Name: Bereiding van pseudo-getypeerde H5-aviaire influenzavirussen met calciumfosfaattransfectiemethode en meting van antilichaamneutraliserende activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Leer de bereiding van H5-aviaire influenzapseudovirussen met calciumfosfaattransfectie en het meten van antilichaamneutraliserende activiteit. Dit protocol ondersteunt onderzoek naar vaccinontwikkeling en immuunresponsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de onderzoekssubsidies van het Innovation Capacity Building Project van de provincie Jiangsu (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (No. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (nr. 2020B1111340076) en het Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).

Alle pseudovirus-gerelateerde experimentele operaties werden uitgevoerd onder ABSL2-conditie in het Institut Pasteur van Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS). Dierproeven werden uitgevoerd op basis van door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde dierprotocollen van IPS, CAS.
1. Pseudovirusverpakking met calciumfosfaattransfectie
<ol><li>Maak eencellige suspensies van HEK293FT cellen (9 x 105 per ml) in volledig DMEM-medium (tabel 1). Voeg 10 ml van de eencellige suspensies toe aan een T75-kolf, incubeer de cellen in een 37 °C, 5% kooldioxide (CO2) incubator gedurende 20 uur vóór de transfectie. OPMERKING: HEK293FT lage doorgang (<20 passages) wordt aanbevolen. Zorg ervoor dat de cel monolaag voor 80-90% confluent is.</li>
	<li>Vervang het medium 2 uur voor de transfectie door 10 ml vers compleet medium dat chloroquine (100 μM) bevat.</li>
	<li>Meng de reagentia en het plasmide-DNA zoals weergegeven in tabel 2 en figuur 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2en 2x HEPES-buffer. Pipetteer 5 keer zachtjes op en neer, incubeer het mengsel bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Breng het mengsel over in het medium boven de cellen en wieg de kolf voorzichtig. Incubeer de cellen in de celincubator gedurende 15 uur.</li>
	<li>Vervang het medium door 15 ml vers compleet DMEM-medium. Incubeer de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 65 uur. OPMERKING: De kleur van het medium is lichtoranje of lichtgeel en ten minste 80% van de cel moet het cytopathische effect (CPE) onder de microscoop met omgekeerd licht vertonen.</li>
	<li>Oogst het supernatant en centrifugeer het gedurende 20 minuten bij 4 °C op 2095 x g . Verzamel het supernatant, aliquoteer het en bewaar het bij -80 °C.</li>
</ol>2. Detectie van de HA, NA en HIV-1 p24 eiwitexpressie van influenza pseudovirus
<ol><li>Detecteer de HA-eiwitexpressie door hemagglutinine (HA) -test.<ol><li>Voeg 50 μL PBS toe aan kolommen 2-12, rijen A, B en C van een 96-well round-bottom plaat. OPMERKING: Rij A, B en C behoren tot 3 onafhankelijke replicatietests en kolom 12 wordt gebruikt als de negatieve controle.</li>
		<li>Voeg 100 μL pseudovirus toe aan de putjes van kolom 1. Breng 50 μL over van kolom 1 naar kolom 2, meng goed door 5 keer op en neer te pipetteren, voer de tweevoudige verdunningen uit tot de laatste kolom 11 en gooi de extra 50 μL uit kolom 11 weg.</li>
		<li>Voeg 50 μL 0,5% erytrocyt toe aan elk putje, pipetteer het twee keer zachtjes op en neer. Incubeer de plaat gedurende 30-60 minuten bij RT of totdat de erytrocyten van de negatieve controle de regelmatige vlekken op de bodem van de put vormen.</li>
		<li>Observeer en registreer HA-titers van het pseudovirus. OPMERKING: HA-eenheid van de pseudovirussen is de hoogste verdunningsfactor van het virus die 100% hemagglutinatie van de rode bloedcellen kan veroorzaken.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecteer HA- en NA-eiwitexpressie door de western-blot-assay. OPMERKING: Alle western-blot stappen worden uitgevoerd volgens de handleiding van Moleculair klonen (4e editie).</li>
	<li>Detecteer de hiv-1 p24-eiwitexpressie met de hiv-1 p24 ELISA-kit (materiaaltabel).<ol><li>Voeg 50 μL van de lysisbuffer toe aan 450 μL pseudovirusmonster. Meng het grondig.</li>
		<li>Voeg 300 μL van de wasbuffer toe aan elk putje van de microplaat. Sla de plaat omgekeerd om de wasbuffer volledig te verwijderen. Herhaal de was 5 keer.</li>
		<li>Voeg 200 μL van de standaard en monsters toe aan elke put afzonderlijk. Incubeer ze bij 37 °C gedurende een nacht of gedurende 2 uur.</li>
		<li>Zuig de inhoud van de plaat aan en was de plaat zoals beschreven in stap 2.3.2. OPMERKING: Laat één putje van de testplaat leeg om als substraat leeg te gebruiken.</li>
		<li>Voeg 200 μL van de p24-detectorantistoffen toe aan elk putje. Incubeer ze bij 37 °C gedurende 1 uur. Zuig de plaat op en was deze zoals beschreven in stap 2.3.2.</li>
		<li>Voeg 100 μL van de streptavidin-peroxidase werkoplossing toe aan elk putje en incubeer ze bij 37 °C gedurende 30 minuten. Zuig de plaat op en was deze zoals beschreven in stap 2.3.2.</li>
