Planaire ovariumdissectie voor ultrastructurele analyse en kleuring van antilichamen
10 september 2021
Dit protocol presenteert de stappen die zijn genomen om de eierstokken in de zoetwaterplanariërs, Schmidtea mediterranea, te ontleden.De ontlede eierstokken zijn compatibel voor immunokleuring van antilichamen en ultrastructurele analyse met transmissie-elektronenmicroscopie om de celbiologie van de eicellen en somatische cellen te bestuderen, waardoor een beeldvormingsdiepte en -kwaliteit worden geboden die voorheen ontoegankelijk waren.
Het doel van deze methode is om de eierstokken van de planarische Schmidtea mediterranea te ontleden voor cellulaire en subcellulaire analyse van de eicelbiologie met TEM of antilichaamkleuring. Dit protocol maakt gebruik van een korte fixatiestap om de lokalisatie en dissectie van planaire eierstokken te vergemakkelijken, wat beeldvorming en kwaliteit zal bieden die voorheen ontoegankelijk waren. De grootste uitdaging voor iemand die deze techniek nog nooit eerder heeft uitgevoerd, is het lokaliseren van de eierstokken na fixatie.
Het zal nuttig zijn om vóór het experiment vertrouwd te raken met de anatomie van seksuele planariërs. Bereid je voor op het experiment door seksuele planariërs twee keer per week biologische leverpasta te geven om geslachtsrijp te worden. Behandel geslachtsrijpe wormen met 5%N-acetyl-L-cysteïne, of NAC, in een schaal bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
Vervang NAC door 10 milliliter vers bereid 4%paraformaldehyde en fixeer de wormen een uur op kamertemperatuur met af en toe schudden. Begin de dissectie 10 minuten na het toevoegen van 4% paraformaldehyde terwijl de wormen worden gefixeerd. Observeer de epitheliale pigmentatie om de ventrale zenuwkoorden te lokaliseren, die verschijnen als twee lijnen met lichtere pigmentatie die lopen van de voorste cephalische ganglia naar de staart.
Lokaliseer de vermeende eierstokken door de pigmentatie te observeren en hun positie te valideren. Maak met twee chirurgische messen sneden achter en voor de eierstokken om de voorste en achterste wormfragmenten volledig te verwijderen. Gebruik het ene mes om de worm te verankeren en het andere mes voor de dissectie.
Reinig het mes dat is gebruikt om de sneden te maken. Om de twee eierstokken te scheiden, snijdt u de middelste lijn van het eierstokfragment in en draait u het fragment vervolgens ventrale kant naar beneden. Gebruik twee paar puntige pincetten van het type 5-SA om het dorsale weefsel af te pellen om de darm bloot te leggen.
Verwijder voorzichtig de darmtakken die boven de ventrale weefsels zitten met de punt van het pincet of een zachte borstel om de eierstok bloot te leggen. Verwijder de omliggende weefsels om de eierstok te verwijderen. Haal de eierstokken eruit en doe ze in een tube van 1,5 milliliter om te wassen met 1 milliliter PBS.
De dorsale en ventrale pigmentatiepatronen werden gebruikt om de positie van de eierstokken te bepalen. Overtollig weefsel werd stap voor stap weggesneden. Zodra de eierstok was blootgesteld, werd het omliggende weefsel weggesneden.
Eierstokken die meerdere somatische celtypen bevatten, werden gebruikt voor zowel ultrastructurele analyse als immunofluorescentiekleuring. De ontlede eierstokken zorgen voor hoogwaardige beeldvorming van de cellulaire en subcellulaire anatomie van de eicellen. Deze procedure moet RNA-interferentie-experimenten mogelijk maken om de moleculaire regulatie van de eicelbiologie te onderzoeken.
