Isolatie van aangeboren lymfoïde cellen van de baarmoeder voor analyse door flowcytometrie
14 oktober 2021
Dit is een methode om baarmoederlymfecellen te isoleren van zowel zwangere als niet-zwangere muizen. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen zoals FACS-fenotypering, celsortering, functionele assays, RNA-seq en proteomics. Het protocol hier laat zien hoe groep 1 uteriene aangeboren lymfoïde cellen kunnen worden gefenotypeerd door flowcytometrie.
Onze methode maakt het mogelijk om de samenstelling en functionele kenmerken van verschillende subpopulaties van lymfocyten in het baarmoederweefsel van zwangere en niet-drachtige dieren te beoordelen. Dit protocol zorgt voor isolatie van baarmoederlymfocyten met behoud van oppervlakte-expressie van eiwit, cel levensvatbaarheid en functionaliteit. Daarom is het geschikt voor een reeks volgende toepassingen.
Verwijdering van foetussen aan het begin van het experiment en leukocytenverzameling zijn technisch uitdagende stappen. Omdat het een langdurig experiment is, zijn bijzondere aandacht en focus nodig zodra je de antilichaamkleuringsstappen hebt bereikt. Breng om te beginnen het baarmoederweefsel dat is geoogst van een zwangere C57 zwarte zes vrouwelijke muis over in een steriele petrischaal en verwijder vervolgens met steriele instrumenten voorzichtig het vet rond het weefsel, waarbij u ervoor zorgt dat het weefsel niet droog wordt.
Verwijder de foetussen door elke implantatieplaats te ontleden met steriele instrumenten en breng de baarmoeder vervolgens terug naar de oorspronkelijke verzamelbuis van vijf milliliter met één milliliter verzamelmedium. Hak met een schaar het weefsel in de verzamelbuis en plaats de buis vervolgens in een waterbad van 37 graden Celsius. Voeg vervolgens drie milliliter voorverwarmd enzymatisch verteringsmengsel toe aan de buis.
Incubeer de buis gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met agitatie om de enzymatische verteringsactiviteit te verbeteren. Nadat de incubatie is voltooid, vortex de buis en houd deze op ijs om de enzymatische activiteit te remmen en breng vervolgens het spijsverteringsweefsel over in een correct gelabelde centrifugebuis van 15 milliliter. Spoel de opvangbuis van vijf milliliter af met in totaal 10 milliliter ijskoude vijf millimolaire EDTA PBS-oplossing om al het resterende weefsel te verzamelen en over te brengen in de centrifugebuis van 15 milliliter.
Centrifugeer het verteerde weefselmonster gedurende 10 minuten bij 400 maal G.Gooi het supernatant weg, veeg voorzichtig met de pellet en vervolgens opnieuw opschorten in 10 milliliter voorverwarmde vijf millimolaire EDTA PBS-oplossing. Om celklontering te verminderen, incubeer het monster bij 37 graden Celsius met agitatie, gevolgd door vortexing op hoog gedurende 10 seconden. Voor het verwijderen van celklonten in niet-gebonden weefsel, plaatst u een zeef van 70 micrometer bovenop een steriele centrifugebuis van 50 milliliter en dwingt u vervolgens met behulp van de zuiger van een steriele spuit van één milliliter het verteerde weefsel door de zeef in de buis.
Was de zeef meerdere keren met in totaal 10 milliliter koude PBS om alle cellen te verzamelen en besteed vervolgens de centrifugebuis van 50 milliliter gedurende 10 minuten op 400 keer G.Na het weggooien van het supernatant kunnen de aangeboren lymfoïde cellen worden geïsoleerd met optie A of optie B.Voor optie A, resuspend de pellet in vijf milliliter van 80% isotonisch per oproep met behulp van een pipet voy. Gebruik vervolgens de pipet voy op lage snelheid en leg voorzichtig acht milliliter, 40% per call-oplossing, op de gereuspendeerde pellet in een centrifugebuis van 15 milliliter. Pipetteer langzaam en continu en houd de 15 milliliter in een hoek van ongeveer 45 graden.
Zonder de overlay te verstoren, centrifugeer de buis gedurende 20 minuten op 850 keer G met gemiddelde versnelling en minimale onderbrekingen bij kamertemperatuur. Zodra de centrifugatie is voltooid, verwijdert u voorzichtig de buis uit de centrifuge zonder de per call-lagen te verstoren. Gebruik vervolgens, zonder de ring van leukocyten op het grensvlak van de twee per call-oplossingen te verstoren, een steriele pasteurpipet om alles weg te gooien, behalve 0,5 tot één milliliter van de bovenkant per calllaag.
