Evaluatie van motorische stoornissen in C. elegans-modellen van amyotrofische laterale sclerose

Ons protocol presenteert twee assays, die de beweging van C.elegans kwantificeren. Deze methoden evalueren motiliteitsfenotypes zoals die worden tentoongesteld door modellen van Amyotrofische Laterale Sclerose, of ALS. De Radial Locomotion Assay is een kosteneffectieve en eenvoudige methode om kruipen op een vast oppervlak te detecteren.

De Swimming Assay maakt gebruik van computergebaseerde tracking voor onbevooroordeelde detectie van thrashing-bewegingen in vloeistof. Deze methoden zijn nuttig voor het kwantificeren van bewegingsverschillen in C.elegans. Hoewel we ALS bestuderen, kunnen ze worden gebruikt voor elke soort met veranderde beweeglijkheid.

Draai de NGM-testplaten ondersteboven. En label de bodem met een identificatie voor de C.elegans-stammen die moeten worden getest. Maak een kleine stip met de stift in het midden van de onderstebovenplaat.

Breng tijdens het werken met een ontleedmicroscoop wormen over naar het midden van de testplaat. En stel een timer in voor 30 minuten. Leg het deksel terug op het bord en zet het apart.

Ga door met het overbrengen van wormen totdat alle stammen op de aangewezen testplaten staan. Begin na 30 minuten met het scoren van de eerste plaat door het deksel te verwijderen en de plaat met de voorkant naar beneden onder de ontleedmicroscoop te plaatsen. Pas de microscoopfocus aan totdat alle wormen zichtbaar zijn door de vijzel.

Gebruik een andere gekleurde viltstift vanaf het middelpunt en plaats een kleine stip op de locatie van elke worm. Controleer de rand van de plaat, want daar kunnen sommige wormen terechtkomen. Tel en noteer ook hoeveel wormen niet van het middelpunt zijn verplaatst.

Meet de afstand van het middelpunt tot de uiteindelijke locatiemarkeringen voor elke worm en noteer de afstand met een liniaal. Het eerste wormpunt is gemarkeerd met een streepje. Noteer lengtegegevens voor elke stip achtereenvolgens door de plaat met de klok mee te draaien.

Open de bijbehorende software om de video's in te stellen en op te nemen. Klik op het pictogram voor het vastleggen van video's. Druk op de dimmerknop en draai deze met de klok mee om het licht aan te passen.

Klik in het video-opnamevenster op het tabblad Instellingen en pas de videomodus aan op 2456x2052_Mono8, framesnelheid naar 14, uitvoer als monochroom. Belichting van 0,00300 seconden. Versterking tot 1 dB.

Gamma op één. En roteren naar 180. Ga terug naar het tabblad Vastleggen, selecteer de opnamemap en wijs een bestandsnaam toe door deze in te voeren in het tekstvak voor het bestandsvoorvoegsel.

Stel andere opname-instellingen zoals buffer in op 128 frames en de duur op één minuut. Plaats de testplaat verlicht op het apparaatpodium en centreer deze in het video-opnamescherm en verwijder vervolgens het deksel. Gebruik een micropipette om ongeveer 50 wormen in 1 ml M9 op de testplaat te wassen.

Draai de plaat voorzichtig om de dieren naar het midden te brengen, of gebruik een micropipette om een paar druppels M9 toe te voegen om de dieren te scheiden. Stel een timer in voor 60 seconden om wormen te laten wennen aan het zwemmen. Stel de lichtknop zo in dat het display zo helder mogelijk is zonder overbelichting.

Pas de camerafocus handmatig aan door de scherpstelring op de lensbehuizing van de camera te draaien, terwijl u naar het scherm kijkt. Druk na 60 seconden op de opnameknop, selecteer de eerste knop in het workflowmenu Afbeeldingsreeks importeren "en zoek en dubbelklik op een video. Selecteer in het workflowmenu Volgorde-informatie instellen"Controleer in het nieuwe menuvenster het naamgevingsschema, voeg notities toe en valideer metagegevens.

