Ruimtelijke profilering van eiwit- en RNA-expressie in weefsel: een benadering om virtuele microdissectie te verfijnen

Dit protocol helpt bij het begeleiden van de selectie van regio's die van belang zijn voor ruimtelijke omics-technologieën, waardoor een meer gerichte karakterisering van weefsels of celpopulaties mogelijk is. Een geautomatiseerd protocol voor ROI-selectie in proteomics-assays is robuuster en reproduceerbaarder dan handmatige protocollen, en het gebruik van 50 micrometer ROIs voor transcriptomics-assays maakt profilering van specifieke celpopulaties mogelijk. Begin met het programmeren van de autostainer om fluorescerende visualisatie-antilichamen toe te passen.

Klik in de autostainer software op de homeknop en kies Protocollen. Klik vervolgens op Protocollen maken/bewerken en selecteer RUO Discovery Universal als procedure. Klik op Eerste reeks, selecteer vervolgens Deparaffinazatie, gevolgd door Depar v2.

Kies voor Gemiddelde temperatuur 72 graden Celsius, klik vervolgens op Voorbehandeling en selecteer Celconditionering en CC1 Reservoir. Kies bij Zeer hoge temperatuur 100 graden Celsius, klik vervolgens op ACHT MINUTEN CC1 en klik verder totdat CC1 64 minuten is geselecteerd. Klik op Inhibitor, selecteer vervolgens DISCOVERY Inhibitor en kies voor Incubation Time acht minuten.

Klik vervolgens op Antilichaam, gevolgd door High-Temp Antibody Incubation. Kies voor Lage temperatuur 37 graden Celsius. Kies voor Antilichaam het ANTILICHAAM 6 op het etiket van de dispenser.

Selecteer voor Plus Incubatietijd 32 minuten. Klik op Multimer HRP en selecteer vervolgens Multimer HRP Blocker. Kies vervolgens voor Antilichaamblokkering de optie Gt Ig-blok.

En kies voor Incubatietijd vier minuten. Selecteer vervolgens op Multimer HRP Reagentia OMap Anti-Rb HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op Cy5 en kies voor Lange Incubatietijd nul uur, acht minuten.

Klik op Dual Sequence en kies Antibody Denaturation. Selecteer vervolgens Antibody Denature CC2-1 en kies voor een zeer hoge temperatuur 100 graden Celsius. Zorg ervoor dat de incubatietijd acht minuten is.

Klik vervolgens op DS Inhibitor en selecteer Neutraliseren. Klik op DS Antibody en kies voor Very Low Temperature 37 graden Celsius. Kies vervolgens in Antilichaam 3 op het etiket van de dispenser.

En voor Plus Incubatietijd selecteert u 32 minuten. Klik op DS Multimer HRP en kies DS Multimer HRP Blocker. Selecteer vervolgens voor Antilichaamblokkering de optie Gt Ig-blok en kies voor Incubatietijd vier minuten.

Selecteer vervolgens op Multimer HRP Reagentia OMap anti-Ms HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op DS Rhodamine 6G en kies voor Lange Incubatietijd nul uur, acht minuten. Klik op Triple Stain en selecteer TS Antibody Denaturation, selecteer vervolgens Antibody Denature CC2-2 en selecteer voor Very High Temperature 100 graden Celsius.

Zorg ervoor dat de incubatietijd acht minuten is. Klik vervolgens op TS Inhibitor en selecteer TS Neutralize. Klik op TS-antilichaam en selecteer voor Zeer lage temperatuur 37 graden Celsius.

Selecteer vervolgens in Antilichaam het ANTILICHAAM 7 op het etiket van de dispenser en selecteer voor Plus Incubatietijd 32 minuten. Klik op TS Multimer HRP en kies TS Multimer HRP Blocker. Selecteer vervolgens voor Antilichaamblokkering de optie Gt Ig-blok en kies voor Incubatietijd vier minuten.

Selecteer vervolgens op Multimer HRP Reagentia OMap Anti-Rb HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op TS FAM en kies voor Lange incubatietijd nul uur, acht minuten. Klik op Opslaan en voeg een titel toe aan het protocol.

