Hogedruk NMR-experimenten voor het detecteren van eiwitarme conformatietoestanden

Hoge druk is de methode bij uitstek om de relatieve populatie van een eiwitconformatiemonster te veranderen. Het is uiterst nuttig voor het isoleren en karakteriseren van hoogenergetische conformatietoestanden. Vergeleken met alle perturbatiemethoden, zoals pH of temperatuur, is drukperturbatie gemakkelijk toe te passen en volledig omkeerbaar.

Het is ook een lokale verstoring, die voornamelijk regio's met glazen holtes of lege volumes treft. Om te beginnen introduceert u het stikstof-15-gelabelde monster in de zirkoniabuis met behulp van een glazen pipet en zorgt u ervoor dat het monster aan de onderkant van de buis zit. Om te voorkomen dat het monster zich mengt met de transmissievloeistof, bedekt u het monster met 200 microliter minerale olie en vult u vervolgens de rest van de buis met transmissievloeistof.

Plaats een O-ring voor eenmalig gebruik bovenop de zirkoniabuis en schuif de buis in de basis. Sluit vervolgens de buis aan op de hogedruk tetherlijn en draai de basis met de hand aan de cel vast. Pas vervolgens 14,7 newtonmeter koppel toe om lekken bij lagere druk te voorkomen.

Om de integriteit van de drukcelassemblage te controleren, zet u de buis tot 300 bar buiten de spectrometer onder druk met behulp van celondersteuning en insluitingsvat. Zet na 15 minuten de druk terug op één bar en controleer op lekken met een schoon pluisvrij doekje. Plaats de buis zonder druk in de spectrometer door de tetherlijn voorzichtig te geleiden.

Schuif de buis in de spectrometer totdat de buis de zitpositie van het monster bereikt. Vergrendel, shim, match en tune de protium- en stikstofkanalen en bewaar de geoptimaliseerde shims voor de toekomst. Stel transversale relaxatie geoptimaliseerde spectroscopie in met hetero single-quantum coherente spectroscopie en ga verder met het opnemen van een referentie-experiment onder de atmosferische omstandigheden.

Neem een reeks 2D-experimenten op van één bar tot 2,5 kilobar voor elke 500 bar. Als de precieze vouw- of ontvouwingssnelheden bekend zijn, laat u het monster na elke stap van 500 bar gedurende 15 tot 20 minuten in evenwicht brengen. Wanneer het buigpunt van de vouw- of ontvouwende overgang wordt bereikt, neemt u aanvullende experimenten op om de precisie van de pasvorm te verbeteren.

Dit protocol werd gebruikt om de drukafhankelijkheid van RRM2 te onderzoeken, het tweede RNA-herkenningsmotief heterogene nucleaire ribonucleoproteïne A1. Transversale relaxatie geoptimaliseerde spectroscopie met hetero single-quantum coherentiespectroscopiespectroscopiespectroscopie werd verzameld op één bar, 1,5 kilobar, twee kilobar en 2,5 kilobar. De RRM2 is bijna volledig uitgevouwen binnen het bereik van 2,5 kilobar. Individuele drukintensiteitsprofielen werden aangepast volgens de hier getoonde vergelijking, om de overeenkomstige veranderingen in de standaard Gibbs-vrije energie en volume geassocieerd met de zich ontvouwende reactie te verkrijgen.

Wanneer de domeinstructuur in kaart werd gebracht, werden de residuen met de grootste omvang van volumeverandering gevonden in de structurele kern van het domein, terwijl die met de kleinste omvang van volumeverandering zich voornamelijk bevonden in de verbindingslussen tussen de bètastrengen en bètastrengen naar de C-terminale helix. Om de mate van samendrukbaarheid en conformatie heterogeniteit van het gevouwen toestandsensemble te onderzoeken, werden de protiumchemische verschuivingen geanalyseerd. Individuele profielen van protiumchemische verschuivingen als functie van de druk werden aangebracht met behulp van de getoonde vergelijking, om de plaatsspecifieke lineaire en niet-lineaire coëfficiënten te extraheren.

De residuen met de grootste niet-lineaire coëfficiënten werden meestal gevonden in de structurele kern van het domein, terwijl residuen met de kleinste niet-lineaire coëfficiënten zich meestal bevonden in lussen die de verschillende structurele motieven met elkaar verbonden. Het is belangrijk om de buis correct in te stellen als een drukset, om lekken te voorkomen. Als er een lek optreedt, moet de sonde waarschijnlijk worden verwijderd om elk spoor van minerale olie op te ruimen.