2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Het algemene doel van de procedure die we hier beschrijven, is het ontleden van betrokkenheid van primair cilium tijdens neocorticale ontwikkeling. Primaire trilharen zijn cruciaal gebleken voor vele stappen van neocorticale ontwikkeling, waaronder voorloperceluitbreiding, lotbepaling, evenals neuronale migratie en rijping. Om de betrokkenheid van cellen tijdens neocorticale ontwikkeling verder te ontleden, hebben we relevante tools opgezet door gebruik te maken van opkomende 2D- en 3D iPS-celgebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling.

Met andere woorden, neurale rozetten en dorsale voorhersenenorganoïden. 3D iPS-celgebaseerde modellen beginnen met embryoïde lichaamsvorming. Adhesie van genoemde embryoïde lichamen, maakt het genereren van 2D neurale rozetstructuren mogelijk, terwijl vrij zwevende cultuur van dergelijke EB's het genereren van dorsale voorhersenenorganoïden mogelijk maakt.

Het protocol dat we hebben opgezet om cerebrale organoïden te genereren, is gebaseerd op eerdere gepubliceerde protocollen met behulp van de kokhalsmethode door pre-patroonfactoren toe te voegen om specifiek dorsale voorhersenenorganoïden te genereren met behulp van remmers van de activine-nodale en BMP-route, ook bekend als dubbele SMAD-remming. Om te profiteren van de 3D-organisatie van de organoïden, hebben we een eenvoudige en snelle methode opgezet, waardoor totale immunolabeling, clearing en verlichte acquisitie van de hele organoïde met hoge resolutie mogelijk is. En om ons te concentreren op primaire ciliumbiogenese en -functies, hebben we de immunohistochemie aangepast op vrij zwevende secties die met een vibratoom zijn gesneden.

Na immunostaining en het opruimen van de secties, verkregen we de beelden met behulp van resonant scanning confocale microscopie. Begin met iPS-celculturen met grote reguliere kolonies, met minder dan 10% differentiatie en zijn niet meer dan 80% compliant. Ontleed elke iPS-celkolonie handmatig met behulp van een naald, waardoor elke kolonie precies in horizontale en verticale richtingen kan worden gevangen om een dambordpatroon te creëren, waarbij elke kolonie in gelijke clusters wordt verdeeld.

Maak de kolonie los met behulp van een celschraper en breng ze over op een ultralaag aanhechtingscultuurplaat. Laat ze een nacht in de couveuse drijven, zodat ze embryoïde lichamen kunnen vormen. Draai de volgende dag het medium, zorg ervoor dat de embryoïde lichamen niet worden geaspirateerd en breng ze over in Poly-L-ornithine Laminine-gecoate gerechten tot de vorming van neurale rozetten.

Dat duurt ongeveer 12 tot 14 dagen. Ververs dagelijks inductie, medium en controleer onder microscoop op vorming van neurale rozetstructuren. Vanuit deze stap kunnen neurale rozetten worden uitgebreid, gedifferentieerd en verwerkt voor immunostaininganalyse of worden gedisassocieerd om geïsoleerde neurale stam- en progenitale celculturen te krijgen.

Begin allereerst met iPS-culturen met grote reguliere kolonies die minder dan 10% differentiatie vertonen en die bijna één keer op de monolaag zijn gepasseerd. Laat iPS-cellen op dag nul embryoïde lichamen vormen in EB-medium met een lage concentratie fJ2 en een hoge concentratie ROCK-remmer die nodig is voor hiiPS-celoverleving om te voorkomen dat eb-formatie-incubatorplaten gedurende drie dagen worden verstoord zonder gemiddelde verandering. Op dag drie moeten EB's ongeveer 400 micrometer meten en regelmatige grenzen vertonen.

Als eerdere criteria rijk zijn voor de meeste EB's, verander dan het medium met inductiemedium één met dubbele SMAD-remmers zeker om de contra-DB's met de beste zes tot zeven op te fleuren, wat wijst op neurale tomaly concessie. En ze zetten andere DB's om in brutofactorverlagende keldermembraanmetingen. Gebruik vanaf deze stap altijd een steriele schaar om de opening van de peptiden te krijgen om beschadiging van de organoïden te voorkomen.

Breng eerst ongeveer 15 organoïden over naar een klinische buis. Laat de EB bezinken en verwijder het medium bij 50 microliter inductiemedium twee en breng de organoïden over naar een microgevoelige buis met 100 microliter matrix en gehomogeniseerd door op en neer te pipetteren. Verdeel het mengsel over het midden van een put van een neutrale bevestigingsplaat.

En ten slotte, ruimte EB's zodat ze elkaar niet raken om te voorkomen dat ze versmelten. Laat de materie gedurende 45 minuten stollen in de incubator, voeg inductiemedium twee toe aan elke put en incubeer in de incubator. Ververs inductiemedium twee om de dag.

Dissocieer op dag 17 de keldermembraanmatrix handmatig door 10 keer op en neer te pipetteren met vijf ml pipetten. Incubeer de organoïde plaat in het vertaalmedium één onder agitatie om de voedingsabsorptie te verbeteren. Belangrijk is dat u een andere incubator gebruikt voor stationaire cultuur en cultuur op orbitale shaker om trillingen te voorkomen die schadelijk zijn voor de aanhankelijke iPS-celgroei.