Selecteer een protocolnummer, voeg een opmerking toe en klik op Actief, gevolgd door Opslaan. Bak door de leverancier aangeschafte formaline-vaste paraffine-ingebedde menselijke weefselsecties in een oven op 70 graden Celsius gedurende 20 tot 60 minuten. Terwijl dia's worden gebakken, drukt u etiketten af door te klikken op Label maken in de autostainer-software.

Klik vervolgens op Protocollen, selecteer het protocolnummer en klik op Sluiten/Afdrukken. Voeg relevante informatie toe aan het dialabel en klik op Afdrukken. Haal dia's uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.

Pas de eerder afgedrukte protocollabels toe op de bijbehorende dia's. Laad hervulbare antilichaamdispensers met antilichamen volgens de antilichaamlabelnummers. Verdun elk antilichaam in het opgegeven verdunningsmiddel en primeer de navulbare antilichaamdispensers.

Verzamel voorgevulde reagensdispensers voor blokkering, detectie en versterking en plaats ze op de reagenslade van het instrument. Laad dia's in de schuiflades en klik op Uitvoeren, gevolgd door Ja. Bevestig het begin van de run door de looptijd van de autostainer-software te controleren.

Zorg de volgende dag voor voltooiing van de run door groene knipperlichten op de schuifladesleuven te observeren. Haal vervolgens de dia's van het instrument en spoel de dia's krachtig af in 1x reactiebuffer totdat de vloeistofdekseloplossing volledig is verwijderd. Vervang SYTO 13 door SYTO 64 bij 5.000 nanomolar om fluorofoorintegratie mogelijk te maken.

Verdun SYTO 64 in 1x TBS en incubeer gedurende 15 minuten in een vochtigheidskamer. Gebruik FITC for DISCOVERY Fam en stel de belichting in op 200 milliseconden. Gebruik Cy3 voor DISCOVERY Rhodamine 6G en stel de blootstelling in op 200 milliseconden.

Gebruik Texas Red voor SYTO 64 en stel de belichting in op 50 milliseconden. Geef SYTO 64 op als het focuskanaal en gebruik ten slotte Cy5 voor DISCOVERY Cy5. Stel de belichting in op 200 milliseconden en sla wijzigingen op.

Bak formaline-vaste paraffine-ingebedde cel pellet secties in een oven ingesteld op 70 graden Celsius gedurende 20 tot 60 minuten. Scan dia's op het ruimtelijke profileringsplatform en selecteer formaten van 50 micrometer en 300 micrometer. Het geautomatiseerde visualisatieprotocol is ontwikkeld door één besturingselementen weg te laten om te bevestigen dat er geen doorbloeding was van de naburige kanalen.

De log 2 heatmap van alle markers die zijn opgenomen in de ruimtelijke proteomics-test waarin het handmatige pan-cytokeratine CD 45-protocol in zwart wordt vergeleken met het geautomatiseerde 3-plex-protocol in grijs, toont een Spearman R-waarde van 0,88. Van de 31 antilichamen die in de testen werden gebruikt, hadden 23 antilichamen een Spearman R-waarde hoger dan of gelijk aan 0,5. De log 2 heatmap van geselecteerde doelen die zijn opgenomen in de ruimtelijke transcriptomics-test waarin het handmatige pan-cytokeratine CD 45-protocol in zwart werd vergeleken met het 3-plex geautomatiseerde protocol in grijs, toonde verschillen in deze waarden.

De sequencinggegevens voor het 3-plex geautomatiseerde visualisatieprotocol presenteerden lagere waarden in vergelijking met het pan-cytokeratine CD 45 handmatige visualisatieprotocol, wat ook wordt weerspiegeld door de lage Spearman R-waarden van 0,15. Ook werd een verlies van dynamisch bereik waargenomen bij het gebruik van het geautomatiseerde 3-plex visualisatieprotocol. De detectie van kleine ROIs in het ruimtelijke transcriptomics-protocol werd uitgevoerd door de selectie van cirkelvormige gebieden van belang bij 50 micrometer en 300 micrometer diameter RNA-tellingen voor geselecteerde doelen op verschillende cellijnen waren vergelijkbaar tussen de twee regio's van interessegroottes na normalisatie.

Dit protocol voor geautomatiseerde visualisatiepanelen kan door onderzoekers worden aangepast door markers uit te wisselen om panelen te ontwikkelen die ROC's nauwkeurig definiëren om hun ruimtelijke proteomics-vragen te beantwoorden.