Studie van dendritische celontwikkeling door korte haarspeld RNA-gemedieerde gen knockdown in een hematopoëtische stam en voorlopercellijn in vitro
7 maart 2022
Hier bieden we een protocol voor het screenen van potentiële transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dendritische cel (DC) met behulp van lentivirale transductie van shRNA om stabiele knockdown-cellijnen te verkrijgen voor in vitro DC-differentiatie.
Dendritische cellen, of DC's, zijn belangrijke immuuncellen die het aangeboren en adaptieve immuunsysteem met elkaar verbinden. Hoewel DC's heterogeen zijn, helpt deze methode ons te begrijpen welke genen, inclusief transcriptiefactoren, de DC-ontwikkeling kunnen reguleren. Deze techniek biedt een eenvoudige en snelle manier om een gen te identificeren dat dc-ontwikkeling regelt vanuit hun voorloper in vitro.
Onderhoud om te beginnen de vereeuwigde hematopoietische stam- en voorlopercellen of iHSPC's in volledig RPMI 1640-medium, aangevuld met 100 nanogram per milliliter FLT3-ligand en één micromolair bèta-oestradiol. Voor lentivirale transductie, plaat de iHSPC's in 12 putplaten met een dichtheid van één keer 10 tot de vijfde cellen per put en één milliliter volledig medium met het FLT3-ligand, bèta-oestradiol en polybreen. Voeg vervolgens het lentivirus toe dat het korte haarspeld-RNA in elke put draagt bij een veelvoud aan infecties van 100.
Draai vervolgens de plaat gedurende 90 minuten op 1100 keer g en 37 graden Celsius en incubeer vervolgens de geïnfecteerde cellen 's nachts bij 37 graden Celsius. Verwijder de volgende dag het polybreen door de cellen in centrifugatie in 15 milliliterbuizen te verzamelen, na het vervangen van de media door vers volledig medium met het FLT3-ligand en bèta-oestradiol. Voeg na nog eens 24 uur zes microgram per milliliter puromycine toe aan het medium om de geïnfecteerde cellen te selecteren.
Vervang het selectiemedium om de drie dagen en onderhoud de cellen gedurende ten minste één week om de stabiel getransduceerde iHSPC's uit te breiden. Genereer en onderhoud stabiele knockdown iHSPC's voor LacZ, Tcf4 en Id2 in volledig medium aangevuld met het FLT3 ligand en bèta-oestradiol. Om in vitro differentiatie te initiëren, verzamel je de ongedifferentieerde iHSPC's in 15 milliliterbuizen en pellet de cellen door centrifugatie.
Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en was de cellen twee keer met 10 milliliter PBS. Na de tweede wasbeurt, resuspend de cellen in volledig medium dat alleen het FLT3-ligand bevat en zaai ze vervolgens met een dichtheid van twee keer 10 tot de vijfde verkoopt per milliliter in een 12-putplaat. Voeg na drie dagen een milliliter vers volledig medium toe dat het FLT3-ligand bevat.
Na nog eens twee dagen gaat u verder met het analyseren van de gedifferentieerde cellen door middel van flowcytometrie. Voor flowcytometrische analyse pipetteer je de cellen twee tot drie keer op en neer in de plaat en verzamel je de cellen vervolgens in buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buizen en gooi het supernatant weg voordat u de cellen resuspendeert in 50 microliter faxbuffer.
Voeg vervolgens 50 microliter anti-CD16 bij 32 hybridoma supernatant toe en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten op ijs. Voeg vervolgens fluorescerende kleurstof-geconjugeerde antilichamen rechtstreeks toe aan de cellen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker. Was na incubatie de cellen met één milliliter faxbuffer en centrifugeer het monster.
Na centrifugeren de cellen in 100 microliter faxbuffer en analyseer de monsters door middel van flowcytometrie. Na korte haarspeldbocht RNA-gemedieerde knockdown van LacZ, Tcf4 en Id2 in iHSPCS, toonde bevestiging van knockdown-efficiëntie door RTQ-PCR aan dat de expressie van Tcf4 en Tcf4 knockdown iHSPC's was verminderd in vergelijking met die in LacZ knockdown iHSPC's. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor Id2-expressie in de Id2 knockdown iHSPC's.
Na het kweken van LacZ knockdown iHSPC's gedurende vijf dagen, was de frequentie van CD11c-positieve cellen, die de dendritische celpopulatie vertegenwoordigen, ongeveer 95%. Verdere analyse van CD11c-positieve dendritische cellen afgeleid van de LacZ knockdown iHSPC's onthulde dat 70% conventionele dendritische cellen waren, terwijl 22% plasmacytoïde dendritische cellen waren. De Tcf4 knockdown iHSPC's genereerden een significant lager percentage plasmacytoïde dendritische cellen dan de LacZ knockdown controleert.
Daarentegen genereerden de Id2 knockdown iHSPC's een significant lager percentage conventionele dendritische cellen dan de LacZ knockdown-controles, maar een hoger percentage plasmacytoïde dendritische cellen. Spininfecties verhogen de transductie-efficiëntie van lentivirus-dragend shRNA in de iHSPC's. Deze techniek richt zich op de rol van transcriptiefactoren en vergemakkelijkt de studie van andere genen in cytokine-signaleringstransductie of metabolisme, die waarschijnlijk betrokken zijn bij dc-ontwikkeling.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het screenen van transcriptiefactoren die de ontwikkeling van dendritische cellen (DC) beïnvloeden via lentivirale transductie van shRNA. De methode maakt de creatie van stabiele knockdown-cellijnen mogelijk voor de in vitro differentiatie van DC's.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Transcriptionele regulatie
Achtergrond
- Dendritische cellen zijn essentieel voor de koppeling tussen de aangeboren en adaptieve immuniteit.