		<li>Voeg 100 μL van de substate-werkoplossing toe aan elke put, inclusief de blancoput van het substraat, en incubeer ze bij 37 °C gedurende 30 minuten. OPMERKING: Blauwe kleur zal zich ontwikkelen in de putten.</li>
		<li>Voeg 100 μL van de stopbuffer toe aan elke put. OPMERKING: De blauwe kleur verandert onmiddellijk in geel.</li>
		<li>Lees de optische dichtheid bij 450 nm binnen 15 min. Noteer de p24-titers van het pseudovirus</li>
	</ol></li>
</ol>3. Pseudovirustitratie
<ol><li>Maak eencellige suspensies van MDCK-cellen (5 x 104 per ml) in volledig DMEM-medium, voeg 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 en 40000 cellen toe aan verschillende putten van een 96-well flat-bottom plaat. Incubeer de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 20 uur.</li>
	<li>Haal het pseudovirus uit de -80 °C koelkast, ontdooi het op het ijs en draai het pseudovirus vortex.</li>
	<li>Voeg 6 HAU (6x HA-eenheden) pseudovirussen toe aan elke put met een ronde bodemplaat van 96 en vul elke put aan met volledige DMEM tot 120 μL.</li>
	<li>Pipetteer het mengsel 5 keer op en neer om goed te mengen. Incubeer de mengselplaat gedurende 1 uur in een 37 °C, 5 % CO 2-incubator.</li>
	<li>Breng 100 μL van het mengsel over naar de cellen in de 96-putplaat. Plaats de celkweekplaat terug in de couveuse gedurende 48 uur, 60 uur en 72 uur na virusinfectie.</li>
	<li>Haal de plaat uit de couveuse en voer de luciferasetest (Table of Materials) uit.</li>
	<li>Verwijder het medium voorzichtig uit de putjes van de plaat. Spoel de cellen met 200 μL PBS en verwijder de PBS zoveel mogelijk. OPMERKING: Draai de plaat om en gooi het supernatant weg door het omgekeerd op absorberend papier te slaan. Als de testcellijn niet stevig aan de bodem kon worden bevestigd, verwijdert u de mediumaspiratie voorzichtig.</li>
	<li>Voeg 50 μL van de lysisbuffer toe aan elke put en rock de kweekplaat meerdere keren. Bewaar de plaat een nacht bij -80 °C. OPMERKING: Meng 1 volume 5x lysisbuffer met 4 volumes water om de 1x lysisbuffer te maken. Breng de 1x lysisbuffer voor gebruik in evenwicht met RT. Schommel de plaat om ervoor te zorgen dat de cellen volledig bedekt zijn met de lysisbuffer. Het enkele vries-dooiproces kan helpen de cel volledig te lyseren.</li>
	<li>Haal de plaat eruit, balanceer op RT gedurende 2 uur. OPMERKING: De cel moet volledig worden gelyseerd.</li>
	<li>Rock de plaat meerdere keren zachtjes en breng alle cellysaten over op ondoorzichtige 96-putplaten.</li>
	<li>Voeg 50 μL van het substraat toe aan elke put, schommel de plaat meerdere keren voorzichtig en meng substraat en lysisbuffer grondig.</li>
	<li>Meet het geproduceerde licht binnen 5 minuten met behulp van een luminometer. Noteer de luciferasetiters van het pseudovirus. OPMERKING: Wanneer een goed substraat wordt toegevoegd, wordt licht uitgezonden als bijproduct via een chemische reactie waarbij luciferine wordt omgezet in oxyluciferine door het luciferase-enzym. De hoeveelheid geproduceerd licht is evenredig met de hoeveelheid luciferase-enzym.</li>
</ol>4. Immuun sera preparaat
OPMERKING: Het immuunserum zal worden gebruikt voor celgerelateerde experimenten en de experimentele operatie moet worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.
<ol><li>Bereid 12 acht weken oude vrouwelijke BALB / c-muizen voor. Verdeel de muizen gelijkelijk in twee groepen. OPMERKING: De ene groep was de DDV-groep en de andere was de negatieve controlegroep.</li>
	<li>Immunisatie van de DDV-groep: Prime tweemaal intramusculair met 100 μg van een voor codon geoptimaliseerd DNA-plasmide dat codeert voor A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA-eiwit in week 0 en week 3 en boost eenmaal intraperitoneaal met 512 HAU TH-virusachtige deeltjes (VLP) in week 6.</li>
	<li>Immunisatie van de controlegroep: Prime tweemaal intramusculair met 100 μg leeg vectorplasmide-DNA in week 0 en week 3 en boost eenmaal intraperitoneaal met HIV-1 gag VLP in week 6.</li>
	<li>Verzamel het muizenbloed 2 weken na de laatste immunisatie. OPMERKING: Hier werden de muizen verdoofd met pentobarbitalnatrium (65 mg / kg) op het moment van bloedafname. Na bloedafname uit de submandibulaire ader werden de muizen onmiddellijk geëuthanaseerd met CO2.</li>
	<li>Houd het bloed op RT gedurende 2 uur, daarna 4 °C gedurende een nacht. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 900 x g bij 4 °C en verzamel het supernatant. Inactiveer de sera door deze gedurende 30 minuten op 56 °C te plaatsen.</li>
	<li>Bewaar de immuunsera in een koelkast van -80 °C voor gebruik. OPMERKING: Raadpleeg aanvullende figuur 1 voor het stroomdiagram dat de belangrijkste procedures voor muisimmunisatie beschrijft.</li>
</ol>5. Pseudovirus neutralisatie (PN) assay
