Pericytencalcium en hemodynamische beeldvorming in de hersenen bij transgene muizen in vivo

De hersenvasculatuur is een complex netwerk van doordringende arteriëlen, haarvaten en oplopende venules. Deze vaten worden omhuld door muurschilderingcellen, zoals ensheathing pericyten, die alfa-gladde spieractine tot expressie brengen, en worden gevonden in de eerste vier takken van penetrerende arteriëlen. We gebruiken Acta2-RCaMP 1.07 transgene muizen om calciumtransiënten in deze cellen te visualiseren, door de expressie van de genetisch gecodeerde calciumindicator RCaMP.

Calcium speelt een sterke rol bij de samentrekking van deze cellen en de controle van de bloedstroom. Capillaire pericyten worden verder stroomafwaarts in het vasculaire netwerk aangetroffen en kunnen in andere transgene modellen worden gelabeld. We richten ons echter op het verwarmen van pericyten in deze methode.

Onze muizen zijn chirurgisch geïmplanteerd met een chronisch schedelvenster dat toegang biedt tot de hersenvasculatuur voor beeldvorming. Hier schetsen we de noodzakelijke voorbereidingsstappen en staartaderinjectie gevolgd door de twee fotonenbeeldvorming en analytische methoden die nodig zijn om pericytencalciumgegevens en informatie over de bloedstroom bij verdoofde dieren te verkrijgen. De volgende items zijn vereist voor een injectie van een staartaderkatheter: insulinespuiten, een stuk PE10-slang van 15 centimeter, naalden van 30 gauge, gaas, zoutoplossing, tang, tang, tang.

We hebben ook een naald met ketamine Xylazine-anesthesie die we vóór beeldvorming zullen injecteren, omdat deze beter is dan isofluraan voor bloedstroommetingen. Breek met behulp van de tang een naald van 30 gauge uit de naaf. Steek de naald voorzichtig in het uiteinde van het stuk PE10-slang dat is bevestigd aan een met zoutoplossing gevulde spuit.

Dit is de katheter voor injectie. Verdoof een muis met isofluraan en breng I-Lube gel aan. Plaats een handschoenveld met warm water op de staart om de laterale ader te verwijden.

Na het reinigen van de staart met ethanol, steekt u de naald in de ader en injecteert u voorzichtig zoutoplossing door de katheter om ervoor te zorgen dat de naald correct wordt geplaatst. Zet de spuit op de katheter om voor een spuit gevuld met fluoresceïne dextran kleurstof. Injecteer de kleurstof langzaam om ervoor te zorgen dat er geen belletjes in de buis komen.

Vervang de dextran spuit door de zoutoplossing spuit en spoel de slang totdat er geen kleurstof meer in de tube zit. Verwijder de naald en druk met gaas. Injecteer ketamine Xylazine anesthesie voor beeldvorming.

Met de muiskop bevestigd op een verwarmingskussen, reinigt u het schedelraam met tandheelkundige applicators. Breng ultrasone gel aan op het venster en focus door de twee fotonen microscoop objectief. Voor beeldvorming van twee fotonen gebruiken we een microscoop met afstembare titanium Sapphire-laser voor fluorescentie, excitatie en fotomultiplicatorbuizen voor emissiedetectie.

Stel in de microscoopsoftware de golflengte in op 990 nanometer om zowel RCaMP als fluoresceïne dextran te prikkelen. Stel vervolgens het laservermogen in door de pockelcelspanning en de PMT-detectorgevoeligheid aan te passen. Live scanning met deze parameters en hogere resolutie, RCaMP-positieve muurschilderingcellen en het fluorescerend gelabelde bloedplasma zijn te zien.

Verwerving van een dieptestapel wordt aanbevolen om pericyten in het vasculaire netwerk goed te lokaliseren. Wanneer gericht op de bovenkant van het weefsel in de buurt van de PO-vaten, stel dit in als het nulpunt en de bovenkant van de Zed-serie stapel, focus dan naar beneden in het weefsel tot de gewenste diepte en stel dit in als de onderkant van de stapel. Het laservermogen moet worden aangepast om toe te nemen naarmate de microscoop dieper door de stapel beweegt.

