Name: OnePot PURE Celvrij Systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer het OnePot PURE celvrije systeem voor snelle eiwitsynthese met behulp van Sepharose-hars en nikkelzuivering. Deze methode reduceert voorbereidingstijd van weken naar drie dagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de European Research Council in het kader van de Horizon 2020 Research and Innovation Program Grant 723106 van de Europese Unie, een Swiss National Science Foundation Grant (182019) en EPFL.

<ol><li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213(2020).</li>
<li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+systems%3A+a+proving+ground+for+rational+biodesign%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788(2020).</li>
<li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalizing+cell-free+systems%3A+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li>
<li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188(2021).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232(2014).</li>
<li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+%28PURE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Translation%22%5BJournal%5D)">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), Austin, Tex. 1327006(2017).</li>
<li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthethic+Biology%22%5BJournal%5D)">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li>
<li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li>
<li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), San Diego, Calif. 299-304 (2005).</li>
<li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li>
<li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PURE+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, Clifton, N.J. 11-21 (2010).</li>
<li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li>
<li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li>
<li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li>
<li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
<li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15(2009).</li>
<li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li>
<li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297(2009).</li>
<li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904(2020).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li>
<li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+partially+self-regenerating+synthetic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige, tijd- en kosteneffectieve methode om een veelzijdig PURE-expressiesysteem20 te bereiden op basis van de standaardsamenstelling15. Door gebruik te maken van het protocol samen met de bijgeleverde dagschema's(tabel 1),kunnen alle componenten in 1 week worden bereid en leveren ze hoeveelheden op die voldoende zijn voor maximaal vijfhonderd 10 μL PURE-reacties. Aangezien de eiwitten die in dit protocol worden gebruikt overexpressie hebben van plasmiden met een hoge kopie en een lage toxiciteit voor E. colihebben, worden goede expressieniveaus waargenomen voor alle vereiste eiwitten(figuur 1). Dit maakt de eenvoudige aanpassing van stammen, en dus ook eiwitsamenstelling in coculturen, mogelijk door simpelweg de verhoudingen van de inentingstammen te wijzigen20. Naast de ribosomale eiwitten bleek de concentratie EF-Tu van fundamenteel belang voor de expressieopbrengst6. Veranderingen in de concentratie van de andere eiwitcomponenten hadden daarentegen een relatief lage invloed op de robuustheid van het PURE-systeem7,24. Door de inentingsverhouding van EF-Tu aan te passen ten opzichte van alle andere componenten, kan daarom een vergelijkbare samenstelling als de standaard PURE-samenstelling worden bereikt en kan een PURE-systeem met een vergelijkbaar rendementvan 20 worden bereikt. Bij het bereiden van de eiwitoplossing is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle stammen goed groeien en het gecodeerde eiwit na inductie overexpressie(figuur 1).
Ribosoomfunctie is de sleutel tot de algehele prestaties van het PURE-systeem24. In dit protocol worden twee verschillende methoden voor het bereiden van de ribosoomoplossing gedemonstreerd, d.w.z. tag-free en His-tagged ribosoomzuivering. De tagvrije ribosoomzuivering is gebaseerd op hydrofobe interactiechromatografie gevolgd door centrifugering met een sucrosekussen, waarvoor toegang tot een FPLC-zuiveringssysteem en een ultracentrifuge15vereist is. Daarentegen vereist de methode met behulp van His-tagged ribosomen18 en zwaartekrachtstroomaffiniteitschromatografiezuivering geen gespecialiseerde apparatuur en kan deze in de meeste laboratoria worden uitgevoerd. Deze laatste methode brengt dus voordelen met zich mee zoals eenvoud en toegankelijkheid. We zagen echter een significant lagere syntheseopbrengst bij gebruik van de His-tagged ribosomen in de OnePot PURE in vergelijking met de tagvrije variant(figuur 3). Op basis van het type toepassing kan deze lagere opbrengst acceptabel zijn.