Na fixatie duurt permeabilisatie, blokkering en incubatie met primaire en secundaire antilichamen 10 dagen, inclusief wasstappen. De clearingmethode die we prefereerden, is gebaseerd op TDE, een glycolderivaat. Voor een optimale clearing intubeer de organoïde in TDE-oplossing met een geleidelijk verhoogde concentratie gedurende 24 uur elk.

Gebruik voor het insluiten van organoïden een aangepast hoofdgietsysteem gemaakt van de spuit van één ml, waarvan de punt wordt afgesneden met een scalpel. Laag smeltpunt Agarose wordt aanbevolen, omdat de smelttemperatuur slechts ongeveer 60 graden Celsius is. Bereid 4% laagsmeltende Agarose in 60% TDE-oplossing en laat het afkoelen op ongeveer 37 graden Celsius in een waterbasis pre-organoïde inbedding.

Doe in de spuit 600 microliter van de geloplossing met behulp van de zuiger, plaats vervolgens het monster en vul de spuit met 400 microliter van de geloplossing. Laat de gel polymeriseren en ten slotte wordt het monster ideaal in de gel gemonteerd en kan het gemakkelijk in de verlichte kamer worden geduwd om de organoïde voor het doel te plaatsen. Verlichte fluorescentiemicroscopie is ideaal voor de eerste beeldvorming van dergelijke heldere organoïden.

We hebben fotobeeldvorming verminderd en de subcellulaire resolutie gewogen. Hier gebruikten we een 20x objectief geïmmercimeerd in 80% TDE-oplossing toegevoegd in de monsterkamer om nauwkeurig aan te passen aan de brekingsindex van onze clearingmethode. De grootste monsterbestelling is ontworpen voor een spuit van één milliliter die vanaf de bovenkant kan worden ingebracht met de zuiger die kan worden bediend zodra de monsterorder is gemonteerd om de organoïde voor het objectief te plaatsen.

De verwerving van een hele organoïde duurt ongeveer 5 tot 10 minuten. Voor immunokleuring op vrij zwevende secties, verzamel en fixeer uw organoïden in een vierpersoonsdeel 's nachts bij vier graden Celsius. Integreer de organoïden in 4% laagsmeltende Agarose en sectie door een vibratome te gebruiken om 150 micrometer van zes secties te verkrijgen die in PBS-oplossing worden overgebracht, met behulp van een verfkwast om beschadiging ervan te voorkomen.

Na permeabilisatie en blokkering incubeer je de vrij zwevende secties met primair antilichaam 's nachts bij vier graden Celsius en onder agitatie. Was de secties zorgvuldig vóór incubatie met secundair antilichaam gedurende twee uur bij kamertemperatuur en onder agitatie. Tot slot, voor een optimale clearing, incubeer de sectie in TDE-oplossing met geleidelijk verhoogde concentratie gedurende één uur en 30 in 60% TDE en vervolgens in 80% TDE 's nachts bij kamertemperatuur.

Bewaar het gedeelte in 80%TDE en TLAC-oplossing bij vier graden Celsius. Monteer vrij zwevende sectie in een celkamer, in een poging om het monster in 80% TDE-oplossing te houden en ontworpen om zich aan te passen aan een gemotoriseerd stadium van klinische microscopen. Plaats eerst een ronde afdekslip in de kamer en breng de duidelijke bescherming voorzichtig over met een verfkwast.

Vul de kamer met 80% TDE-oplossing en voeg vervolgens twee standaard afdekslips toe plus een tweede ronde afdekslip en een siliconen afdichting. Schroef ten slotte de schroefring van de kamer vast om het systeem perfect af te dichten. Nightsheet, evenals resonantie-acquisities worden verwerkt dankzij een software die 3D-gebruik en een analyse van het volledige immunostain-monster mogelijk maakt.

Met dergelijke software kunt u snel enorme gegevens openen die we genereren om eenvoudig snapshots en animaties te maken. Hiermee kon het monster in verschillende richtingen worden verplaatst en kunnen we 2D-weergaven van het beeld genereren dankzij een 2D-slicertool in verschillende oriëntatie, X, Y en Y, Zed, bijvoorbeeld. Bovendien maakt dergelijke software automatische detectie van zowel centrosoom als primaire trilharen mogelijk, waardoor het aantal in pathologische versus controleomstandigheden kan worden gekwantificeerd.

Het maakt ook 3D-reconstitutie van primaire trilharen mogelijk voor nauwkeurige meting van de locaties. Het protocol dat we beschreven voor 2D iPS-celgebaseerde modellering van nieuwe corticale ontwikkeling maakt het genereren van neurale rozetstructuren mogelijk die nieuwe corticale voorlopers en neuronen bevatten die vergelijkbaar zijn met die in de zich ontwikkelende neocortex. Gedetailleerde validatie kan worden uitgevoerd door conventionele immunostaining-analyse.