<ol><li>Maak eencellige suspensies van MDCK-cellen (5 x 104 per ml) in volledig DMEM-medium en voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een 96-well platbodemplaat. Incubeer de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 20 uur.</li>
	<li>Haal het pseudovirus en de sera uit de koelkast van -80 °C, ontdooi het op het ijs en vortex grondig.</li>
	<li>Verdun de sera 20 keer in het volledige medium en voeg 100 μL volledig DMEM-medium toe aan de putjes van een 96-well round-bottom plaat uit kolommen 2-10.</li>
	<li>Voeg 200 μL van de verdunde sera toe aan de putjes van kolom 2, breng 100 μL over van kolom 2 naar kolom 3, verdun de sera als 1:20, 1:40, 1:80, enz., tot 1:10240 achtereenvolgens van kolom 2 naar kolom 10, en gooi de 100 μL uit kolom 10 weg.</li>
	<li>Voeg 100 μL DMEM compleet medium toe aan de putjes van kolom 11 als negatieve controle.</li>
	<li>Voeg 100 μL pseudovirussen toe aan elk putje, pipetteer het mengsel 5 keer grondig op en neer en incubeer de mengselplaat in een 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur.</li>
	<li>Breng 100 μL van het mengsel over van de 96-well round-bottom plaat naar de overeenkomstige put van de 96-well celkweekplaat. Plaats de plaat terug in de incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 60 uur.</li>
	<li>Haal de plaat uit de couveuse. Voer de luciferasetest uit zoals beschreven in stap 3.7-3.12.</li>
</ol>6. Pseudovirus attachment assay
<ol><li>Maak eencellige suspensies van MDCK-cellen (4 x 104 per ml) in volledig DMEM-medium en voeg 100 μL celsuspensies toe aan elke put in een 96-well platbodemplaat. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 uur.</li>
	<li>Incubeer het pseudovirus met sera in DMEM met 1% BSA bij 4 °C gedurende de nacht. OPMERKING: Het volume van het mengsel is 100 μL.</li>
	<li>Blokkeer de MDCK-cellen met 100 μL per putje DMEM met 1% BSA bij 4 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Ent het pseudovirus en het serummengsel (100 μL) op de MDCK-monolaag en incubeer deze gedurende 2 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Was de celplaat 4 keer met PBS met 1% BSA om elk ongebonden virus te verwijderen.</li>
	<li>Lyseer de cellen met 100 μL luciferase lysisbuffer bij RT gedurende 30 min.</li>
	<li>Kwantificeer de hoeveelheid gebonden virus op de cellen met een HIV-1 p24 ELISA-kit zoals hierboven beschreven (rubriek 2.3).</li>
</ol>7. Beoordeling van virale binnenkomst
<ol><li>Maak eencellige suspensies van MDCK-cellen (5 x 104 per ml) in volledig DMEM-medium en voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een 96-well platbodemplaat. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 uur vóór de test.</li>
	<li>Ent het pseudovirus (100 μL) op een MDCK-monolaag in een 96-wellige plaat bij 4 °C gedurende 6 uur.</li>
	<li>Was de celplaat 4 keer met PBS met 1% BSA om ongebonden pseudovirussen te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 100 μL van de serieel verdunde immuunsera of sera van schijnvaccinatiemuizen in DMEM met 1% BSA toe aan de monolaag en incubeer de cel bij 4 °C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Verwijder het celsupernatant en was de celkweekplaat 4 keer met PBS met 1% BSA.</li>
	<li>Voeg verse DMEM toe aan de cellen en incubeer gedurende 60 uur in een 37 °C, 5% CO 2-incubator.</li>
	<li>Meet de relatieve luciferase-activiteit (RLA) van de cellen zoals beschreven in stap 3.7-3.12. OPMERKING: Virale vermelding, zoals aangegeven door RLA, werd uitgedrukt als een percentage van de aflezing verkregen in afwezigheid van sera, die werd vastgesteld als 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li>
<li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854(2017).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963(2018).</li>
<li>Duvergé, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+lentiviral+vectors%3A+When+the+clothes+make+the+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311(2020).</li>
<li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza%3A+A+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li>
<li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+influenza+vaccines%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li>
<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li>
<li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li>
<li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMichael%2C+RG+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).</li>
<li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li>
<li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li>
<li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li>
<li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).</li>
<li>Luciferase assay system. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021).</li>
<li>Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

