Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen
30 juni 2021
Dit artikel heeft tot doel een protocol te presenteren voor het bereiden van recycling-endosomen uit zoogdiercellen met behulp van sucrose-dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.
Dit protocol helpt bij het isoleren van de recycling-endosomen die fractie bevatten uit getransfecteerde zoogdiercellen om het onderzoek naar eiwithandel via endocytische handel te vergemakkelijken. Deze techniek is gemakkelijk te hanteren en toepasbaar op zowel weefsel- als celmonsters. De procedure wordt gedemonstreerd door Miss Zhai Yu Qi, een promovendus van Dr.Lao's Laboratory.
Om te beginnen, plaat 2 keer 10 tot de 6 cellen in een 100 millimeter kweekschaal. Transfecteer de cellen de volgende dag met Lipofectamine volgens de instructies van de fabrikant. Om de cellen te oogsten, gooit u het kweekmedium 48 uur na transfectie weg en wast u de cellen tweemaal met ijskoude PBS.
Voeg vervolgens een milliliter ijskoude PBS aangevuld met 0,5X proteaseremmer cocktail in 0,5X fosfataseremmer cocktail toe aan elk gerecht. Verzamel vervolgens met behulp van een celschraper de cellen en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. de cellen door centrifugeren met behulp van een zwenkbakrotor.
Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel voorzichtig in vijf milliliter homogenisatiebuffer. Verzamel de cellen opnieuw door centrifugering en resuspend de celkorrel in één milliliter homogenisatiebuffer. Homogeniseer de cellen met een Dounce Homogenisator met 15 tot 20 slagen.
Breng vervolgens het homogonaat over in een centrifugatiebuis van twee milliliter. Voeg 700 microliter homogenisatiebuffer toe aan het homogonaat. Draai vervolgens het verdunde homogonaat en verzamel 1,5 milliliter van het supernatant.
Draai het verzamelde supernatant opnieuw, verzamel vervolgens 1,4 milliliter van het supernatant en label het als post-nucleair supernatant. Om de kolom met dichtheidsgradiënt voor te bereiden, brengt u 1,2 milliliter van het postnucleaire supernatant over naar een ultracentrifugebuis. Voeg vervolgens een milliliter 62% sucrose-oplossing toe aan het monster en meng goed door zachtjes te pipetteren.
Voeg vervolgens voorzichtig 3,3 milliliter 35% sucrose-oplossing toe aan het monster, gevolgd door 2,2 milliliter 25% sucrose-oplossing bovenop de 35% sucrose-oplossing. Vul ten slotte de ultracentrifugebuis aan de bovenkant met homogenisatiebuffer. Centrifugeer de kolom met dichtheidsgradiënt en verzamel voorzichtig 12 fracties van elk 1 milliliter, te beginnen vanaf de bovenkant van de gradiënt.
Verdun vervolgens alle fracties met één milliliter verdunningsbuffer en centrifugeer de verdunde monsters. Na het centrifugeren van het supernatant, aspirateer het en voeg 50 microliter 1X monsterbuffer toe om de fracties te oogsten. De recycling-endosoommarker Rab11 werd gedetecteerd in fractie zeven.
Andere subcellulaire markers, waaronder beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 en Lamp1 werden ook onderzocht. Een positief EEA1-signaal werd ook gedetecteerd in fractie zeven. De gemeten bandintensiteiten van GAPDH, Cox IV en Rab11 in zowel Fractie zeven als het postnucleaire supernatant worden hier weergegeven.
Na transecting HEC293-cellen met ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L of ELMO1 ARF6Q67L FE65 werden geen veranderingen gevonden in ELMO1-distributie met ARF6Q67L en FE65-overexpressie. Het ELMO1-niveau in fractie zeven werd vergeleken tussen verschillende transfecties en bleek verhoogd te zijn na cotransfectie van ARF6Q67L. Een verdere toename werd waargenomen wanneer zowel ARF6Q67L als FE65 gelijktijdig werden uitgedrukt.