De energieoplossing biedt de componenten met een laag molecuulgewicht en tRNA's die nodig zijn om in vitro TX-TL-reacties van brandstof te voorzien. Dit protocol biedt een recept voor een typische energieoplossing, die eenvoudig kan worden aangepast op basis van de behoeften van de gebruiker. Samen met tRNA, NTP en creatinefosfaat zijn de overvloed en concentratie van Mg2+ ionen cruciaal geweest voor de algehele prestaties van het PURE-systeem8,omdat ze kritische cofactoren zijn voor transcriptie en translatie. In sommige gevallen kan de titratie van ionen daarom de algehele PURE-prestaties aanzienlijk verbeteren. DNA-integriteit is cruciaal voor PURE-prestaties. Dus, sequentie die het promotorgebied, de ribosoombindingsplaats en het doelgen verifieert en ervoor zorgt dat een adequate DNA-concentratie (<2 nM) zal helpen bij het oplossen van problemen die zich kunnen voordoen tijdens het opzetten van een PURE-reactie.
Het PURE-systeem is een minimaal TX-TL-systeem en specifieke toepassingen kunnen dus extra aanpassingen vereisen25. Deze kunnen het opnemen van verschillende RNA-polymerasen9,26,chaperones13en eiwitfactoren zoals EF-P of ArfA8omvatten. Hoewel de expressiestammen voor deze eiwitten in de coculturen kunnen worden opgenomen, kan het afzonderlijk toevoegen aan het voorbereide systeem een betere controle van de vereiste eiwitniveaus bieden. Bovendien is de opname van blaasjes essentieel voor de productie van membraaneiwitten10,11. Oxiderende in plaats van reducerende omgevingen en een disulfidebindingisomerase vergemakkelijken een goede vorming van disulfidebindingen, die bijvoorbeeld nodig zijn voor secretoire eiwitten12.
Het is essentieel om ervoor te zorgen dat eventuele extra componenten de reactie niet verstoren. De belangrijkste factoren om op te letten bij het opzetten van een reactie of het toevoegen van andere componenten staan hieronder vermeld. Zorg ervoor dat er geen incompatibele buffers worden gebruikt of dat de ionenconcentraties worden verstoord. Vermijd oplossingen die glycerol, hoge concentraties kalium, magnesium, calciumionen, osmolyten, pyrofosfaat, antibiotica of EDTA bevatten, zoveel mogelijk. Het vervangen van een elutiebuffer door water tijdens DNA-zuivering kan bijvoorbeeld nuttig zijn, omdat EDTA een veel voorkomend additief is in deze buffer. Het leveren van de oplossingen met extra negatief geladen moleculen zoals NTP of dNTP vereist aanpassing van de magnesiumconcentratie 8 , omdat de negatief geladenmoleculenzich gedragen als chelaatvormers en positief geladen moleculen binden. Een neutrale pH is ideaal voor de reactie. Dienovereenkomstig moeten alle componenten worden gebufferd tot de overeenkomstige pH; dit is vooral belangrijk voor zeer zure of basisch moleculen zoals NTP's. Ten slotte zijn temperatuur en volume belangrijke parameters voor de reactie. Om een goede opbrengst te bereiken, moet men een temperatuur rond 37 ° C implementeren, omdat temperaturen onder 34 ° C de opbrengst aanzienlijk zullen verminderen27.
Het is relevant op te merken dat voordat men de OnePot PURE voorbereidt, men rekening moet houden met de doeltoepassing en de bijbehorende vereisten, zoals volume, zuiverheid, gemak van wijziging en opname of weglating van componenten. Voor veel toepassingen zal het systeem een uitstekende keuze zijn, maar andere kunnen opbrengsten, aanpasbaarheid en andere factoren vereisen, die het OnePot-systeem niet kan bieden. Hoe dan ook, het geïntroduceerde protocol zal gunstig zijn voor de voorbereiding van elk zelfgemaakt systeem, omdat alle kritieke stappen voor een dergelijke voorbereiding hier worden samengevat.
Een van de belangrijkste voordelen van het OnePot-systeem is de compatibiliteit met het in de handel verkrijgbare PURExpress-systeem, dat de mogelijkheid biedt om de functionaliteit en integriteit van alle componenten afzonderlijk te testen door achtereenvolgens elke PURExpress-component te vervangen door zijn OnePot-equivalent. De voordelen van het OnePot PURE-systeem, zoals tonijnbaarheid en eenvoudige, snelle en kosteneffectieve bereiding, zullen celvrije TX-TL toegankelijk maken voor meer laboratoria over de hele wereld en bijdragen aan het uitbreiden van de implementatie van dit krachtige platform in celvrije synthetische biologie.

