Grootschalige multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): richtlijnen voor monstervoorbereiding en normalisatie

Het onderzoeken van een grotere populatie komt met een machine-gedreven variatie, die hierdoor de werkelijke variatie die voortkomt uit natuurlijke diversiteit. Hier demonstreren we een methode om de technische variatie voor downstream integratieanalyse te verminderen. De voordelen van deze techniek omvatten een op gezichtsscheiding gebaseerde extractie, waarbij de analyse van verschillende metabolieten op het respectieve analytische platform wordt uitgevoerd, terwijl de systemische fout wordt verwijderd en de biologische variantie wordt gehandhaafd.

Zodra de genotypische en fenotypische informatie is verkregen, kan deze methode worden toegepast op elke diverse natuurlijke populatie in elk koninkrijk van het leven. Om te beginnen, neem je oogstbuizen van 20 milliliter, voeg je twee metalen kralen met een diameter van vijf millimeter en twee acht millimeter toe voor homogeniseren en label je de buizen. Vul vervolgens een dewar met vloeibare stikstof, onmiddellijk na het snijden van verse blad- en wortelweefselmonsters in vloeibare stikstof door flash freezing.

Bewaar de geoogste biologische monsters op 80 graden celsius voor verdere verwerking. Koel de buishouders voor in vloeibare stikstof. Maal vervolgens de weefsels op 25 hertz gedurende één minuut om een homogeen poeder te verkrijgen.

Herhaal het bevriezen en malen als het weefsel niet homogeen is gemalen. Weeg 50 milligram vers plantmateriaal in een voorgekoelde gelabelde microcentrifugebuizen van twee millimeter veilig slot, zodat plantmateriaal bevroren blijft tijdens het weegproces. Voeg een milliliter voorgekoeld extractiemengsel 1 tot 50 milligram aliquot van het monster toe en vortex de buis kort voordat u het op ijs houdt.

Incubeer de monsters op een orbitale shaker op 800 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, gevolgd door ultrasoonapparaat in een ijsgekoeld ultrasoonapparaatbad gedurende 10 minuten. Gebruik een meerkanaals pipet om ook 500 microliter extractiemengsel aan de monsters toe te voegen en meng de extracten door middel van korte vortexing en centrifugeer het mengsel vervolgens op 11, 200 keer G gedurende 5 minuten bij vier graden Celsius. Breng na centrifugatie 500 microliter van de gescheiden bovenste lipidebevattende fase over naar een vooraf gelabelde 1,5 milliliter veilige slotmicrocentrifugebuis, verwijder de rest van de bovenste fase.

In afzonderlijke, 1,5-milliliter veilige slotmicrocentrifugebuizen dragen 150 microliter van de onderste semipolaire fase vier GCMS en 300 microliter van de semipolaire fase vier U-H-P-L-C MS-analyse over. Gebruik een vacuümconcentrator voor oplosmiddelverdamping om alle geëxtraheerde fracties te concentreren zonder verhitting en bewaar de gedroogde fracties bij 20 graden Celsius. Om het monster voor te bereiden op ultrahoge prestaties, worden vloeistofchromatografie, massaspectrometrie of H-P-L-C MS de gedroogde semipolaire fracties opnieuw gesuspendeerd in 180 microliter van een mengsel van methanol en water.

Soniceer vervolgens de semipolaire fase gedurende 2 minuten, gevolgd door centrifugatie op 11, 200 keer G gedurende één minuut. Breng na centrifugatie 90 microliter van het supernatant over naar een glazen injectieflacon en injecteer twee microliter van de extracten in het gegoten LCMS-monster. Voer de metabolietfractionering uit op een omgekeerde fase C18-kolom die op 40 graden Celsius wordt gehouden, en een stroom van 400 microliter per minuut met geleidelijke veranderingen van effluent A en B, verkrijg de massaspectra van de test blanco en kwaliteitscontrolemonsters in negatieve ionisatiemodus met een massabereik van 102 1500 massa/ladingsverhouding.

Voer voor de semipolaire metabolietenmonsters een gepoold QC-monster uit in gegevensafhankelijke tandemmassaspectrometrie in negatieve en positieve ionisatiemodi. Gebruik de verkregen massaspectra voor de annotatie. Voer de normalisatie van de gegevensset uit door de verdeling van de interne standaard te controleren.

Normaliseer de gegevens door te corrigeren voor het signaal van enkele of meerdere interne standaarden. Corrigeer vervolgens de piekintensiteiten die zijn verkregen uit het chromatogram over het exacte monstergewicht. Voor het corrigeren van de intensiteitsdrift over multi-batch-series, voert u op QC gebaseerde correctiemethoden uit, zoals lokaal geschatte scatterplot-smoothing met behulp van R.Voordat u genoombrede associatiestudies of GWAS uitvoert, filtert u de genotypische gegevens voor kleine allelfrequenties van minder dan 5% en een ontbrekend percentage van meer dan 10% met behulp van kwast.

Dit voorkomt laagfrequente bias. Om de vertekening afkomstig van de omgevingsfactoren te elimineren, gebruikt u het R-pakket LME vier en berekent u de beste lineaire, onbevooroordeelde voorspellingen of blops voor elk genormaliseerd kenmerk over de experimentele herhalingen. Gebruik blops van elke functie afzonderlijk om GWAS uit te voeren met het rMVP-pakket in R.De lipidomische gegevens over verschillende veel voorkomende bonensoorten worden weergegeven op basis van de ruwe basispiekchromatogrammen van twee QC-monsters uit verschillende batches.

Een variatie in de signaalintensiteiten werd waargenomen voor bepaalde lipidenklassen. De systeemfout werd duidelijker toen de belangrijkste componentanalyse werd uitgevoerd op de onbewerkte gegevens. De normalisatieprocedure, inclusief de lokaal geschatte scatterplot smoothing, leidde tot de clustering van de QC-monsters.

Bij het ontleden in de afzonderlijke clusters werden machinegestuurde fouten in batch zeven en acht duidelijk voorafgaand aan normalisatie, die werd gecorrigeerd. De post-genormaliseerde en getransformeerde individuele metabolomische clusters werden gebruikt voor GWAS, wat resulteerde in verschillende kenmerkmarkerassociaties. In de representatieve analyse worden verschillende samengestelde klassen in verschillende kleuren gemarkeerd, terwijl de markers geassocieerd met meerdere samengestelde klassen worden aangegeven met het dichtstbijzijnde gen.

Datanormalisatie en -transformatie zijn een van de belangrijkste stappen. Zorg ervoor dat de juiste correctie is uitgevoerd om te corrigeren voor systeemfouten en zorg voor normaliteit in de verdeling. Door de correctie voor de analytische variatie uit te voeren, kunnen verschillende integratiebenaderingen worden uitgevoerd, zoals metabole correlatieanalyse en integratie in fenomische gegevens om licht te werpen op complexe eigenschappen.