Name: Bioluminescente optogenetica 2.0: Bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer bioluminescente optogenetica om cellulaire functies te besturen zonder weefselschade. Deze methode activeert fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo met luciferine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken onze collega's voor de constructies, met name A. Ting voor de Ca-FLARE protease, transcriptiefactor en reporter (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwon voor TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 en NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker voor CRY-GalΔDD (B1013) en CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), M. Walsh voor pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene # 33020), K. Gardner voor VP-EL222 en C120-Fluc, en A. Cetin en H. Zeng voor het beschikbaar maken van iCreV vóór publicatie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), de W.M. Keck Foundation en de Swedish Research Council aan A.B. (2016-06760).

Alle procedures in de huidige studie werden uitgevoerd met behulp van door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) goedgekeurde protocollen voor het hanteren van dieren aan de Central Michigan University, MI.
1. Bioluminescentie activatie van fotosensorische eiwitten in vitro
<ol><li>Constructies<ol>
<li>Selecteer een luciferasesequentie of luciferase-fluorescerende eiwitfusiesequentie die zal resulteren in de expressie van een lichtzender die licht produceert van een golflengte die overeenkomt met de te activeren fotoreceptor. OPMERKING: Blauw licht-emitterende luciferasen, zoals Gaussia luciferase varianten of NanoLuc, kunnen bijvoorbeeld worden gecombineerd met blauw licht-gevende fotoreceptoren zoals CRY / Ca2 + - en integrine-bindend eiwit (CIB), LOV of Vivid (VVD).</li>
		<li>Indien nog niet beschikbaar bij andere onderzoekers of plasmideafzettingen, gebruik dan standaard moleculair biologische technieken om het DNA te klonen tot een plasmide van zoogdierexpressie. OPMERKING: De keuze van promotors wordt bepaald door de noodzaak om een sterke en constitutieve uitdrukking van de lichtgevende module te bieden, zoals die van de CAG- en CMV-promotors.</li>
		<li>Gebruik voor de eerste studies afzonderlijke plasmiden voor co-transfectie van de lichtstraler en de lichtsensor. Genereer fusie-eiwitten van de twee moieties indien nodig en voor latere studies.</li>
		<li>Verkrijg hoogwaardige plasmide-DNA's met behulp van mini-, midi- of maxiprep-kits volgens de protocollen van de fabrikant.</li>
	</ol></li>
	<li>Celkweek en transfectie OPMERKING: HeLa-cellen en HEK293-cellen worden als voorbeelden gebruikt in dit protocol.<ol>
<li>Plaatcellen in formaten en getallen volgens het gewenste eindgebruik. OPMERKING: Specifieke voorbeelden zijn te vinden in tabel 2. Celdichtheid op het moment van plating zal bepalen hoe snel cellen kunnen worden getransfecteerd.<ol>
<li>Voor het beoordelen van bioluminescentie-geactiveerde transcriptie door fluorescentiemicroscopie, plaat HEK293-cellen op poly-D-lysine (PDL) -gecoate 12 mm coverslips geplaatst in 24-well schotels.</li>
			<li>Voor het beoordelen van bioluminescentie-geactiveerde transcriptie door het meten van lichtemissie van een orthogonale reporter luciferase in een luminometer, plaat HeLa cellen in eerste instantie in 6- of 12-well schotels voor transfectie, maar opnieuw plate ze na transfectie (zie stap 4).</li>
			<li>Als herhaalde bioluminescentiestimulatie zal worden uitgevoerd in live-cell imaging kamers, selecteert u coverslips van de juiste grootte en plaatst u deze in multi-well platen van de juiste grootte (24-well platen voor 12 mm coverslips; 12-well platen voor 15 mm en 18 mm coverslips). Zaai de cellen bovenop de coverslips met behulp van de celnummers die zijn gespecificeerd in tabel 2. Als het geselecteerde celtype niet goed hecht aan het kweekoppervlak, plaats de cellen dan op PDL-gecoate schotels.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voer transfectie uit door lipofectie volgens de aanbeveling van de fabrikant of gebruik een transfectiemethode die geschikt is voor het geselecteerde celtype. OPMERKING: Tabel 3 beschrijft transfectie-experimenten voor twee verschillende fotoreceptoren, EL222 en CRY2 / CIB, en hun respectieve reporter plasmiden, naast verschillende lichtgevende eiwitten. De verhoudingen van de verschillende plasmiden werken goed voor de geselecteerde voorbeelden, maar moeten worden geoptimaliseerd voor elk paar lichtzender / lichtsensor.</li>
		<li>Plaats de cellen na transfectie in een incubator die volledig lichtdicht is (figuur 1).</li>
