Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Deze methoden maken een snelle beoordeling mogelijk of een experimentele manipulatie, ziekteveroorzakend eiwit of RNA synaptische processen kan beïnvloeden en of therapeutische verbindingen de functie kunnen herstellen. Deze technieken bieden een betrouwbare uitlezing van de synaptische functie van een groep neuronen in een relatief korte periode in vergelijking met elektrofysiologie. Dit protocol kan worden toegepast op elke ziekte van neuronale ontwikkeling of degeneratie.

Dit werkt goed voor primaire neuronale knaagdierculturen en voor neuronen die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Optimaliseer om te beginnen de instellingen voor beeldacquisitie met behulp van confocale imaging-acquisitiesoftware. Houd de belichtingstijd van het excitatievermogen, de detectorwinst en de framesnelheid constant voor alle monsters.

Voor time-lapse-beeldvorming selecteert u een beeldverhouding van 512 bij 512 en een framesnelheid van twee afbeeldingen per seconde om kleurverbleking te minimaliseren. Selecteer vervolgens de fluorescentie-excitatie-, dichroïsche en emissiefiltercombinaties voor GCaMP zes M/GCaMP drie met Fitzy en stearoylkleurstof met Trixi. Om Z-drift tijdens time-lapse-beeldvorming te voorkomen, gebruikt u de perfecte focusfunctie van de confocale imaging-acquisitiesoftware.

Selecteer vervolgens het tabblad Tijd in het deelvenster voor het verwerven van afbeeldingen. Stel voor fase één het interval in van 500 milliseconden en de duur drie tot vijf minuten. En voor fase twee, stel interval 500 milliseconden in en duur, vijf minuten.

Om vervolgens het zwaartekrachtperfusieapparaat voor kunstmatig hersenvocht of ACSF samen te stellen, laadt u de acsf-buffer met hoog kaliumchloride in een spuit van 50 milliliter aan de bovenkant van het apparaat en stelt u de stroomsnelheid in op één milliliter per minuut. Laad vervolgens een glazen schaal van 35 milliliter met neuronen op het confocale beeldvormingsstadium met het uiteinde van de perfusieslang aan de rand van de schotel en kies het veld voor beeldvorming. 48 uur na transfectie, incubateer de primaire corticale of motorneuronen in een lage kaliumchloride ACSF-buffer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius.

Verwijder vervolgens de buffer door aspiratie en laad met behulp van een pipet de neuronen in het donker op een petrischaaltje met glazen bodem gevuld met ACSF met 50 millimolar kaliumchloride en 10 Micro molaire styrylkleurstof. Verwijder na vijf minuten de belastingsoplossing en baad de neuronen gedurende 10 minuten in een acsf-buffer met een laag kaliumchloride bij 37 graden Celsius om de niet-specifieke kleurstofbelasting te elimineren. Plaats de schaal vervolgens op het beeldvormingsstadium van de omgekeerde confocale microscoop en observeer de cellen onder een 20 keer luchtdoel of 40 keer olie-onderdompelingsobjectief.

Prikkel de staalkleurstof met behulp van een 546 nanometer laser en verzamel emissie met behulp van een 570 tot 620 nanometer bandpass filter. Nadat u het beeldveld hebt geselecteerd en de perfecte focus hebt ingeschakeld, neemt u een enkel stilstaand beeld met heldere veld-, Trixi- en fluorescentiemarkerkanalen om neuronale grenzen te markeren. Start vervolgens Run Now in de acquisitiesoftware en voer de basale opname gedurende drie tot vijf minuten uit om variaties in kleurintensiteit uit te sluiten.

Direct bij de overgang naar fase twee, activeert u de aan-knop voor het perfusiesysteem en perfuseert u constant 50 millimol kaliumchloride naar de neuronen om het lossen van kleurstof te vergemakkelijken. Voer de opnames gedurende vijf minuten uit en activeer vervolgens de uitschakelaar voor het perfusiesysteem. Sla het experiment later op voor gegevensanalyse met behulp van de confocale software.