- Inzicht in de ontwikkeling van dendritische cellen kan nieuwe inzichten verschaffen in immuunresponsen.
- Deze studie richt zich op het identificeren van genen die de differentiatie van dendritische cellen reguleren.
- De methode maakt gebruik van geïmmortaliseerde hematopoëtische stam- en progenitorcellen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het screenen van transcriptiefactoren bij de ontwikkeling van DC's.
- Het creëren van stabiele knockdown-cellijnen voor functionele studies.
- Het faciliteren van in vitro differentiatie van DC's uit progenitorcellen.
Gebruikte methoden
- Onderhoud van iHSPCs in volledig RPMI 1640-medium.
- Supplementatie met FLT3-ligand en bèta-estradiol.
- Lentivirale transductie van iHSPCs met shRNA.
- Gebruik van polybrene om de transductie-efficiëntie te verhogen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van stabiele knockdown-cellijnen.
- Identificatie van transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van DC's.
- Demonstratie van in vitro differentiatiecapaciteiten.
- Inzichten in de genregulatie van de ontwikkeling van immuuncellen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van de ontwikkeling van DC's.
- Het kan worden gebruikt om belangrijke regulerende genen in de immunologie te identificeren.
- Deze aanpak kan het begrip van immuunresponsen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode maakt systematische analyse mogelijk van de functie van transcriptiefactoren bij de lineage-commitment van dendritische cellen, wat targetvalidatie ondersteunt in discovery-programma's met een focus op immunologie. Door genetische perturbatie te koppelen aan de fenotypische output in een reproduceerbaar in vitro-systeem, biedt het mechanische risicoreductie voor hypothesen over targets in een vroeg stadium. De aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen bij het prioriteren van immunomodulerende targets voordat er wordt overgegaan tot arbeidsintensieve inspanningen voor lead-identificatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele analyse van transcriptiefactoren als potentiële therapeutische targets in de ontwikkeling van dendritische cellen mogelijk.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbaar platform voor knockdown-screening met behulp van lentivirale shRNA-aflevering in geïmmortaliseerde hematopoëtische progenitoren.
- Voorspellende waarde: Koppelt target-modulatie aan de output van dendritische cel-subsets, wat go/no-go-beslissingen op basis van data over lineage skewing ondersteunt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve flowcytometrie-uitlezingen van CD11c-positieve cellen en de distributie van subsets (cDC vs pDC) na knockdown van transcriptiefactoren.
- Operationele waarde: Vestigt een gestandaardiseerde differentiatie-assay met gedefinieerde cytokonecondities (FLT3-ligand, bèta-estradiol) en selectie via puromycine.
- Klaarheid van de assay: Produceert stabiele knockdown-cellijnen die geschikt zijn voor herhaald gebruik in compound-screening of studies naar pathway-modulatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Modelleert vroege specificatie van dendritische cellen uit progenitoren, wat bijdraagt aan biomarkerstrategieën gekoppeld aan transcriptiefactornetwerken.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt de rol van Id2 bij het bevorderen van het lot van conventionele dendritische cellen en Tcf4 bij het ondersteunen van de ontwikkeling van plasmacytoïde dendritische cellen.
- Preklinische afstemming: Ondersteunt de evaluatie van targets die invloed hebben op de differentiatie van immuuncellen, relevant voor programma's voor vaccinumhulslsels of auto-immuniteit.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen de fase van discovery biology en maakt het mogelijk om hypothesen over targets te testen voorafgaand aan de ontwikkeling van assays voor lead-identificatie, waarbij de data bijdragen aan de selectie van preklinische kandidaten voor immunomodulatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de mechanistische analyse van transcriptionele regulatoren die de commitment van hematopoëtische progenitoren aan de dendritische cel-lijn bepalen.
- Assayontwikkeling: Genereert reproduceerbare, kwantitatieve immunofluorescentie- en flowcytometrie-eindpunten om de differentiatie-efficiëntie en de subsetdistributie te monitoren.
- Analytica: Levert kwantificeerbare resultaten (percentage CD11c+, cDC, pDC) die vergelijking tussen knockdown-condities mogelijk maken en de statistische evaluatie van de impact van het doelwit ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege progenitor-differentiatie aan downstream immuunfuncties, wat relevant is voor het modelleren van responsen in infectie- of tolerantiesituaties.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van aanvullende genen in cytokinesignalering, metabolisme of transcriptionele netwerken die de ontwikkeling van dendritische cellen beïnvloeden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door de knockdown van transcriptiefactoren te koppelen aan meetbare veranderingen in de generatie van dendritische cel-subsets.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van differentiatie- en read-outprotocollen tussen laboratoria mogelijk via gedefinieerde mediumcondities en selectiemarkers.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de selectie van immunomodulerende targets door vroegtijdig functioneel bewijs te leveren voor lineage-specifieke effecten.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van hun invloed op beslissingen over het lot van dendritische cellen, wat bijdraagt aan een efficiënte toewijzing van middelen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in lentivirale transductie, kweek van hematopoëtische cellen en flowcytometrie.
- Afhankelijk van toegang tot lentivirale shRNA-bibliotheken, puromycine-selectie en cytokinerijke media (FLT3-ligand, bèta-estradiol).
- Maakt standaardisatie van de transductie-efficiëntie (bijv. via spin-infectie) en de selectieduur voor de generatie van stabiele knockdown noodzakelijk.
- Omvat optimalisatie van de differentiatietiming en antilichaampanels voor nauwkeurige identificatie van dendritische cel-subsets via flowcytometrie.
- Beperkt tot in vitro modellering; bevindingen vereisen validatie in primaire humane of muizen-systemen voor translationele relevantie.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
