OnePot PURE Celvrij Systeem

Dit protocol voor een recombinant celvrij eiwitexpressiesysteem, algemeen bekend als het PURE-systeem, maakt gebruik van celkweek en celzuivering om de vereiste eiwitzuiveringen te stroomlijnen. Dit minimaliseert de tijd en arbeidsvereisten aanzienlijk. De OnePot-methode is niet alleen kosteneffectief gebleken, maar ook tijdbesparend.

Het verkort de voorbereidingstijden van enkele weken tot drie werkdagen. Dit maakt het PURE celvrije platform toegankelijk voor meer laboratoria wereldwijd en helpt bij de implementatie van dit echt krachtige platform voor synthetische celvrije biologie. Voordat je begint, moet je ervoor zorgen dat alle soorten hun respectievelijke eiwitten goed tot expressie komen.

Bereid om te beginnen de kolom voor op de OnePot-eiwitzuivering zoals beschreven in het tekstmanuscript met behulp van twee milliliter Sepharose-hars en laad de kolom vervolgens op met nikkelsulfaat. Bereid de starterculturen voor door 20 milliliter LB-media te combineren met 20 microliter ampicilline. Voeg 300 microliter van het medium toe aan 35 putjes van een steriele putplaat van 96 diep.

Ent elk van hen met zijn respectieve spanning, behalve de rekfactor thermo-instabiel of EFTU, en sluit de plaat af met een ademend membraan. Ent voor de EFTU-cultuur drie milliliter ampicilline met LB-media in een kweekbuis van 14 milliliter met een drukkap. Ongeveer drie milliliter EFTU-cultuur is voldoende voor één OnePot-expressiecultuur.

Incubeer het bij 37 graden Celsius terwijl je 's nachts met 260 rotaties per minuut schudt. Breng de volgende dag 500 milliliter LB-media en 500 microliter ampicilline over in de steriele verbijsterde kolf. Ent de OnePot PURE-cultuur met 1.675 microliter van de EFTU-cultuur en 55 microliter van elk van de culturen uit de diepe putplaat.

Incubeer de cultuur gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met een schudbeweging van 260 rotaties per minuut, of totdat de optische dichtheid van de cultuur 0,2 tot 0,3 bereikt. Induceer de cultuur met 500 microliter van 0,1 millimolaire IPTG en groei nog eens drie uur. Oogst de cellen door centrifugering bij vier graden Celsius en 3, 220 keer G gedurende 10 minuten en bewaar de celkorrel bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik.

Meet op dag drie de hoeveelheden buffers die nodig zijn voor hun zuivering en voeg TCEP toe aan alle buffers zoals aangegeven in de tekst. Bewaar de resterende buffers zonder TCEP bij vier graden Celsius voor toekomstige zuiveringen. Breng de geladen kolom in evenwicht met 30 milliliter buffer A.Nadat 25 milliliter buffer A is gepasseerd, sluit u de kolom vanaf de onderkant.

Ontdooi de cellen en gebruik een serologische pipet om de celkorrel in 7,5 milliliter buffer A.Lyse de cellen te resuspenderen met behulp van een 130 watt sonde. Als de ultrasoonapparaat succesvol is, wordt de oplossing donkerder. Zorg ervoor dat u de cellen op ijs houdt en plaats de sonde diep genoeg zonder de buis aan te raken.

Verwijder het celafval door centrifugering bij 21, 130 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en houd het lysaat op ijs. Voeg het supernatant toe aan de lichtzinnige kolom. Sluit de kolom vanaf de bovenkant en zorg ervoor dat er geen lekkage is.

Incubeer de kolom gedurende drie uur bij vier graden Celsius onder rotatie met behulp van een buisrotor. Eluteer ongebonden componenten uit de kolom en was met 25 milliliter buffer A.Was de kolom met 25 milliliter 25 millimolaire imidazoolbuffer. Eluteer de eiwitten met vijf milliliter van 450 millimolair imidazoolbuffer en houd de eluted eiwitten te allen tijde op ijs.

Verdun het eluaat met 25 milliliter HT-buffer en houd het mengsel op ijs. Voeg 15 milliliter toe aan een centrifugaalfilter van 15 milliliter en concentreer tot een volume van 1,5 milliliter. Voeg de resterende 15 milliliter toe aan het filter met de geconcentreerde oplossing en concentreer nogmaals tot 1,5 milliliter.

Voeg 10 milliliter HT-buffer toe aan het geconcentreerde monster en concentreer tot één milliliter. Herstel het geconcentreerde monster en voeg een gelijke hoeveelheid voorraadbuffer B toe en bewaar bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Herstel tijdens de bufferuitwisseling de kolom zoals opgegeven in de tekst.

Meet op dag vier de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Concentreer het monster met 0,5 milliliter van drie kilodalton cutoff centrifugaalfilter tot 20 milligram per milliliter. Controleer de OnePot PURE eiwitsamenstelling met behulp van SDS pagina.

Verdun 2,5 microliter van het monster met 7,5 microliter water gemengd met 10 microliter van twee X Laemmli-buffer en laad vervolgens vijf microliter en 2,5 microliter van de monsters op de gel. Voer de SDS-pagina uit zoals opgegeven in de tekst. Vul de concentratie en lengte van het DNA in de overeenkomstige gele cellen in de spreadsheet in met behulp van twee tot 10 nanomolair DNA voor de reactie.

Vul het gewenste totale reactievolume in microliter in. Haal de benodigde reagentia uit de vriezer en ontdooi ze op ijs. Pipetteer vervolgens de berekende hoeveelheden water, DNA en energieoplossing naar één kant van de PCR-buis of een hoek van een put op de 384-putplaat.

Pipetteer de berekende hoeveelheden eiwit en ribosoomoplossing naar de andere kant van een PCR-buis of de tegenoverliggende hoek van de 384-putplaat. Draai ongeveer 30 seconden om de reactiecomponenten samen te voegen. Om verdamping tijdens experimenten met plaatlezers te voorkomen, voegt u 35 microliter vloeibare was toe en sluit u de plaat af met een transparante kit.

Incubeer minimaal drie uur bij 37 graden Celsius. Voor uitlezing op een plaatlezer meet u elke twee minuten de bloeiintensiteit op de vereiste golflengte. Succesvolle overexpressie in alle individuele stammen die vervolgens worden gebruikt voor het OnePot-eiwitpreparaat wordt hier getoond.

De algemene samenstelling van de uiteindelijke OnePot PURE-eiwitoplossing werd geanalyseerd door de SDS-pagina. Het valt op dat EFTU in een hogere concentratie aanwezig is in vergelijking met de andere eiwitten, zoals verwacht. De syntheseopbrengsten van de OnePot-eiwitoplossing in combinatie met de His-tagged of niet-gelabelde ribosomen werden geanalyseerd door de eGFP-fluorescentie in de loop van de tijd te monitoren.

De expressieniveaus van drie verschillende eiwitten gelabeld met behulp van het groene lijst tRNA in vitro labeling systeem, of Kumasi kleuring, werden geanalyseerd op een SDS pagina gel. Voor een functioneel PURE-systeem is het absoluut van cruciaal belang dat alle stammen hun respectievelijke eiwitten goed tot expressie komen. Deze techniek vergemakkelijkt de implementatie van het PURE-systeem in biologische systeemtechnologie, waardoor de ontwikkeling van nieuwe genetische netwerken, moleculaire diagnostiek, therapeutica en educatieve kits mogelijk wordt.