Toepasselijke voorlopercellen moeten bij ons dubbel gekleurd zijn om gevoeligheden te beïnvloeden, terwijl intermediaire voorlopers worden onthuld door TBI2-kleuring en vroege botneocorticale neuronen door CTIP2-positieve kleuring. Dergelijke neurale rozetachtige structuren modelleren interkinetische nucleaire migratie van radicale voorlopercellen die kunnen worden gevisualiseerd door immunostaining met antilichamen tegen fosfo-vimentine die mototische kernen kleuren en TBX2 die de mitotische spindel ondersteunt. Ten slotte kan ciliagenesie worden geanalyseerd door immunostaining met antilichamen tegen pericentrisch, die het achterlichaam van primaire trilharen kleuren en van bepaalde middelen zijn die het axioma kleuren.

Op een dergelijke rozetstructuur worden primaire trilharen geëxtraheerd uit de apicale poly Fabri-Kal-voorlopers en dicht boven het centrale lumen van elk ventrikelitisgebied, terwijl ze ook uitsteken uit CTIP2-positieve neuronen. Dissociatie van adenoneurale rozetten maakt het mogelijk om geïsoleerde neurale stam- en voorlopercelculturen te genereren die zeer nuttig zijn om primaire ciliumbiogenese en -functie te analyseren. In het bijzonder beschrijven we de procedure om de inductie van de sonische medicijnroute te testen na behandeling met aanbevolen sonische drug of osmosine-agonisten.

Vervolgens test RTPCR SA de inductie van sonica-medicijndoelgenen, zoals GLI1 en PTCH1, en immunofluorescentieanalyse test de dynamiek van belangrijke sonische medicijncomponenten langs het primaire cilium die worden gekwantificeerd, dankzij open source-tools, ilastik en CiliaQ. Verschillende ciliaire parameters, waaronder lengte en oriëntatie, worden onderzocht, maar ook de intensiteit van primaire ciliumcomponenten wordt hier getoond voor GLI2 en GPR161 die respectievelijk het primaire cilium accumuuleren of verlaten als reactie op de aanbevolen behandeling met sonica. Het protocol dat we beschrijven voor onze 3D iPS-celgebaseerde modellering van neocorticale ontwikkeling maakt het genereren van homogene cerebrale organoïden met dorsale voorhersenenidentiteit mogelijk die kan worden gekenmerkt door conventionele immunostaininganalyse of door vrouwenkleuring, zoals hier getoond, met optimale penetratie van de antilichamen verhoogd, opnieuw, N-cadherine, PAX6 en CTIP2 die respectievelijk neuronale cadherine kleuren, in roze, apicale voorlopers in het ventriculaire zone-achtige gebied, in groen en alle pasgeboren neocorticale neuronen, gelegen in het corticale plaatachtige gebied.

Hier is een tweede film van de hele immunostain organoïde met antilichamen opnieuw verhoogd, CTIP2, in rood, mogelijk handhaven in roze, en TPX2, in groen, waardoor verschillende kenmerken van neocorticale voorlopers kunnen worden getest, zoals interkinetische nucleaire migratie van Fabri-Kal-voorlopers. Interessant is dat fosfo-vimentinepositieve voorlopers ook worden waargenomen in het supraventriculaire zone-achtige gebied en een uniek positief proces herbergen dat zich uitstrekt tot het positieve oppervlak, dat doet denken aan buitenste radiale gliale voorlopers en de hoge resolutie van deze methode illustreert. Hier is een film van een immunostain, vrij zwevende sectie, verkregen dankzij een resonantie-scanning microscoop met primaire trilharen gedetecteerd met pericentrine-antilichaam dat de achterkant van het lichaam heeft gekleurd, in groen, en ARLT3B-antilichamen die het axioma kleuren, in roze.

Primaire trilharen strekken zich uit van alle neuronale stam- en voorlopercellen, in het bijzonder aan het epische oppervlak van de epische voorlopers, maar ook in neocorticale neuronen van het voorplaatachtige gebied. Ten slotte 2D-neuronrozetten en geïsoleerde stam- en voorlopercellen recapituleren verschillende aspecten van cerebrale corticale ontwikkeling en vertegenwoordigen complementaire, nuttige hulpmiddelen om ciliaire biogenese en functie te testen. Het protocol dat we hier detecteren, stelde ons in staat om met succes dorsale voorhersenenorganoïden te genereren uit deze verschillende iPS-cellijnen die aanleiding geven tot homogene resultaten, waardoor de robuustheid van deze procedure wordt gewaarborgd.

De protocollen die we hebben opgezet voor immunostaining, clearing en beeldvorming van hele organoïden of vrij zwevende secties zijn eenvoudig, snel en kosteneffectief. Het combineren van dergelijke celgebaseerde modellen en 3D-beeldvormingsanalyse op iPS-cellen, gegenereerd door het herprogrammeren van ciliaire perturbatiecellen of door CRISPR 9-technologie te gebruiken om specifiek ciliaire genen te bewerken, zou aanzienlijke vooruitgang mogelijk moeten maken in het begrip van de bijdrage van het primaire cilium tijdens de normale en pathologische ontwikkeling van de hersenschors.