Open de Zed-serie in beeldverwerkingssoftware, voeg de twee kanalen samen als gekleurde afbeeldingen en scan door de stapel naar interessante pericyten en bloedvaten. Selecteer interessante gebieden die pericyten bevatten en sla de posities op om te helpen bij het opnieuw lokaliseren van deze plekken in toekomstige beeldvormingssessies. Als u een pericytecalciumgebeurtenis wilt verzamelen en verplaatsen, verhoogt u de framesnelheid van de acquisitie tot meer dan 10 frames per seconde.

Stel de duur van de beeldvorming in op 60 seconden en werk het opslagpad bij met een unieke bestandsnaam. Zoom optisch in op het vat om rekening te houden met de lagere resolutie en om de pericyt van dichterbij te bekijken. Verkrijg de T-serie.

Om de bloedvatdiameter en de snelheid van rode bloedcellen te meten, selecteert u lijnscan om een eendimensionale scan met de microscoop te starten. Stel eerst de duur van de scan in milliseconden in. Trek vervolgens een lijn die het vat van belang doorsnijdt en parallel langs het vat beweegt.

Dit genereert een kymograaf van de diameter van het vat aan de linkerkant en strepen van de rode bloedcellen die door het bloedvat aan de rechterkant bewegen. Zie de materialentabel voor een volledige lijst van programma's en pakketten die in dit protocol worden gebruikt. Selecteer eerst interessegebieden met de hand in beeldverwerkingssoftware.

Laad het bestand uit de T-serie, neem het gemiddelde van de stapel en maak een gekleurde afbeelding. Selecteer het gereedschap Veelhoek en schets de zichtbare ensheathing pericytstructuren zoals soma en processen. Geef elke interessante regio een unieke naam en sla ze op als een zip-map die later in de programmeersoftware kan worden geladen.

Open de programmeersoftware en zorg ervoor dat de mappen voor de beeldverwerkingspakketten op het pad staan. Importeer de calcium T-serie in de programmeersoftware en definieer wat er op elk kanaal staat. In dit geval is het een cellulair signaal op kanaal één en bloedplasma op kanaal twee.

Plot de gegevens als een film in de programmeersoftware om visualisatie te vergemakkelijken. Voor het verwijderen van groene fluorescentie uit fluoresceïne dextran dat doorbloedt in het rode RCaMP-kanaal, verwijdert u de kanalen in het beeldverwerkingspakket. Selecteer eerst een gebied dat alleen fluorofoor 1 bevat, in dit geval RCaMP.

Selecteer ten tweede een gebied dat alleen fluorofoor 2, fluoresceïne in het plasma bevat. Selecteer ten slotte een achtergrondgebied dat geen fluorofoor heeft. Dit genereert een spectrale bijdragematrix, die wordt toegepast op elke pixel in elk kanaal.

Het verbetert de lokalisatie van het RCaMP-signaal aanzienlijk, wat de detectie van calciumgebeurtenissen in deze structuren zal verbeteren. Er zijn meerdere manieren waarop de calciumbeeldvormingsgegevens kunnen worden geanalyseerd binnen de beeldverwerkingspakketten. Voer eerst de cellulaire signaleringsanalyse uit op de ongemengde calciumfilm en laad de interessante gebieden uit de zip-map die eerder met de hand uit de pericyten zijn geselecteerd.

Stel de schaalfactor in op één omdat de grootte van de regio's niet hoeft te worden gewijzigd. Genereer na verwerking plots van elke ROY en de genormaliseerde calciumsporen in verschillende kleuren. Als de code de meeste calciumgebeurtenissen in de afzonderlijke sporen niet detecteert, wijzigt u de ingebouwde parameters in het optimalisatievak, zoals het verlagen van de drempel voor de gefilterde gegevens met korte doorgang tot drie keer de standaarddeviatie van de basislijnperiode, wat de eerste 30 frames van de T-reeks zijn.