HEK293FT cellen worden meestal gebruikt als verpakkingscellen om pseudovirussen te produceren. Regelmatige mycoplasmadetectie is essentieel tijdens de celkweek. Mycoplasmabesmetting kan de pseudovirusopbrengsten drastisch verminderen en soms bijna nul. In vergelijking met andere verontreinigingen leiden mycoplasmabesmettingen niet tot veranderingen in de pH-waarde of troebelheid van het celkweekmedium. Zelfs een hoge concentratie mycoplasma is niet zichtbaar met het blote oog of onder een microscoop. Drie populaire metho...

Sinds 1996 veroorzaken A/gans/Guangdong/1/96-afstamming hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) H5-virussen voortdurende griepuitbraken bij pluimvee en wilde vogels, goed voor enorme sociaaleconomische verliezen in de wereldwijde pluimvee-industrie. Soms raken mensen er ook mee besmet, geconfronteerd met een hoog sterftecijfer 1,2. HPAI-virusonderzoek wordt echter vaak belemmerd, aangezien het niet buiten bioveiligheidsniveau 3-laboratoria kan worden behandeld. Om dit probleem aan te pakken, worden pseudovirussen gebruikt als alternatief voor wild-type virussen in sommige experimenten van H5 HPAI-studies. Pseudovirussen zijn veilig genoeg om te oefenen in bioveiligheidsniveau 2 laboratoria.
H5 HPAI pseudovirussen behoren tot chimere virussen bestaande uit surrogaatviruskernen, lipide-enveloppen met de oppervlakteglycoproteïnen van influenzavirussen en reportergenen. Pseudoviruskernen zijn meestal afgeleid van lentiviraal humaan immunodeficiëntievirus (HIV), retrovirussen zoals muizenleukemievirus (MLV) en vesiculair stomatitisvirus (VSV)3. In het bijzonder wordt het HIV-1-verpakkingssysteem veel gebruikt om influenza-pseudovirus te produceren, waarbij de primaire genen gag en pol zijn. Het HIV-gaggen brengt kerneiwitten tot expressie. Het pol-gen brengt het integrase en reverse transcriptase tot expressie, die beide nodig zijn voor de expressie van het reporter-gen in getransduceerde cellen. Door het genoom van het surrogaatvirus na te bootsen, wordt het reporter-gen in RNA-vorm omarmd in de pseudoviruskern. Het reporter-gen zal het eiwit tot expressie brengen in gastheercellen. De genexpressieniveaus van reportergenen kunnen worden gebruikt om de efficiëntie van pseudovirusinfecties te meten 3,4. De primaire reporter is firefly luciferase om de relatieve luminescentie-eenheden (RLU) of relatieve luciferase-activiteit (RLA) in getransduceerde cellen te meten. Andere verslaggevers zoals lacZ, Gaussia en Renilla luciferase worden ook gebruikt, alleen in mindere mate5.
Pseudovirussen zijn ideale hulpmiddelen om neutraliserende antilichamen tegen H5 HAPI-virussen te bestuderen. Om de neutraliserende antilichaampotentie te meten, worden pseudovirusneutralisatie (PN) assays6 gebruikt. Hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) zijn glycoproteïnen op het oppervlak van het influenza A-virus 7,8. Het HA bestaat uit een bolvormig hoofddomein voor receptorbinding en een stamdomein voor membraanfusie. Het NA-eiwit heeft de sialidase-activiteit om virusafgifte 7,8 te vergemakkelijken. Een PN-test kan neutraliserende antilichamen meten die gericht zijn op HA-eiwitten. Neutraliserende antilichamen gericht op het hoofd- en stengelgebied van HA kunnen ook worden gedetecteerd door virale hechtings- en ingangstests. In vergelijking met wild-type virussen hebben pseudovirusneutralisatie-experimenten gevoeligere detectiewaarden, kunnen ze veilig worden behandeld in een bioveiligheidslaboratorium van niveau 2 en zijn ze over het algemeen gemakkelijker te bedienen in de praktijk.
Dit protocol presenteert in detail de procedures en kritieke stappen van H5 HPAI pseudoviruspreparaten en PN-assays. Het bespreekt ook de probleemoplossing, beperking en wijzigingen van deze testen. In deze studie werd de A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) stam van H5N1 HPAI virussen als voorbeeld gebruikt. Om de immuunsera te verkrijgen die in assays worden gebruikt, selecteerde dit protocol het HA-eiwit afkomstig van de TH-stam als het immunogeen om muizen te immuniseren.