Terwijl u probeert de hoeveelheid oplossing per oproep die in de pipet wordt gezogen tot een minimum te beperken, verzamelt u zorgvuldig de ring van leukocyten en brengt u de cellen over in een nieuwe gelabelde centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg 10 milliliter steriel RPMI-medium aangevuld met 10% warmte en geactiveerd FBS toe aan de cellen en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 500 keer G en vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en ga verder met rode bloedcellysis.
Om de cellen te isoleren met behulp van optie B, na het verteerd weefsel door de celzeef te hebben geleid en het resultaat in celsuspensie te centrifugeren zoals eerder aangetoond, resuspendeert u de pellet met acht milliliter van 35% isotoon per oproep en RPMI-medium en brengt u de cellen over in een buis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op 940 maal G bij kamertemperatuur met gemiddelde versnelling en minimale onderbrekingen. Gebruik vervolgens een aspirator of pipet voy, aspirateer het supernatant zorgvuldig voordat u de pellet resuspendeert in 14 milliliter RPMI-medium aangevuld met 10% warmte en geactiveerd FBS.
Centrifugeer het monster opnieuw gedurende vijf minuten bij 500 keer G en vier graden Celsius, gooi het supernatant door aspiratie weg en ga verder met rode bloedcellysis. Om de rode bloedcellen te lyseren, resuspendeert u het monster in drie milliliter van één X rode bloedcel ligoplossing en incubeert u gedurende drie minuten bij kamertemperatuur en voegt u vervolgens 10 milliliter PBS toe aan het monster om de reactie te stoppen. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 400 maal G na het weggooien van het supernatant, voeg nog eens 10 milliliter PBS toe en herhaal centrofugatie.
Resuspend de pellet in één milliliter RPMI-medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS en passeer vervolgens de in-celsuspensie door een steriele celzeef van 70 micrometer. Na het tellen van de cellen passen de concentratie van de celsuspensie aan tot één tot 2 miljoen cellen in 100 microliter PBS en gaan ze over tot kleurings- en facs-analyse. Baarmoedergroep één ILC's omvatten conventionele NK-cellen, weefsel resident NK-cellen en groep één ILCs met hun percentages variërend tijdens het leven en de zwangerschap.
Deze subsets kunnen worden onderscheiden met behulp van flowcytometrie door eerst cellen te gaten op hun vermogen om licht te verstrooien, vervolgens enkele koopbare CD 45 positieve CD drie negatieve CD 19 negatieve cellen te isoleren en vervolgens groep één ILCs te identificeren die NK 1.1 en NKP 46 positief zijn. Binnen groep één ILCs zijn CD49A negatieve EM's positief conventionele NK-cellen. CD49A positieve Ems positieve cellen zijn weefsel resident NK cellen.
En CD49 positieve Ems negatieve cellen zijn groep één baarmoeder ILC's. Kleuring van milt- en baarmoederlymfocyten met anti NK P46- en anti NK 1.1-antilichamen toont aan dat de miltlymfocyten hogere hoeveelheden NKP 46 op hun oppervlak uitdrukken dan hun baarmoedertegenhanger. Bij enzymatische weefseldissociatie kunnen oppervlakte-epitopen worden gewijzigd, afhankelijk van de enzymen die in het spijsverteringsmedium worden gebruikt.
De kleuring voor de MHC CD49 NKG2A-receptor is bijvoorbeeld slecht wanneer liberase TM wordt gebruikt. Vertering met liberase DH behoudt echter de NKG2A-herkenning door de 1611-antilichaamkloon. Ongeveer 6,5% van de ILC's van groep één die aanwezig zijn in baarmoederweefselmonsters op drachtdag 8,5 zijn afkomstig van bloed.
Bloedverontreinigingen kunnen worden uitgesloten door intravitale kleuring met anti-CD45-antilichamen geconjugeerd met een fluorochroom. Bij het opzetten van tijdsvergaderingen moet u er rekening mee houden dat muizen nachtdieren zijn. Daarom moeten ze zo laat mogelijk in de middag worden opgezet, omdat de paring 's nachts zal plaatsvinden.
Ook bij het selecteren van vrouwtjes moet je ervoor zorgen dat ze geen vaginaal septum hebben. We doen meestal flowcytometrie-analyse om naar veel eiwitten aan de buitenkant van de cellen en in de cellen te kijken. We doen ook nucleïnezuurextractie om genexpressie te bestuderen, inclusief RNA-sequencing.