Om de signalen te detecteren en te classificeren, wordt het genormaliseerde calciumspoor long pass en band pass gefilterd, wat helpt om de gegevens voor amplitude en met schattingen glad te strijken, maar ook om te bepalen of signalen enkele pieken, meerdere pieken of plateaus zijn. Voer de gegevens uit als een CSV-bestand voor verdere statistische analyse. Voer de cellulaire signaleringsanalyse een tweede keer uit op de niet-gemengde calciumfilm en selecteer de geautomatiseerde identificatie van het interessegebied op basis van de activiteit en verandering in fluorescentie in drie dimensies, X, Y en tijd.

Plot de procesresultaten om de geïdentificeerde interessante regio's in verschillende kleuren weer te geven. Als het algoritme geen ROY's detecteert die duidelijk zichtbaar zijn met het oog in de film, wijzigt u de ingebouwde parameters, zoals het verhogen van het Gaussische filter dat de gegevens op tijd gladstrijkt en het verlagen van de drempel voor het vinden van ROY's tot drie keer de standaarddeviatie van de basislijn. Plot de ROYs als een film voor verdere visualisatie.

Voer de gegevens uit als een CSV-bestand voor verdere statistische analyse. Importeer het kymograafgegevensbestand van de lijnscan in de programmeersoftware en definieer wat zich op elk kanaal bevindt. Voer de diameteranalysefunctie uit op de lijnscan, die een vak opent om het gebied te selecteren dat overeenkomt met de diameter in de kymograaf.

Teken een vak buiten de grenzen van de kymograaf fluorescerende fluorescentie, dat overeenkomt met de diameter van het vat. Verwerk deze gegevensklasse om de volledige breedte bij halve maxima voor de diameter van het vat te meten en een plot te genereren. Voer vervolgens de snelheidssnelheid uit op transformatieanalyse en teken een vak binnen de rand van de kymograaf fluorescentie.

Verwerk deze gegevensklasse om de snelheid, flux en lineaire dichtheid van rode bloedcellen te berekenen. Voer de bloedstroomresultaten uit als een CSV-bestand voor verdere analyse. Door cellulaire structuren met de hand te selecteren, kunnen calciumfluctuaties binnen deze regio's worden gedetecteerd, inclusief verschillende soorten signaalpieken, zoals enkele pieken en meerdere pieken, nadat de genormaliseerde calciumsporen laagdoorlaat en banddoorgang gefilterd zijn.

Bovendien worden interessante gebieden geïdentificeerd door actieve pixels te groeperen waar de intensiteit van de fluorescentie in de loop van de tijd verandert met behulp van beeldverwerkingsalgoritmen. Dit kan worden toegepast op elk dynamisch cellulair signaal door de tijd, drempel en ruimtelijke parameters aan te passen aan de verwachte grootte en vorm van het signaal. Het verlagen van de drempel voor signaalidentificatie vindt meer interessante regio's.

Heldere, hemodynamische kymografen worden geanalyseerd om de diameter en de snelheid van rode bloedcellen te meten in bloedvaten in de buurt van ensheathing pericyten. De diameter wordt berekend uit de volledige breedte bij de helft van het maximum van de fluorescentielampen. De snelheid van de rode bloedcellen wordt benaderd door de strepen gemaakt van niet-gelabelde rode bloedcellen, waarbij de hoek wordt ingevoerd in een radontransformatie om de snelheid te berekenen.

Kymografen van slechte kwaliteit, waarbij sprake is van fluorescerende verzadiging, slechte signaal-ruisverhouding of beweging van het beeldvormingsveld, creëert onbetrouwbare plots met foutpunten, aangegeven als rode kruisen, waar gegevens niet kunnen worden bepaald. De kwaliteit van de verkregen gegevens is van cruciaal belang voor een goede uitkomst en het volgen van de stappen die in dit protocol worden beschreven, zorgt voor goede resultaten. In deze video schetsen we de procedure voor gecombineerde calciumbeeldvorming van hersenverwarmende pericyten en bloedstroommetingen door twee fotonenmicroscopie.

Deze technieken zijn nuttig voor het beantwoorden van vragen over de fysiologie van de muurcel en lokalisatie binnen het vasculaire netwerk van de hersenen, maar ze kunnen worden aangepast om calciumtransiënten in elk celtype in de hersenen of een ander orgaansysteem te bestuderen.