Selecteer Afbeelding aanpassen en er wordt een nieuw pop-upmenu met de naam Afbeeldingsaanpassingen geopend. Pas de instellingen voor beeldverwerking aan door de achtergrond vloeiend te maken op 10, Gaussiaanse vloeiendheid op vijf, gaten vullen op twee, klein objectfilter op nul en integrale afgeleide segmentatie over te slaan. Pas het drempelniveau zo aan dat de dieren volledig gevuld zijn met groen, maar nog steeds verschillen van de achtergrond.

Klik vervolgens op Toepassen "Selecteer in het workflowmenu Detecteren en volgen" selecteer drie tot zeven wormen en klik op de knop Wormen detecteren op het tabblad Detectie. Ga naar het tabblad Tracking. Vink in de trackingparameters Use Backtracking" aan en schakel Trackwormen aan de rand van de afbeelding uit.

Stel de max tracked hypothese in op vijf. Stel de trackingmodus in op zwemmen. Ga naar het gedeelte geavanceerde instellingen en stel de frames in die wormen kunnen raken grens op 50.

Frameswormen kunnen overlappen tot 500. Positietolerantie tot 0,50. En vormtolerantie tot 0,50.

Sla deze instellingen op en implementeer ze voor alle video's in een experiment door ze op te slaan als een configuratie. Navigeer naar configuratiebeheer in het pictogrammenu linksboven en klik op het pictogram Opslaan. Geef deze configuratie een naam en beschrijving.

En klik op OK"Klik in het workflowmenu op Project opslaan"Volg de video's door naar het workflowmenu te gaan en op het pictogram Batch" te klikken. Klik op de knop Toevoegen onder het gedeelte bestandsselectie van dit batchverwerkingsmenu. navigeer naar en selecteer alle projectbestanden die moeten worden verwerkt.

Klik vervolgens op de knop Openen "Klik op de start" en noteer de groene voortgangsindicator op het eerste bestand. Sta toe dat alle bestanden worden verwerkt. Wanneer alle gelezen bestanden zijn voltooid, sluit u de software.

Selecteer Gegevens analyseren"Navigeer naar het overzicht van de track. En gebruik de knop Exporteren rechtsonder om gegevens te exporteren in een leesbaar formaat voor spreadsheets. Gebruik de Turn Count "en Track Duration" om bochten per minuut voor elke track te berekenen met behulp van spread sheeting-functies.

Niet-gestimuleerde dispersie van ontwikkelingsgefaseerde L4-larve van vijf verschillende stammen werd gemeten met behulp van de Radial Locomotion Assay. En in een grafiek weergegeven als micrometer per afgelegde minuut. De gegevens die als staafdiagrammen worden weergegeven, maken relatieve verschillen tussen stammen duidelijker.

Terwijl de uiteindelijke verplaatsing van elke worm die in de grafiek is uitgezet, het mogelijk maakt om de variatie binnen de populatie beter te visualiseren. De zwemsnelheid in termen van thrashing of golvingsfrequentie in de vloeistof, werd gemeten met behulp van onbevooroordeelde computerondersteunde scoring en analyse. En weergegeven als thrashes per minuut.

De staafdiagramgegevens maken relatieve verschillen tussen stammen gemakkelijker te zien. Terwijl gegevens van elke individuele gescoorde worm in de grafiek worden uitgezet, waardoor de variatie binnen de populatie beter kan worden gevisualiseerd. In de Radial Locomotion Assay verschilde de milde TDP-43-stam niet significant van de wildtype N2-stam.

In de Swimming Assay verschilden zowel de milde als de sterke TDP-43-stammen echter niet alleen aanzienlijk van de wild-type N2, maar ook van elkaar. De ALS-mutante TDP-43-stam heeft een ernstige kruipstoornis door radiale voortbeweging en ze gooien niet in vloeistof. De tau-expresserende spanning heeft ernstige beperkingen in radiale voortbeweging, maar kan in de swimming assay thrashen.

Het belangrijkste aspect om te overwegen met deze methoden, is het handhaven van consistente controles tussen replicaties. Dit zorgt ervoor dat variaties in motiliteit worden veroorzaakt door fenotypische verschillen en niet door omgevingsomstandigheden. Deze methoden bieden een uitgebreide beoordeling van twee belangrijke C.elegans motiliteitsparadigma's.

Vervolgmethoden kunnen aanvullende gedragskarakterisering, biochemische analyse of onderzoek van de spier- of neuronfunctie omvatten.