>
<li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li>
<li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).</li>
<li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).</li>
<li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement%2C+cell+division+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li>
<li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).</li>
<li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li>
<li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils%3A+impact+on+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).</li>
<li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DOCK180%2FElmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li>
<li>Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWibo%2C+M+%22Eukaryotic+Cell+Function+and+Growth%3A+Regulation+by+Intracellular+Cyclic+Nucleotides%22">Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides</a>. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).</li>
<li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li>
<li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics%3A+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li>
<li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+of+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li>
<li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li>
<li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in%3A+fractionation+strategies+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li>
<li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li>
<li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li>
<li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+specialized%2C+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li>
<li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li>
<li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuimaraes+de+Araujo%2C+ME+%22Endocytic+Organelles%3A+Methods+For+Preparation+And+Analysis.+In+eLS%22">Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).</li>
<li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRickwood%2C+D+%22Centrifugation+Techniques%22">Centrifugation Techniques</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li>
<li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes%3A+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben met de inhoud van dit artikel.

Het bovenstaande protocol schetst de procedures voor het isoleren van recycling-endosomen uit gekweekte cellen door ultracentrifugatie. De betrouwbaarheid van deze methode is aangetoond door de laatste publicatie22, waaruit blijkt dat recycling-endosomen met succes worden geïsoleerd uit andere organellen (figuur 1), zoals het Golgi-apparaat en mitochondriën. Er moet aandacht worden besteed aan enkele kritische stappen voor het verkrijgen van een goed scheidingsresulta...

Endosomale handel is een essentieel fysiologisch proces dat verschillende biologische gebeurtenissenimpliceert 1, bijvoorbeeld het transport van signaalreceptoren, ionkanalen en adhesiemoleculen. Eiwitten gelokaliseerd bij het plasmamembraan worden geïnternaliseerd door endocytose2. De geïnternaliseerde eiwitten worden vervolgens gesorteerd op het vroege endosoom3. Sommige eiwitten zijn gericht op lysosomen voor afbraak4. Een aanzienlijke hoeveelheid eiwitten wordt echter teruggevoerd naar het celoppervlak door snelle recycling en langzame recyclingprocessen. Bij snelle recycling verlaten eiwitten de vroege endosomen en keren ze direct terug naar het plasmamembraan. Omgekeerd worden eiwitten bij langzame recycling eerst gesorteerd naar het endocytische recyclingcompartiment en vervolgens teruggevoerd naar het plasmamembraan. Verschillende ladingeiwitten, bijvoorbeeld clathrin, retromeercomplex, retrievercomplex en Wiskott-Aldrich-syndroomeiwit en SCAR Homologue (WASH) -complex, nemen deel aan dergelijke membraanrecyclingprocessen4,5,6,7,8,9. De balans van de endocytose en recyclinggebeurtenis is cruciaal voor celoverleving en draagt bij aan verschillende cellulaire gebeurtenissen10, bijvoorbeeld celadhesie, celmigratie, celpolariteit en signaaltransductie.
ARF6, een kleine GTPase, is een gerapporteerde regulator van endocytische handel7,11,12. Van belang, verschillende onderzoeksgroepen hebben het belang van ARF6 in endocytische recycling13,14,15,16,17geïllustreerd. De studie heeft tot doel de relatie tussen ARF6-gemedieerde neurietuitgroei en endocytische recycling te onderzoeken. Het vorige rapport suggereert dat de activering van ARF6 stroomopwaarts is naar Rac1-activiteit door in te werken op ELMO1-dedicator van cytokinese 1 (DOCK180) complex18. Hoe ARF6 ELMO1-DOCK180 gemedieerde Rac1-signalering activeert, blijft echter onduidelijk. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie werd gebruikt om de rol van ARF6-gemedieerde endocytische recycling in een dergelijk proces te onderzoeken. Door dat te gebruiken, werd de recycling endosoomhoudende fractie verkregen uit cellysaten19. De fractie werd onderworpen aan Western blotting voor analyse van het eiwitgehalte. De immunoblotresultaten toonden aan dat onder de aanwezigheid van FE65, een met de hersenen verrijkt adaptoreiwit, actieve ARF6 het niveau van ELMO1 in de recycling endosoombevattende fractie aanzienlijk verhoogde. Het volgende protocol omvat de procedures voor (1) transfectie van zoogdiercellen; (2) het voorbereiden van de monsters en de kolommen met dichtheidsgradiënt; en (3) het verkrijgen van de recyclingdosome-bevattende fractie.