<table><tbody><tr><td>1% Chiken Erythrocyte</td><td>Bio-channel</td><td>BC-RBC-C001</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>96-well cell culture plates (flat-bottom)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>167008</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>96-well cell culture plates (round-bottom)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>163320</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Allegra X-15R</td><td>Beckman coulter</td><td>--</td><td>Uitrusting/Centrifuge</td></tr><tr><td>BD Insulin Syringes</td><td>BD</td><td>324910</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Anhydrous</td><td>AMRESCO</td><td>1B1110-500G</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>chloroquine diphosphate</td><td>Selleck</td><td>S4157</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>HEK293FT</td><td>Gibco</td><td>R700-07</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>HEPES FREE ACID</td><td>AMRESCO</td><td>0511-250G</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen ELISA</td><td>ZeptoMetrix</td><td>801111</td><td>Reagenskit</td></tr><tr><td>Luciferase Assay System Freezer Pack</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Reagenskit</td></tr><tr><td>MDCK.1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>509-GRD-Q</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339650</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339652</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>156499</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Pipette Tips (10 &mu;L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF102-10-Q</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Pipette Tips (100 &mu;L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Pipette Tips (1000 &mu;L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Serological pipets (5 mL)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>170355N</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Serological pipets (10 mL)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>170356N</td><td>verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Varioskan Flash</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>--</td><td>Uitrusting/Microplaatlezer</td></tr><tr><td>Water Jacket Incubator</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>3111</td><td>Uitrusting/Cel incubator</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium salt</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td>Reagens</td></tr></tbody></table>