Celvrije transcriptie-translatie (TX-TL) systemen vormen een veelbelovend platform voor het onderzoeken en engineeren van biologische systemen. Ze bieden vereenvoudigde en afstembare reactieomstandigheden, omdat ze niet langer afhankelijk zijn van levensondersteunende processen, waaronder groei, homeostase of regulerende mechanismen1. Er wordt dus verwacht dat celvrije systemen zullen bijdragen aan het onderzoek van biomoleculaire systemen, een kader zullen bieden om rationele biodesignstrategieën te testen2, en een chassis zullen bieden voor een toekomstige synthetische cel3,4. Het volledig recombinante PURE-systeem biedt een bijzonder aantrekkelijk chassis vanwege de gedefinieerde en minimale samenstelling, evenals de instelbaarheid en afstembaarheid5.
Sinds het eerste functionele, volledig recombinante PURE-systeem in 2001 werd opgericht5,zijn er inspanningen geleverd om de systeemlimieten uit te breiden en de samenstelling van het systeem te optimaliseren om de systeemopbrengsten te verbeteren6,7,8,transcriptionele regulatie9,membraan 10, 11 en secretoire eiwitsynthese12,en om eiwitvouwing13,14 te vergemakkelijken . Tegenwoordig zijn er drie commercieel verkrijgbare systemen: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) en Magic PURE (Creative Biolabs). Die systemen zijn echter duur, hun exacte samenstelling is eigendom en dus onbekend, en het aanpassingsvermogen is beperkt.
PURE-systemen die in eigen huis zijn voorbereid, bleken de meest kosteneffectieve en afstembare optie15,16te zijn. De vereiste 37 zuiveringsstappen voor eiwit- en ribosoomfracties zijn echter tijdrovend en vervelend. Er zijn verschillende pogingen gedaan om de efficiëntie van de PURE-systeemvoorbereiding te verbeteren17,18,19. We hebben onlangs aangetoond dat het mogelijk is om alle benodigde niet-ribosomale eiwitten in het PURE-systeem te cocultureren en co-purificeren. Deze OnePot-methode is kosteneffectief en tijdsefficiënt gebleken, waardoor de voorbereidingstijd van enkele weken tot 3 werkdagen wordt teruggebracht. De aanpak genereert een PURE-systeem met een eiwitproductiecapaciteit die vergelijkbaar is met het in de handel verkrijgbare PURExpress-systeem20. In tegenstelling tot de vorige benaderingen om het PURE-preparaat te vereenvoudigen17,18,19, worden in de OnePot-benadering alle eiwitten nog steeds uitgedrukt in afzonderlijke stammen. Dit stelt de gebruiker in staat om de samenstelling van het OnePot PURE-systeem af te stemmen door alleen specifieke stammen weg te laten of toe te voegen of de inentingsvolumes aan te passen, waardoor respectievelijk uitval PURE-systemen worden gegenereerd of de uiteindelijke eiwitverhoudingen worden gewijzigd.
Het hier gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde methode voor het maken van het OnePot PURE-systeem zoals eerder beschreven20, hoewel β-mercaptoethanol werd vervangen door tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP). Bovendien worden twee methoden voor ribosoomzuivering beschreven: traditionele tag-vrije ribosoomzuivering met behulp van hydrofobe interactie en sucrosekussen, aangepast van Shimizu et al.15, en Ni-NTA ribosoomzuivering op basis van Wang et al.18 en Ederth et al.21, maar aanzienlijk gewijzigd. De laatste methode vergemakkelijkt de voorbereiding van het PURE-systeem verder en maakt het toegankelijk voor meer laboratoria, omdat alleen standaard laboratoriumapparatuur vereist is.
Het experimentele protocol vat de voorbereiding samen van een veelzijdig PURE-celvrij TX-TL-systeem om een eenvoudig, afstembaar, kosteneffectief celvrij platform te bieden, dat binnen een week kan worden voorbereid met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Naast de introductie van de standaard PURE-samenstelling, geven we aan hoe en waar deze kan worden aangepast, met een primaire focus op kritieke stappen in het protocol om de functionaliteit van het systeem te waarborgen.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>VWR International</td><td>525-0309</td><td></td></tr><tr><td>384-well Black Assay Plates</td><td>Corning</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>VWR International</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td><td>Nunc</td><td>260252</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur, 99,8 %</td><td>Acros</td><td>222140010</td><td></td></tr><tr><td>Äkta purifier</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>zuivering van tag-vrije ribosomen</td></tr><tr><td>AMICON ULTRA 0,5 mL - 3 KDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Aminozuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09718-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Condalab</td><td>6801</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td><td>ThermoFisher</td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy&nbsp;sealing membrane</td><td>Diversified Biotech</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes polycarbonate</td><td>Beckman</td><td>355631</td><td>zuivering van tag-vrije ribosomen</td></tr><tr><td>Chill-out Liquid Wax</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>CHO1411</td><td></td></tr><tr><td>Creatinefosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator-25 (Capped)</td><td>Zymo</td><td>ZYM-D4034-200TS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SantaCruz Biotech</td><td>sc-29089B</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac Chromatography Columns</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609-250G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td><td>VWR International / Eppendorf</td><td>525-0133</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td><td>Scilabware</td><td>9141173</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td><td>Promega</td><td>L5001</td><td>optioneel</td></tr><tr><td>Folinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1541</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Butyl HP Column</td><td>GE Healthcare</td><td>28411005</td><td>zuivering van tag-vrije ribosomen</td></tr><tr><td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0921-07</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21149.03</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3401-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Lysogenicum bouillon (LB) media</td><td>AppliChem</td><td>A0954</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0631</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Honeywell Fluka</td><td>63020-1L</td><td></td></tr><tr><td>Nikkelsulfaat</td><td>Alfa Aesar</td><td>15414469</td><td></td></tr><tr><td>NTP</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)</td><td>ThermoFisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumglutamaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td><td>NEB</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress&nbsp;&Delta;&nbsp;Ribosome Kit</td><td>NEB</td><td>E3313S</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td><td>ThermoFisher</td><td>564-0020</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA oplossing</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td></td></tr><tr><td>SealPlate&nbsp;film</td><td>Excel Scientific</td><td>Z369659-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6203</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)fosfin -hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547-10X1mL</td><td></td></tr><tr><td>Thickwall Polycarbonate Tube</td><td>Beckman</td><td>355631</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>ThermoFisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Optima L-80</td><td>Beckman</td><td></td><td>zuivering van tag-vrije ribosomen</td></tr><tr><td>Whatman GD/X syringe filters</td><td>GE Whatman</td><td>WHA68722504</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