<table><tbody><tr><td>1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>100 mm weefselkweekschaal</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13,2 mL, gecertificeerde vrijstaande Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x Sample Buffer</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-vrije Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Konijn mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850S</td><td>Konijn monoklonaal antilichaam voor het detecteren van COX IV.</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met lage glucose</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>ELMO1 antilichaam (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>Muis monoklonaal antilichaam voor het detecteren van ELMO1.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 antilichaam (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>Geit polyklonaal antilichaam voor het detecteren van FE65.</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum, onderzoekskwaliteit</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH monoklonaal antilichaam (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>Muis monoklonaal antilichaam voor het detecteren van GAPDH.</td></tr><tr><td>ImageLab Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Meting van bandintensiteit</td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfectie Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&beta;-COP antilichaam</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>Muis monoklonaal antilichaam voor het detecteren van &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) muis mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2276S</td><td>Muis monoklonaal antilichaam voor het detecteren van myc-getagde eiwitten.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, Dinatriumzout, Dihydraat</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>RAB11A-Specifiek polyklonaal antilichaam</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam voor het detecteren van Rab11.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%), fenolrood</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomale handel is een essentieel cellulair proces dat een breed scala aan biologische gebeurtenissen reguleert. Eiwitten worden geïnternaliseerd uit het plasmamembraan en vervolgens getransporteerd naar de vroege endosomen. De geïnternaliseerde eiwitten kunnen worden overgebracht naar het lysosoom voor afbraak of worden gerecycled naar het plasmamembraan. Een robuuste endocytische recyclingroute is nodig om de verwijdering van membraanmaterialen van endocytose in evenwicht te brengen. Van verschillende eiwitten wordt gemeld dat ze de route reguleren, waaronder ADP-ribosylatiefactor 6 (ARF6). Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie is een klassieke methode voor celfractionering. Na de centrifugatie worden organellen aan hun isopreienoppervlak gesedimenteerd. De fracties worden verzameld en gebruikt voor andere downstream toepassingen. Hier wordt een protocol beschreven om een recycling endosoombevattende fractie te verkrijgen uit getransfecteerde zoogdiercellen met behulp van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. De geïsoleerde fracties werden onderworpen aan standaard Western blotting voor het analyseren van hun eiwitgehalte. Door deze methode te gebruiken, identificeerden we dat de plasmamembraantargeting van engulfment en celmotiliteit 1 (ELMO1), een Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1) guanine nucleotide-uitwisselingsfactor, door ARF6-gemedieerde endocytische recycling is.

Na fractionering van de niet-getransfecteerde HEK293-cellen door middel van ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt, werden 12 fracties verzameld vanaf de bovenkant van de gradiënt. De geoogste fracties werden verdund met de verdunningsbuffer in een verhouding van 1:1 en onderworpen aan een tweede ronde van centrifugatie. De monsters werden vervolgens onderworpen aan western blotting voor het analyseren van hun eiwitgehalte. Zoals weergegeven in figuur 1,wordt de recycling endosoommarke...

Dit artikel heeft tot doel een protocol te presenteren voor het bereiden van recycling-endosomen uit zoogdiercellen met behulp van sucrose-dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.

Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dit protocol helpt bij het isoleren van de recycling-endosomen die fractie bevatten uit getransfecteerde zoogdiercellen om het onderzoek naar eiwithandel via endocytische handel te vergemakkelijken. Deze techniek is gemakkelijk te hanteren en toepasbaar op zowel weefsel- als celmonsters. De procedure wordt gedemonstreerd door Miss Zhai Yu Qi, een promovendus van Dr.Lao's Laboratory.Om te beginnen, plaat 2 keer 10 tot de 6 cellen in een 100 millimeter kweekschaal. Transfecteer de cellen de volgende dag met Lipofectamine volgens de instructies van de fabrikant. Om de cellen te oogsten, gooit u het kweekmedium 48 uur na transfectie weg en wast u de cellen tweemaal met ijskoude PBS.Voeg vervolgens een milliliter ijskoude PBS aangevuld met 0,5X proteaseremmer cocktail in 0,5X fosfataseremmer cocktail toe aan elk gerecht. Verzamel vervolgens met behulp van een celschraper de cellen en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. de cellen door centrifugeren met behulp van een zwenkbakrotor.Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel voorzichtig in vijf milliliter homogenisatiebuffer. Verzamel de cellen opnieuw door centrifugering en resuspend de celkorrel in één milliliter homogenisatiebuffer. Homogeniseer de cellen met een Dounce Homogenisator met 15 tot 20 slagen.Breng vervolgens het homogonaat over in een centrifugatiebuis van twee milliliter. Voeg 700 microliter homogenisatiebuffer toe aan het homogonaat. Draai vervolgens het verdunde homogonaat en verzamel 1,5 milliliter van het supernatant.Draai het verzamelde supernatant opnieuw, verzamel vervolgens 1,4 milliliter van het supernatant en label het als post-nucleair supernatant. Om de kolom met dichtheidsgradiënt voor te bereiden, brengt u 1,2 milliliter van het postnucleaire supernatant over naar een ultracentrifugebuis. Voeg vervolgens een milliliter 62% sucrose-oplossing toe aan het monster en meng goed door zachtjes te pipetteren.Voeg vervolgens voorzichtig 3,3 milliliter 35% sucrose-oplossing toe aan het monster, gevolgd door 2,2 milliliter 25% sucrose-oplossing bovenop de 35% sucrose-oplossing. Vul ten slotte de ultracentrifugebuis aan de bovenkant met homogenisatiebuffer. Centrifugeer de kolom met dichtheidsgradiënt en verzamel voorzichtig 12 fracties van elk 1 milliliter, te beginnen vanaf de bovenkant van de gradiënt.Verdun vervolgens alle fracties met één milliliter verdunningsbuffer en centrifugeer de verdunde monsters. Na het centrifugeren van het supernatant, aspirateer het en voeg 50 microliter 1X monsterbuffer toe om de fracties te oogsten. De recycling-endosoommarker Rab11 werd gedetecteerd in fractie zeven.Andere subcellulaire markers, waaronder beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 en Lamp1 werden ook onderzocht. Een positief EEA1-signaal werd ook gedetecteerd in fractie zeven. De gemeten bandintensiteiten van GAPDH, Cox IV en Rab11 in zowel Fractie zeven als het postnucleaire supernatant worden hier weergegeven.Na transecting HEC293-cellen met ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L of ELMO1 ARF6Q67L FE65 werden geen veranderingen gevonden in ELMO1-distributie met ARF6Q67L en FE65-overexpressie. Het ELMO1-niveau in fractie zeven werd vergeleken tussen verschillende transfecties en bleek verhoogd te zijn na cotransfectie van ARF6Q67L. Een verdere toename werd waargenomen wanneer zowel ARF6Q67L als FE65 gelijktijdig werden uitgedrukt.Omgekeerd verminderde het uitschakelen van FE65 de ARF6-gemedieerde Elmo1-verrijking in fractie zeven. De verkregen fractie kan worden gebruikt voor latere analyse. Bijvoorbeeld western blotting om veranderingen in het eiwitniveau in de fractie te visualiseren.

density-gradient-ultracentrifugation-for-investigating-endocytic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

In this video, we describe a simple and efficient protocol using gradient centrifugation to isolate single nuclei. Once isolated, these nuclei can be used for sequencing and genome analysis.

Gradient Centrifugation Based Purification of Nuclei: A Technique to Obtain Ultrapure Fraction of Intact Nuclei Using Density Gradient Centrifugation

This video demonstrates the density gradient ultracentrifugation-based purification method to isolate subpopulations of extracellular vesicles suitable for characterization studies.

Purification of Subpopulations of Extracellular Vesicles: A Technique to Purify Subpopulations of Extracellular Vesicles Using Density Gradient Ultracentrifugation

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van het plasmamembraan, cytoplasma en mitochondria van U937 cellen zonder het gebruik van high-speed centrifugeren. Deze techniek kan worden gebruikt voor het zuiveren van subcellular breuken voor latere onderzoek van eiwit lokalisatie via immunoblotting.

Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren

Dit fractioneringsprotocol stelt onderzoekers in staat om cytoplasmatische, nucleaire, mitochondriale en membraaneiwitten uit zoogdiercellen te isoleren. De laatste twee subcellulaire fracties worden verder gezuiverd via isopycnic dichtheidsgradiënt.

Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV's) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV's kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV's die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV's op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.

Isolatie en zuivering van bacteriële extracellulaire blaasjes uit menselijke uitwerpselen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

Het protocol beschrijft de isolatie van darmmicrobiële EV's uit zoutgevoelige ratten die HSD krijgen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. EV's werden gekenmerkt door het volgen van nanodeeltjes, TEM, LPS/BCA-assays en 16S rRNA-sequencing om de grootte, morfologie, samenstelling en oorsprong van de microbiota te analyseren.

Scheiding en differentiële karakterisering van microbiële extracellulaire blaasjes in de darm bij zoutgevoelige ratten onder zoutrijke dieetomstandigheden

Dit protocol beschrijft de isolatie en kwantificering van kleine RNA's met hoge dichtheidslipoproteïnen.

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

Leer dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie voor endocytische recycling in zoogdiercellen. Deze methode isoleert recycling-endosomen om eiwittransport te bestuderen en is toepasbaar op weefsel- en celmonsters.

Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

Meer video's verkennen