bereiding van pseudo-getypeerde h5-aviaire influenzavirussen met calciumfosfaattransfectiemethode en meting van antilichaamneutraliserende activiteit

Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

Sinds 1996 veroorzaken A/gans/Guangdong/1/96-afstamming hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) H5-virussen griepuitbraken bij pluimvee en wilde vogels. Af en toe worden mensen er ook het slachtoffer van, wat resulteert in een hoge sterfte. Niettemin wordt hpai-virusonderzoek vaak belemmerd, aangezien het moet worden behandeld in bioveiligheidsniveau 3-laboratoria. Om dit probleem aan te pakken, worden pseudovirussen gebruikt als alternatief voor wild-type virussen in sommige experimenten van H5 HPAI-studies. Pseudovirussen blijken de ideale hulpmiddelen te zijn om neutraliserende antilichamen tegen H5 HPAI-virussen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures en kritieke stappen van H5 HPAI pseudoviruspreparaten en pseudovirusneutralisatietests. Het bespreekt ook de probleemoplossing, beperking en wijzigingen van deze testen.

HA, NA en HIV-1 p24 eiwitexpressie van influenza pseudovirus Om de efficiëntie van de virale verpakking te identificeren, werden influenza pseudovirusvoorraden voor het eerst gedetecteerd door middel van HA-assay (figuur 2A). HA-eenheden per milliliter influenza pseudovirussen zijn 643 (tabel 3). Western-blot assay en sandwich ELISA-assays werden gebruikt om HA, NA en HIV-1 p24 eiwitexpressie te testen. Vervolgens werden de verhoudingen van HA-eenheid en ...

Hier beschrijven we een protocol voor pseudovirusverpakking en het meten van antilichaamneutraliserende activiteit.

Bereiding van pseudo-getypeerde H5-aviaire influenzavirussen met calciumfosfaattransfectiemethode en meting van antilichaamneutraliserende activiteit

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

Dit protocol beschrijft de procedures en de kritieke stappen van H5 hoogpathogene aviaire influenza pseudo-viruspreparaten en pseudo-virusneutralisatietests. Ook bespreekt het de probleemoplossing, beperking en wijzigingen van deze testen. Hoogpathogene pathogenen moeten worden uitgevoerd in het bioveiligheidslaboratorium van niveau drie, terwijl pseudovirussen veilig kunnen worden behandeld in een bioveiligheidslaboratorium van niveau twee.Maak om te beginnen een enkele celsuspensie van HEK293 FT-cellen in een compleet DMEM-medium. Voeg 10 milliliter van de eencellige suspensie toe aan een T75-kolf, gevolgd door incubatie bij 37 graden Celsius. Vervang twee uur voor de transfectie het oude medium door 10 milliliter vers medium door chloroquine.Meng de reagentia en plasmide-DNA zoals beschreven in het manuscript en breng dit mengsel vervolgens over in het medium boven de cellen en rock voorzichtig. Vervang na incubatie het medium door 15 milliliter vers compleet DMEM-medium. Oogst na 65 uur het supernatant door centrifugeren.Verzamel het supernatant en aliquoteer het. Om hemagglutinine-eiwitexpressie te detecteren, voegt u 50 microliter PBS toe aan kolommen twee tot en met 12 van e

preparation-pseudo-typed-h5-avian-influenza-viruses-with-calcium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Bron: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)Deze video demonstreert de productie van influenzapsudovirussen in menselijke cellen met behulp van plasmidtransfectie via calciumfosfaat, wat de veilige generatie van single-cycle virusdeeltjes mogelijk maakt voor downstream toepassingen, zoals antilichaamneutralisatie-assays onder biosafety level...