onepot pure celvrij systeem

OnePot PURE Cell-Free System

Het gedefinieerde PURE (eiwitsynthese met behulp van recombinante elementen) transcriptie-translatiesysteem biedt een aantrekkelijk chassis voor celvrije synthetische biologie. Helaas zijn commercieel verkrijgbare systemen duur en is hun tonijnbaarheid beperkt. Ter vergelijking: een zelfgemaakte aanpak kan worden aangepast op basis van de behoeften van de gebruiker. De bereiding van zelfgemaakte systemen is echter tijdrovend en moeizaam vanwege de behoefte aan ribosomen en 36 middelgrote eiwitzuiveringen. Het stroomlijnen van eiwitzuivering door coculturing en co-zuivering zorgt voor het minimaliseren van tijd- en arbeidsvereisten. Hier presenteren we een eenvoudige, aanpasbare, tijd- en kosteneffectieve methode om alle PURE-systeemcomponenten binnen 1 week te produceren, met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Bovendien zijn de prestaties van de OnePot PURE vergelijkbaar met commercieel verkrijgbare systemen. De OnePot PURE bereidingsmethode breidt de toegankelijkheid van het PURE-systeem uit naar meer laboratoria vanwege de eenvoud en kosteneffectiviteit.

Het bovenstaande protocol is ontworpen om het opzetten van het PURE-celvrije TX-TL-systeem in elk laboratorium te vergemakkelijken. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de bereiding van de drie verschillende delen van het PURE-systeem: het OnePot-eiwit, ribosoom en energieoplossing. Een gedetailleerd dagschema, dat de workflow optimaliseert, wordt weergegeven in tabel 1. De workflow is geoptimaliseerd voor de zuivering van His-tagged ribosomen en tijdframes kunnen enigszins verschillen als tagvrije ribosoomzuivering wordt uitgevoerd. Eén preparaat levert een voldoende hoeveelheid PURE voor minimaal vijfhonderd reacties van 10 μL. Bovendien zijn de bereide oplossingen meer dan een jaar stabiel bij -80 °C en zijn ze bestand tegen meerdere vries-dooicycli.
Adequate overexpressieniveaus voor alle stammen zijn cruciaal voor de functionaliteit van de uiteindelijke eiwitoplossing. Figuur 1 toont een succesvolle overexpressie in alle 36 individuele stammen die vervolgens worden gebruikt voor het OnePot-eiwitpreparaat. Variatie in de bandintensiteiten van de over-uitgedrukte eiwitten trad hoogstwaarschijnlijk op als gevolg van een bias in het laden van volumes op de SDS-PAGE-gel. De verwachte eiwitgroottes zijn samengevat in tabel 2. GlyRS en PheRS bestaan uit twee subeenheden van verschillende molecuulgewichten; de overige 34 eiwitten bestaan uit één subeenheid. De sleutel tot de eenvoud en tijdseffectiviteit van dit protocol is de coculturing- en co-zuiveringsstap(figuur 2). De OnePot-eiwitoplossing werd bereid door de verhouding van de EF-Tu-stam ten opzichte van alle andere expressiestammen te verhogen. De totale samenstelling van de uiteindelijke eiwitten werd geanalyseerd door SDS-PAGE(figuur 3A). Uit de gels (lanes 2, 3) valt op dat EF-Tu (43,3 kDa) zoals verwacht in een hogere concentratie aanwezig is dan de andere eiwitten. Hoewel de gel een goede eerste indicatie geeft van eiwitexpressieverhoudingen, is het moeilijk om te bepalen of en op welk niveau elk individueel eiwit tot expressie is gebracht. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om de overexpressie in elke stam te bevestigen voordat u cocultureert, zoals hierboven weergegeven.
Het E. coli-ribosoom is een complexe moleculaire machine die bestaat uit meer dan 50 individuele eiwitsubeenheden23. Een representatief absorptiespectrum bij 260 nm voor tagvrije ribosoomzuivering is weergegeven in figuur 4; de derde piek is kenmerkend voor een succesvolle ribosoomelutie. Voor beide ribosoomzuiveringsmethoden werd het verwachte looppatroon op de SDS-PAGE-gel (figuur 3A)18 waargenomen. We hebben wel verontreinigingen waargenomen voor beide zuiveringen, zij het in kleine hoeveelheden (<10%). Met name waren verschillende verontreinigingen aanwezig in de tag-free (lanes 5, 6) en His-tagged (lanes 11, 12) ribosomen als gevolg van de variatie in de methode. Ter referentie van de gebruiker zijn de SDS-PAGE-gels voor de gecombineerde systemen ook inbegrepen (rijstroken 8, 9 en 14, 15).
Ten slotte worden de prestaties van de geprepareerde systemen (figuur 3) met behulp van de verschillende ribosoomvarianten vergeleken. De tijdsbanen van in vitro eGFP-expressie laten zien dat beide PURE-systemen functioneel zijn en fluorescerende eGFP produceren. De OnePot-eiwitoplossing in combinatie met de His-tagged ribosomen, met behulp van de ribosoomconcentratie geoptimaliseerd door titratie, leverde echter slechts een derde van het expressieniveau van de niet-gelabelde ribosoomversie op (figuur 3B). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen toen drie eiwitten van verschillende grootte werden uitgedrukt en gelabeld met behulp van het Green Lys tRNA in vitro labeling systeem(Figuur 3C). Zoals te zien is op de fluorescerende gel, werden producten over de volledige lengte met succes tot expressie gebracht in beide systemen; slechts ongeveer de helft van het expressieniveau werd echter bereikt met het His-tag ribosoomsysteem. Naast de fluorescentie-etikettering zijn de verwachte banden voor alle drie de eiwitten te onderscheiden op een Coomassie-gekleurde gel(figuur 3D). De resultaten tonen aan dat het geïntroduceerde expressiesysteem, dat binnen een week in een laboratorium met standaardapparatuur kan worden bereid, kan worden gebruikt voor de in vitro expressie van eiwitten die stroomafwaarts van de T7-promotor zijn gecodeerd uit lineaire sjablonen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Figuur 1: Representatieve resultaten voor de overexpressietest voor alle expressiespanningen van het PURE-systeem. Het aantal zuivere eiwitten en de grootte zijn samengevat in tabel 2. Eiwitnummers 21, 24 en 27 zijn gemarkeerd met een ster voor een betere visualisatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Figuur 2: OnePot eiwitzuivering. De schematische weergave en bijbehorende foto's van alle stappen die betrokken zijn bij de productie van de OnePot-eiwitoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Figuur 3: Prestaties van de bereide systemen met behulp van de verschillende ribosoomvarianten. (A) Coomassie blauw gekleurde SDS-PAGE-gels van de OnePot-eiwitoplossing (lanes 2, 3), tagvrije ribosomen zonder eiwitoplossing (lanes 5, 6) en met eiwitoplossing (lanes 8, 9), His-tagged ribosomen zonder eiwitoplossing (lanes 11, 12) en met eiwitoplossing (lanes 14, 15). Per monster werden twee verschillende concentraties geladen. (B) Vergelijking van eGFP-expressie van His-tagged ribosomen en tag-free ribosomen. De fluorescentie-intensiteit van in vitro eGFP-expressie wordt in de loop van de tijd gecontroleerd voor een PURE-reactie met behulp van tagvrije ribosomen (1,8 μM, blauw) en His-tagged ribosomen (0,62 μM, rood). De concentraties van de lineaire sjabloon en de OnePot-eiwitoplossing waren respectievelijk 4 nM en 2 mg / ml. Panelen (C) en (D) tonen de SDS-PAGE gel van eiwitten gesynthetiseerd in OnePot met tag-vrije (1,8 μM, blauw, lanes 3, 4, 5) en His-tag ribosomen (0,62 μM, rood, lanes 6, 7, 8) gelabeld met een GreenLys in vitro labeling kit (C) en gekleurd met Coomassie blauw (D), respectievelijk. De zwarte pijlen geven de verwachte banden van gesynthetiseerde eiwitten aan: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). De lineaire sjabloon- en OnePot-eiwitoplossingsconcentraties waren respectievelijk 4 nM en 1,6 mg / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Figuur 4: Absorptiespectra bij 260 nm. Representatieve resultaten van absorptiespectra bij 260 nm tijdens hydrofobe interactiezuivering van tagvrije ribosomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Een dagelijks tijdschema voor de bereiding van alle OnePot PURE-oplossingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: PURE eiwitlijst <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: Reagentia. De tabel geeft een overzicht van concentraties, volumes en andere specifieke details van de reagentia en componenten die tijdens dit onderzoek zijn gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: Buffers. De spreadsheet bevat de exacte buffersamenstellingen voor eiwit-, tag-vrije ribosoom- en His-tag ribosoomzuiveringen, evenals de concentraties van de stamoplossingen die worden gebruikt voor de bereiding ervan. Daarnaast berekent het de benodigde hoeveelheden componenten op basis van het buffervolume. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 3: Aminozuurberekeningen. De spreadsheet bevat de aminozuren en hun aanbevolen concentratie van stamoplossingen die nodig zijn voor de energieoplossing. Het berekent de hoeveelheid water die aan elk aminozuur moet worden toegevoegd op basis van de werkelijk gewogen massa en berekent ook het volume van de aminozuuroplossing die aan het uiteindelijke aminozuurmengsel moet worden toegevoegd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 4: Voorraadoplossingen voor de energieoplossing. De tabel geeft een overzicht van de concentraties en volumes van voorraadoplossingen die nodig zijn voor de energieoplossing en geeft verdere details aan, inclusief opslagomstandigheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 5: Energieoplossing. De tabel bevat de componenten van de energieoplossing en hun aanbevolen concentraties. Bovendien berekent het hun vereiste volumes die aan de uiteindelijke oplossing moeten worden toegevoegd op basis van hun voorraadoplossingsconcentraties en het volume van de energieoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 6: PCR. De tabel geeft sequenties en concentraties van de primers die worden gebruikt voor de extensie-PCR en geeft smelttemperaturen en thermocyclerstappen aan die zijn geoptimaliseerd voor een high-fidelity DNA-polymerase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 7: ZUIVERE reactie. De spreadsheet toont een voorbeeldopstelling van een PURE-reactie. Het vermeldt de gebruikte concentraties en volumes van de componenten voor een PURE-reactie met behulp van tag-vrije ribosomen of His-tag ribosomen. Bovendien berekent het de volumeverhoudingen voor eiwit- en ribosoomtitraties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