Deze techniek leidde tot de ontdekking van een nieuw fenomeen in de eicellen van de platworm dat de nucleaire envelop wordt afgebroken tot blaasjes die nucleaire eiwitten inkapselen in plaats van intact te blijven, ook wel gesloten mitose genoemd, of in stukken te breken, ook wel open mitose genoemd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft in detail de dissectie van de eierstokken bij de zoetwaterplanaria Schmidtea mediterranea, met als doel cellulaire en subcellulaire analyse van de ocytenbiologie mogelijk te maken. De methode verbetert de beeldkwaliteit en -diepte door technieken zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en antilichaam-immunokleuring.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Oocytenanalyse
- Planaria-biologie
Achtergrond
- De anatomie van seksueel volwassen planaria is essentieel voor een effectieve dissectie.
- Het voeren van planaria met organische leverpasta bevordert de seksuele rijping.
- Eierstokken worden gelokaliseerd op basis van epitheelpigmentatiepatronen.
Gebruikte methoden
- Chirurgische dissectiemethoden
- Zoetwaterplanaria Schmidtea mediterranea
- Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en immunofluorescentiekleuring
Belangrijkste resultaten
- Efficiënte lokalisatie en dissectie van eierstokken bij seksuele planaria.
- Hoge-resolutie beeldvorming van cellulaire structuren en somatische celtypen.
- De methode ondersteunt RNA-interferentie-experimenten om moleculaire regulaties te bestuderen.
Conclusies
- Deze studie biedt een nieuwe techniek voor de analyse van reproductieve cellen bij planaria.
- Het bevordert het begrip van de oocytenbiologie en ondersteunt toekomstige genetische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Directe toegang tot intacte planarië-ovaria maakt analyse met een hoge resolutie van de ontwikkeling van kiemcellen mogelijk, wat mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Dit protocol faciliteert kwantitatieve beeldvorming en moleculaire analyse van de oocytenbiologie, waardoor het voorspellende vertrouwen in kiemlijnstudies wordt vergroot. De aanpak is erop gericht om targetvalidatie en functionele genomica in reproductieve biologie-pipelines te informeren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige analyse van de ontwikkeling van kiemcellen en meiotische processen mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van genperturbaties via RNA-interferentie in oocyten.
- Verbetert de mechanistische helderheid voor de selectie van reproductieve targets en risicoreductie.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde preparatie van intacte eierstokken voor daaropvolgende beeldvorming en antilichaamgebaseerde assays.
- Faciliteert reproduceerbare kwantitatieve analyse van cellulaire en subcellulaire structuren.
- Maakt een robuuste beoordeling van genfuncties onder gecontroleerde experimentele omstandigheden mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde modellen voor het bestuderen van kiembaan-epigenetica en cellulaire architectuur.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van reproductieve targets.
- Biedt voorspellende inzichten in geconserveerde mechanismen van de oocytbiologie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit dissectieprotocol is geïntegreerd in de vroege fasen van ontdekking en targetvalidatie, waardoor daaropvolgende ultrastructurele analyses en immunokleuringen mogelijk worden. Het ondersteunt workflows van hypothesetoetsing tot de beoordeling van genfuncties in kiemlijnsystemen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothese-gestuurde studies naar kiemcelspecificatie en meiotische regulatie.
- Screening: Levert assay-klaar eiersteweefsel voor kwantitatieve beeldvorming en antilichaamscreening.
- Analytics: Biedt cellulaire en subcellulaire read-outs met een hoge resolutie voor comparatieve analyse.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen fundamentele ontdekkingen en preklinische evaluatie van reproductieve targets.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar protocol voor diverse studies naar de kiemlijn en genperturbaties.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de validatie van kiemceldoelen.
- Operationele waarde: Standardiseert de workflows voor eierstokdissectie en beeldvorming ten behoeve van de reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go beslissingen mogelijk binnen portfolio's voor reproductieve biologie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van kiemlijndoelen en studies naar genfunctie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de anatomie en dissectietechnieken van planaria.
- Toegang tot transmissie-elektronenmicroscopie en infrastructuur voor immunokleuring is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare weefselpreparatie en beeldvorming.
- Aanpassing kan nodig zijn voor andere ongewervelde modellen of kiemlijn-modelsystemen.
- Beperkt door het geringe aantal en de diepe lokalisatie van oocyten in planaria.