Productie van pseudovirus middels plasmidetransfectie in menselijke cellen

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing α2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human...

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

This video demonstrates a technique for generating escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies. Antibody-neutralized virus suspension is injected into embryonated chicken eggs to propagate escape variants selectively. This results in a virus population predominantly of escape variants, confirmed via a Hemagglutination assay.

Generation of Influenza Virus Escape Variants against Neutralizing Antibodies

Deze studie beschrijft een   -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

Influenza A virussen (IAVs) zijn belangrijke menselijke respiratoire pathogenen. Om te begrijpen van de pathogeniteit van IAVs en om de preklinische testen van nieuwe vaccin benaderingen, zijn diermodellen nabootsen menselijke fysiologie vereist. Hier beschrijven we technieken om IAV pathogenese, humorale reacties en vaccin werkzaamheid met behulp van een muismodel van infectie te evalueren.

Influenza-A Virus Studies in een muismodel van infectie

Beschrijven we een methode waarmee we identificeren kritische residuen nodig zijn voor de binding van de mens of lymfkliertest monoclonal antilichamen die gericht zijn op de virale hemagglutinine van influenza A-virussen. Het protocol kan worden aangepast aan andere oppervlakte glycoproteïnen van virus en hun overeenkomstige neutraliserende antilichamen.

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Influenza neutraliserende antilichamen correleren met bescherming van influenza-infecties. Microneutralization testen meten van neutraliserende antilichamen in menselijke sera en worden vaak gebruikt voor menselijke influenza-serologie. We beschrijven een microneutralization assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 voor het meten van neutraliserende antilichamen titers voor hedendaagse 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) virussen na griepvaccinatie of infectie.

Meten van Influenza neutraliserende antilichamen reacties op A(H3N2) virussen in menselijke Sera door Microneutralization testen met behulp van MDCK-SIAT1 cellen

Dit protocol beschrijft een experimenteel proces voor het produceren van hoogtiter infectieuze virale pseudo-getypte deeltjes (PP) met envelop glycoproteïnen uit twee influenza-A-stammen en hoe ze hun infectiviteit kunnen bepalen. Dit protocol is zeer aanpasbaar om PPS te ontwikkelen van elk ander type omhulde virussen met verschillende envelop glycoproteïnen.

Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen

Het protocol beschrijft een methode voor het in vitro kweken van vogel-T-cellen door geheugen-T-cellen van geïnfecteerde eenden te isoleren, waardoor sterk gezuiverde specifieke eenden-T-cellen kunnen worden gegenereerd. Daarnaast werd een intracellulaire cytokinekleuringsmethode (ICS) ontwikkeld om de secretie van IFN-γ in eenden-T-cellen nauwkeurig te meten.

In vitro Kweek voor H5N1-specifieke eenden-T-cellen en detectie van immuunresponsen met behulp van intracellulaire cytokinekleuringsmethode

Leer de bereiding van H5-aviaire influenzapseudovirussen met calciumfosfaattransfectie en het meten van antilichaamneutraliserende activiteit. Dit protocol ondersteunt onderzoek naar vaccinontwikkeling en immuunresponsen.

Bereiding van pseudo-getypeerde H5-aviaire influenzavirussen met calciumfosfaattransfectiemethode en meting van antilichaamneutraliserende activiteit (Video) | JoVE Journal

Bereiding van pseudo-getypeerde H5-aviaire influenzavirussen met calciumfosfaattransfectiemethode en meting van antilichaamneutraliserende activiteit

Meer video's verkennen