We presenteren een snelle en kosteneffectieve methode om het recombinante PURE celvrije TX-TL-systeem te produceren met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.

OnePot PURE Celvrij Systeem

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Dit protocol voor een recombinant celvrij eiwitexpressiesysteem, algemeen bekend als het PURE-systeem, maakt gebruik van celkweek en celzuivering om de vereiste eiwitzuiveringen te stroomlijnen. Dit minimaliseert de tijd en arbeidsvereisten aanzienlijk. De OnePot-methode is niet alleen kosteneffectief gebleken, maar ook tijdbesparend.Het verkort de voorbereidingstijden van enkele weken tot drie werkdagen. Dit maakt het PURE celvrije platform toegankelijk voor meer laboratoria wereldwijd en helpt bij de implementatie van dit echt krachtige platform voor synthetische celvrije biologie. Voordat je begint, moet je ervoor zorgen dat alle soorten hun respectievelijke eiwitten goed tot expressie komen.Bereid om te beginnen de kolom voor op de OnePot-eiwitzuivering zoals beschreven in het tekstmanuscript met behulp van twee milliliter Sepharose-hars en laad de kolom vervolgens op met nikkelsulfaat. Bereid de starterculturen voor door 20 milliliter LB-media te combineren met 20 microliter ampicilline. Voeg 300 microliter van het medium toe aan 35 putjes van een steriele putplaat van 96 diep.Ent elk van hen met zijn respectieve spanning, behalve de rekfactor thermo-instabiel of EFTU, en sluit de plaat af met een ademend membraan. Ent voor de EFTU-cultuur drie milliliter ampicilline met LB-media in een kweekbuis van 14 milliliter met een drukkap. Ongeveer drie milliliter EFTU-cultuur is voldoende voor één OnePot-expressiecultuur.Incubeer het bij 37 graden Celsius terwijl je 's nachts met 260 rotaties per minuut schudt. Breng de volgende dag 500 milliliter LB-media en 500 microliter ampicilline over in de steriele verbijsterde kolf. Ent de OnePot PURE-cultuur met 1.675 microliter van de EFTU-cultuur en 55 microliter van elk van de culturen uit de diepe putplaat.Incubeer de cultuur gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met een schudbeweging van 260 rotaties per minuut, of totdat de optische dichtheid van de cultuur 0,2 tot 0,3 bereikt. Induceer de cultuur met 500 microliter van 0,1 millimolaire IPTG en groei nog eens drie uur. Oogst de cellen door centrifugering bij vier graden Celsius en 3, 220 keer G gedurende 10 minuten en bewaar de celkorrel bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik.Meet op dag drie de hoeveelheden buffers die nodig zijn voor hun zuivering en voeg TCEP toe aan alle buffers zoals aangegeven in de tekst. Bewaar de resterende buffers zonder TCEP bij vier graden Celsius voor toekomstige zuiveringen. Breng de geladen kolom in evenwicht met 30 milliliter buffer A.Nadat 25 milliliter buffer A is gepasseerd, sluit u de kolom vanaf de onderkant.Ontdooi de cellen en gebruik een serologische pipet om de celkorrel in 7,5 milliliter buffer A.Lyse de cellen te resuspenderen met behulp van een 130 watt sonde. Als de ultrasoonapparaat succesvol is, wordt de oplossing donkerder. Zorg ervoor dat u de cellen op ijs houdt en plaats de sonde diep genoeg zonder de buis aan te raken.Verwijder het celafval door centrifugering bij 21, 130 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en houd het lysaat op ijs. Voeg het supernatant toe aan de lichtzinnige kolom. Sluit de kolom vanaf de bovenkant en zorg ervoor dat er geen lekkage is.Incubeer de kolom gedurende drie uur bij vier graden Celsius onder rotatie met behulp van een buisrotor. Eluteer ongebonden componenten uit de kolom en was met 25 milliliter buffer A.Was de kolom met 25 milliliter 25 millimolaire imidazoolbuffer. Eluteer de eiwitten met