48 uur na transfectie met GCaMP zes M, incamineer de primaire knaagdier corticale neuronen met een laag kaliumchloride ACSF gedurende 15 minuten. Monteer vervolgens de schotel op het beeldvormingsplatform en visualiseer GCaMP zes M fluorescentie met behulp van een Fitzy-filter en een 20 keer of 40 keer objectief. Nadat u het beeldveld hebt geselecteerd en de perfecte focus hebt ingeschakeld, maakt u een enkel stilstaand beeld met brightfield-, Fitzy- en fluorescentiemarkerkanalen om neuronale grenzen te markeren.

Start vervolgens Run Now in de acquisitiesoftware en voer de basale opname gedurende drie tot vijf minuten uit. Perfuseer vervolgens ACSF met 50 millimolair kaliumchloride naar de neuronen zoals eerder aangetoond en neem gedurende vijf minuten op. Wanneer de beeldacquisitie stopt, slaat u het experiment op en gaat u verder met gegevensanalyse met behulp van de confocale software.

Voor beeldanalyse opent u de time-lapse-afbeeldingen in de confocale software en lijnt u de afbeeldingen uit door te klikken op Afbeelding, gevolgd door verwerking, gevolgd door het huidige document uitlijnen en vervolgens Uitlijnen op het eerste frame. Selecteer interessante gebieden langs de neurieten met behulp van de ROI-selectietool en markeer ook een ROI die de fluorescentie-intensiteit op de achtergrond vertegenwoordigt. Start vervolgens de meetfunctie vanaf het tijdmeetpaneel om ruwe fluorescentie in de loop van de tijd te meten voor de geselecteerde ROI's.

Na de meting exporteert u de ruwe fluorescentie-intensiteiten naar de spreadsheetsoftware. Gekweekte rat primaire corticale neuronen geladen met styryl kleurstof worden hier getoond. De specificiteit van de kleurstofbelasting werd bepaald door co-labeling met synaptische blaaskelmarker synaptophysine en de meerderheid van steriele kleurstofpositieve puncta zijn co-positief voor deze marker.

De analyse van de ruwe intensiteitswaarden over de gehele beeldvormingsperiode laat zien dat synaptofysine en intensiteit constant blijven, terwijl de intensiteit van de styrylkleurstof afneemt na stimulatie. Voor groene fluorescerende eiwit getransfecteerde controleneuronen resulteerde succesvolle synaptische vesikelafgifte in het opvallende verlies van kleurstoffluorescentie bij hoge kaliumchloridedepolarisatie. Deze representatieve video toont een neuron dat selectief styrylkleurstof lost in een nieuw rechtergebied na stimulatie.

Daarentegen, in neuronen getransfecteerd met een C negen ORF 72 gekoppeld aan kleurstofpeptide herhaling construct tot GA 50, wordt verminderde synaptische transmissie vertegenwoordigd door behouden kleurstoffluorescentie, zelfs na hoge kaliumchloridedepolarisatie. Representatieve fluorescentiebeelden van corticale neuronen getransfecteerd met GCaMP zes M voor en na kaliumchloride depolarisatie worden hier getoond. Verhoogde fluorescentiewaarden en corticale neuronen getransfecteerd met GCaMP zes M duiden op calciuminvoer in neurieten na kaliumchloride geïnduceerde depolarisatie.

Aan het einde van de baseline-opnameperiode drukten de neuronen GCaMP zes M uit met een lage fluorescentie. Een dramatische fluorescentietoename wordt dan waargenomen aan het begin van de stimulatie. Zorg ervoor dat fluorescentiebasismetingen voor styrylkleurstof en GCaMP stabiel zijn.

Gebruik altijd de perfecte focus om beelddrift te voorkomen, wat de verwerking van post-beeldgegevens een uitdaging zou maken. Verder kweken van neuronen wordt niet aanbevolen, omdat gerechten tijdens de overvloed aan lucht worden blootgesteld. Immunokleuring of extractie van eiwit of RNA kan echter potentiële oorzaken van synaptische veranderingen beoordelen.