Omgekeerd verminderde het uitschakelen van FE65 de ARF6-gemedieerde Elmo1-verrijking in fractie zeven. De verkregen fractie kan worden gebruikt voor latere analyse. Bijvoorbeeld western blotting om veranderingen in het eiwitniveau in de fractie te visualiseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het prepareren van recycling-endosomen uit zoogdiercellen met behulp van sucrose-dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie. Deze techniek is ontworpen om het onderzoek naar proteintransport via endocytische routes te faciliteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Endocytose
- Proteintransport
Achtergrond
- Recycling-endosomen spelen een cruciale rol bij het cellulaire transport.
- Inzicht in eiwittransport is essentieel voor het begrijpen van diverse cellulaire processen.
- Ultracentrifugatie is een veelgebruikte techniek voor het isoleren van cellulaire componenten.
- Dit protocol is toepasbaar op zowel weefsel- als celmonsters.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het isoleren van recyclerende endosomen.
- Om het begrip van endocytische transportmechanismen te verbeteren.
- Om toekomstig onderzoek naar proteïnedynamiek binnen cellen te ondersteunen.
Gebruikte methoden
- Transfectie van zoogdiercellen met Lipofectamine.
- Oogsten van cellen 48 uur na transfectie.
- Wassen van cellen met ijskoud PBS.
- Gebruik van sucrose-dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie voor isolatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van recycle-endosomen uit getransfecteerde cellen.
- Demonstratie van het protocol door een PhD-student.
- Facilitering van verdere studies naar proteïntransport.
- Validatie van de toepasbaarheid van de methode op diverse monstertypes.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige aanpak voor het isoleren van recycle-endosomen.
- Het wordt verwacht dat dit zal bijdragen aan het begrip van proteintransport.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse biologische onderzoekcontexten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Het isoleren van recyclerende endosomen maakt mechanische risicoreductie van endocytische transportdoelen mogelijk door het leveren van kwantitatieve gegevens over subcellulaire fractionering. Dit ondersteunt de validatie van doelen en de ontwikkeling van assays voor eiwitten die de recycling van membraaneiwitten reguleren, zoals ARF6-effectoren. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door eiwitlokalisatie te koppelen aan functionele recyclingpaden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over regulatoren van endocytische recycling, zoals ARF6 en ELMO1.
- Operationele waarde: Levert fractioneringsgegevens om eiwittransportmechanismen die specifiek zijn voor bepaalde routes te verduidelijken.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het valideren van target-engagement in recycling-endosoomfracties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde fracties met recyclerende endosomen voor voor daaropvolgende Western blot-analyse.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare isolatie van organellen mogelijk voor kwantitatieve eiwitmeting.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de gereedheid van assays voor het screenen van verbindingen die endocytische recycling moduleren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt transportgegevens uit de ontdekkingsfase met preklinische modellen door isolatie van de Rab11-positieve fractie.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van subcellulaire fractionering tot functionele validatie in ziekterelevante systemen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door de lokalisatie van het target in recycling-routes te bevestigen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door subcellular fractionering uit te voeren, wat bijdraagt aan beslissingen over targetvalidatie en leadidentificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van regulatoren van endocytisch recyclen via fractionering en markeranalyse.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk door gestandaardiseerde isolatie van Rab11-positieve fracties voor eiwitkwantificering.
- Analytics: Genereert kwantitatieve Western blot-uitslagen van fracties om eiwitverrijking tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt fractioneringsgegevens met preklinische continuïteit door het valideren van de isolatie van recyclerende endosomen.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor subcellulaire fractionering over meerdere projecten voor targetvalidatie.
Operationele en bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in transportroutes te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van organelisolatie voor consistente downstream-analyse.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door subcellulaire lokalisatiegegevens te verschaffen voor targets in de recyclingroute.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van verrijkingsgegevens van recycling-endosomen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in celkweek, transfectie en ultracentrifugatietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot swinging bucket rotors en ultracentrifuges voor scheiding via dichtheidsgradiënten.
- Vereist standaardisatie van fractioneringsprotocollen tussen teams voor een vergelijkbare isolatie van Rab11-fracties.
- Vereist aanpassing van markerpanels (bijv. Rab11, EEA1) voor verschillende celtypen of transportroutes.
- Beperkt door de noodzaak van validatiemarkers om de zuiverheid van de fracties te bevestigen vóór downstream-toepassingen.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