En we slagen er ook in om functionele assays te omzeilen om de reacties van aangeboren lymfoïde cellen van de baarmoeder te bestuderen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van lymfoïde cellen uit de baarmoeder van drachtige en niet-drachtige muizen, waarbij de levensvatbaarheid en functionaliteit van de cellen behouden blijven. Het is toepasbaar voor diverse vervolganalyses, waaronder flowcytometrie en functionele assays.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Uterine lymfoïde cellen spelen een cruciale rol in de reproductieve immunologie.
- Inzicht in hun samenstelling kan leiden tot nieuwe inzichten in de zwangerschap en immuunresponsen.
- Isolatiemethoden moeten de celviabiliteit en de expressie van oppervlakteproteïnen behouden.
- De uitdagingen omvatten de technische aspecten van weefselverwerking en de collectie van leukocyten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van uteriene lymfocyten.
- Om fenotypering van aangeboren lymfoïde cellen mogelijk te maken met behulp van flowcytometrie.
- Om verdere functionele assays en analyses te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van baarmoedertissue van drachtige muizen.
- Enzymatische digestie om lymfocyten te isoleren.
- Centrifugatie- en dichtheidsgradiëntscheidingstechnieken.
- Flowcytometrie voor fenotypering van lymfocyten-subpopulaties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levensvatbare lymfoïde cellen uit de uterus.
- Identificatie van verschillende subpopulaties van aangeboren lymfoïde cellen.
- Behoud van de cellfunctionaliteit voor downstream-toepassingen.
- De methode demonstreert reproduceerbaarheid en efficiëntie bij de celisolatie.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van uteriene lymfocyten.
- Het vergroot het begrip van de immuundynamiek tijdens de zwangerschap.
- Toekomstige toepassingen kunnen het onderzoeken van immuunresponsen bij de reproductieve gezondheid omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De isolatie van aangeboren lymfoïde cellen uit de baarmoeder maakt mechanische risicoreductie van targets binnen de reproductieve immunologie mogelijk door een ziekterellevant systeem te bieden om lymfocytenresponsen op maternale en foetale factoren te evalueren. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie en fenotypische screening in preklinische modellen van zwangerschapsgerelateerde aandoeningen, wat het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-compounds vergroot. De methode faciliteert de ontdekking van translationele biomarkers en de ontwikkeling van assays voor immunomodulerende therapieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidering
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door groep 1 uterine ILC's te isoleren en te fenotyperen om hun rol in de immuunregulatie tijdens de zwangerschap te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare workflow voor het isoleren van levensvatbare uterine lymfocyten, waarbij de expressie van oppervlakte-eiwitten en de functionaliteit behouden blijven.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde single-cell suspensies die geschikt zijn voor flowcytometrie-gebaseerde screening van immunomodulerende verbindingen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de assay-gereedheid door een consistente celopbrengst en viabiliteit, waardoor een betrouwbare evaluatie van verbindingen over experimentele batches mogelijk wordt gemaakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt immuunprofilering in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door uILC-heterogeniteit te koppelen aan genexpressie en functionele resultaten.
- Operationele waarde: Faciliteert continuïteit van isolatie naar downstream-toepassingen, waaronder RNA-sequencing en functionele assays.
Integratie van Pijplijn en Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door hypothesetoetsing in de reproductieve immunologie mogelijk te maken, de ontwikkeling van assays voor immuunmodulatoren te ondersteunen en risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling te onderbouwen via kwantitatieve immuunprofilering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door het isoleren van uterine lymfocyten-subpopulaties voor functionele en fenotypische analyse.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie en kwantitatieve read-outs mogelijk via flowcytometrie om immuunresponsen tussen verschillende condities te vergelijken.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, zoals percentages van cel-subsets en marker-expressie, om comparatieve analyse mogelijk te maken.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug naar preklinische continuïteit door cellulaire fenotypen te koppelen aan functionele uitkomsten en genexpressieprofielen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform dat toepasbaar is over verschillende zwangerschapsstadia en ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanistische risicoreductie van immuunmechanismen in de baarmoeder.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid van lymfocytenisolatie over verschillende experimentele sets.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door vermindering van biologische onzekerheid bij de interactie met reproductieve targets.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten op basis van gegevens over de immuunrespons van de baarmoeder.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefseldissectie, enzymatische digestie en flowcytometrie.
- Afhankelijk van de optimalisatie van de enzymatische digestie om oppervlakte-epitopen zoals NKG2A te behouden.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor consistente protocollen voor leukocytenverzameling en kleuring.
- Houdt rekening met aanpassingen bij toepassing op verschillende gestationele stadia of genetische modellen.
- Beperkt door het verlies van ruimtelijke weefselinformatie tijdens dissociatie, waardoor complementaire beeldvorming nodig is voor de ruimtelijke context.