vijf milliliter van 450 millimolair imidazoolbuffer en houd de eluted eiwitten te allen tijde op ijs.Verdun het eluaat met 25 milliliter HT-buffer en houd het mengsel op ijs. Voeg 15 milliliter toe aan een centrifugaalfilter van 15 milliliter en concentreer tot een volume van 1,5 milliliter. Voeg de resterende 15 milliliter toe aan het filter met de geconcentreerde oplossing en concentreer nogmaals tot 1,5 milliliter.Voeg 10 milliliter HT-buffer toe aan het geconcentreerde monster en concentreer tot één milliliter. Herstel het geconcentreerde monster en voeg een gelijke hoeveelheid voorraadbuffer B toe en bewaar bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Herstel tijdens de bufferuitwisseling de kolom zoals opgegeven in de tekst.Meet op dag vier de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Concentreer het monster met 0,5 milliliter van drie kilodalton cutoff centrifugaalfilter tot 20 milligram per milliliter. Controleer de OnePot PURE eiwitsamenstelling met behulp van SDS pagina.Verdun 2,5 microliter van het monster met 7,5 microliter water gemengd met 10 microliter van twee X Laemmli-buffer en laad vervolgens vijf microliter en 2,5 microliter van de monsters op de gel. Voer de SDS-pagina uit zoals opgegeven in de tekst. Vul de concentratie en lengte van het DNA in de overeenkomstige gele cellen in de spreadsheet in met behulp van twee tot 10 nanomolair DNA voor de reactie.Vul het gewenste totale reactievolume in microliter in. Haal de benodigde reagentia uit de vriezer en ontdooi ze op ijs. Pipetteer vervolgens de berekende hoeveelheden water, DNA en energieoplossing naar één kant van de PCR-buis of een hoek van een put op de 384-putplaat.Pipetteer de berekende hoeveelheden eiwit en ribosoomoplossing naar de andere kant van een PCR-buis of de tegenoverliggende hoek van de 384-putplaat. Draai ongeveer 30 seconden om de reactiecomponenten samen te voegen. Om verdamping tijdens experimenten met plaatlezers te voorkomen, voegt u 35 microliter vloeibare was toe en sluit u de plaat af met een transparante kit.Incubeer minimaal drie uur bij 37 graden Celsius. Voor uitlezing op een plaatlezer meet u elke twee minuten de bloeiintensiteit op de vereiste golflengte. Succesvolle overexpressie in alle individuele stammen die vervolgens worden gebruikt voor het OnePot-eiwitpreparaat wordt hier getoond.De algemene samenstelling van de uiteindelijke OnePot PURE-eiwitoplossing werd geanalyseerd door de SDS-pagina. Het valt op dat EFTU in een hogere concentratie aanwezig is in vergelijking met de andere eiwitten, zoals verwacht. De syntheseopbrengsten van de OnePot-eiwitoplossing in combinatie met de His-tagged of niet-gelabelde ribosomen werden geanalyseerd door de eGFP-fluorescentie in de loop van de tijd te monitoren.De expressieniveaus van drie verschillende eiwitten gelabeld met behulp van het groene lijst tRNA in vitro labeling systeem, of Kumasi kleuring, werden geanalyseerd op een SDS pagina gel. Voor een functioneel PURE-systeem is het absoluut van cruciaal belang dat alle stammen hun respectievelijke eiwitten goed tot expressie komen. Deze techniek vergemakkelijkt de implementatie van het PURE-systeem in biologische systeemtechnologie, waardoor de ontwikkeling van nieuwe genetische netwerken, moleculaire diagnostiek, therapeutica en educatieve kits mogelijk wordt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Expressie van malaria eiwitten in cellen gebaseerde systemen blijft uitdagend. We tonen twee stappen en een stap IVT (in vitro translatie) celvrije expressiesystemen voor het uitdrukken van malaria rhoptry recombinante eiwitten uit HeLa-cellen. We maken gebruik van een Ni-gebaseerde hars affiniteit zuiveringssysteem de rhoptry eiwitten te zuiveren.

HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Eiwitten

Het doel van dit protocol is om pathogeen-specifieke klinische graad T-cellen te produceren met behulp van een tafelblad, geautomatiseerde, tweede generatie celverrijkingsapparaat dat een gesloten cytokine-opvangsysteem bevat en geen toegewijd personeel of gebruik van een GMP-faciliteit vereist. De gegenereerde cytomegalovirus pp65-specifieke T-cellen kunnen direct aan patiënten worden toegediend.

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

Dit protocol maakt de betrouwbare generatie en karakterisering van endotheliale cellen uit bloeduitgroei (BOEC's) mogelijk vanuit een klein volume volwassen perifeer bloed. BOEC's kunnen worden gebruikt als een surrogaat voor endotheelcellen van patiënten met vasculaire aandoeningen en als een substraat voor de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie en cultuur van Blood uitgroei endotheelcellen van de humane perifere bloed

De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC's) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.

Klinisch microfluïdisch chipplatform voor de isolatie van veelzijdige circulerende tumorcellen

Hier presenteren we een protocol om metabolieten in zeldzame celtypen nauwkeurig en betrouwbaar te meten. Technische verbeteringen, waaronder een gemodificeerde mantelvloeistof voor het sorteren van cellen en het genereren van relevante blanco monsters, maken een uitgebreide kwantificering van metabolieten mogelijk met een input van slechts 5000 cellen per monster.

Gerichte metabolomics op zeldzame primaire cellen

Extracellulaire blaasjes zijn veelbelovend voor biomedische toepassingen, maar de huidige isolatiemethoden zijn tijdrovend en onpraktisch voor klinisch gebruik. In deze studie presenteren we een microfluïdisch apparaat dat de directe isolatie van extracellulaire blaasjes uit grote hoeveelheden biovloeistoffen op een continue manier met minimale stappen mogelijk maakt.

Isolatie in één stap van extracellulaire blaasjes uit monsters met een groot volume met een gespleten A4F-microfluïdisch apparaat

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

Dit protocol beschrijft hoe het Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS-cel) kan worden gebruikt om microbiële monoklonale isolatie, teelt en pluk uit te voeren. De MISS-cel bereikt een geïntegreerde workflow op basis van microfluïdische druppeltechnologie, die een uitstekende monodispersie van druppels, hoge parallelle teelt en detectie van biomassa met hoge doorvoer biedt.

Geautomatiseerde en high-throughput microbiële monoklonale teelt en plukken met behulp van het eencellige Microliter-druppel Culture Omics-systeem

De therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes (EV's) heeft het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de behandeling van kanker en de afgifte van medicijnen. Chimere antigeenreceptor (CAR) cel-afgeleide EV's (CAR-EV's) geïsoleerd met behulp van ionenuitwisselingschromatografie vertonen een verhoogde laadcapaciteit, waardoor hun functionele werkzaamheid aanzienlijk wordt verbeterd. Deze studie karakteriseert CAR-EV's verder om hun biologische activiteit en therapeutisch...

Verbetering van chimere antigeenreceptor-extracellulaire blaasjes (CAR-EV) -technologie: de toekomst van kankertherapie

We presenteren een geactualiseerd protocol voor de productie van het OnePot 'Protein synthesis Using Recombinant Elements' (PURE)-systeem en ruwe ribosomen voor celvrije eiwitsynthese, met de nadruk op het beheersen van celgroei om batch-tot-batchvariaties te minimaliseren.

Verfijning van de productie van OnePot PURE en ruwe ribosomen voor reproduceerbare celvrije eiwitsynthese

Leer het OnePot PURE celvrije systeem voor snelle eiwitsynthese met behulp van Sepharose-hars en nikkelzuivering. Deze methode reduceert voorbereidingstijd van weken naar drie dagen.

OnePot PURE Celvrij Systeem

Meer video's verkennen