		<li>Afhankelijk van het gewenste eindgebruik, gebruikt u de cellen voor bioluminescentiestimulatie de volgende dag in hun oorspronkelijke putten / gerechten, of verguld ze 3-4 uur na lipofectie opnieuw. Voor het lezen van transcriptie van een firefly luciferase reporter gen in een luminometer, re-plate de cellen in witte 96-well platen. OPMERKING: Voer alle manipulaties uit in een lichtdichte ruimte in een laminaire stroomkap verlicht door rood licht (figuur 2).<ol>
<li>Was de getransfecteerde cellen eenmaal met Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
			<li>Voeg het minimale volume van een trypsiniserend reagens toe aan de putten (24-well: 100 μL; 12-well: 150 μL; 6-well: 300 μL) en incubeer de cellen gedurende 3 min bij 37 °C.</li>
			<li>Voeg kweekmedium toe om een celconcentratie te bereiken die de juiste celdichtheid oplevert voor de volgende platingstap (bijvoorbeeld cellen resuspend in een 24-well in een eindvolume van 1,2 ml voor plating in 10 putten van een 96-well plaat; resuspend cellen in een 12-well in een eindvolume van 2,4 ml voor plating in 20 putten van een 96-well plaat). Pool de getransfecteerde cellen uit verschillende putten, afhankelijk van het aantal putten dat uiteindelijk nodig is.</li>
			<li>Plaats de getransfecteerde cellen in hun uiteindelijke formaat en breng de platen terug naar de lichtbeschermde incubator.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bioluminescentie activatie in vitro
	<ol><li>Bereid het luciferase substraat (luciferine).<ol>
<li>Bereid 50 mM-voorraden door 5 mg gelyofiliseerd coelenterazine (CTZ) op te lossen in 250 μL van het specifieke oplosmiddel. Zorg ervoor dat alle CTZ langs de wanden van de injectieflacon is opgelost door pipetteren of vortexen. Bescherm de injectieflacon tegen direct licht.</li>
			<li>Bereid 50 μL aliquots in zwarte microcentrifugebuizen van 0,5 ml en bewaar bij -80 °C voor toekomstig gebruik. OPMERKING: CTZ opgelost in oplosmiddel bevriest niet bij -80 °C. Aliquots kunnen meerdere keren worden verwijderd uit en teruggebracht naar de vriezer voor het maken van werkoplossingen, zolang de blootstelling aan licht en kamertemperatuur tot een minimum wordt beperkt.</li>
		</ol></li>
		<li>Enkele bioluminescentie lichtstimulatie OPMERKING: Alle manipulaties worden uitgevoerd in een lichtdichte ruimte in een laminaire stromingskap verlicht door rood licht (figuur 2).<ol>
<li>Bereid een werkoplossing van luciferine in celkweekmedium (DMEM of NeuroBasal). Pas de concentratie van luciferine zodanig aan dat de uiteindelijke concentratie 100 μM is. Bereid alle verdunningen van CTZ in medium kort voordat u aan de cellen toevoegt, omdat CTZ in de loop van de tijd oxideert. OPMERKING: Als het volledige volume medium wordt vervangen, is de werkoplossing 100 μM. Als luciferine-bevattend medium aan de cellen wordt toegevoegd, zal de concentratie hoger zijn door de verdunningsfactor (bijvoorbeeld, het toevoegen van 50 μL medium met 300 μM luciferine aan 100 μL medium in de put zal resulteren in een 1:3 verdunning en dus in een 100 μM eindconcentratie luciferine).</li>
			<li>Voeg luciferine-bevattend medium toe aan de cellen en incubeer voor de gewenste duur van lichtstimulatie. OPMERKING: Dit kan zo kort zijn als 1 min of zo lang als 15 min en kan zelfs korter of langer zijn. De tijdsduur voor het verlaten van het luciferine-bevattende medium op de cellen hangt af van de halfwaardetijd en kinetiek van de geselecteerde luciferase-luciferine combinatie.</li>
			<li>Controleer de lichtuitstraling bij 100 μM uiteindelijke luciferineconcentratie met het oog na het uitschakelen van het rode licht; wacht een paar seconden totdat de ogen zich hebben aangepast aan volledige duisternis. Documenteer de lichtuitstraling door een foto te maken (zelfs met een mobiele telefoon).</li>
			<li>Beëindig de lichtstimulatie door het luciferine-bevattende medium te verwijderen en te vervangen door kweekmedium. Afhankelijk van de gevoeligheid van de experimenten, was de cellen met kweekmedium een of twee keer na het verwijderen van het luciferine-bevattende medium om alle luciferine te elimineren. Als de cellen zich niet goed hechten aan het kweekoppervlak, plaats ze dan op PDL-gecoate gerechten om te voorkomen dat de cellen tijdens het wassen verloren gaan.</li>
			<li>Breng de cellen gedurende 16-24 uur terug naar de lichtbeschermde incubator.</li>
		</ol></li>
		<li>Herhaalde bioluminescentie lichtstimulatie OPMERKING: Alle manipulaties worden uitgevoerd in een kamer die lichtdicht kan worden gemaakt en kan worden verlicht door rood licht.<ol>
<li>Stel de live-cell imaging chamber in. Maak een lichtdicht compartiment rond de live-cell imaging microscoop met behulp van een doos en zwarte plastic vellen of zwarte gordijnen (figuur 3). Bedek alle lichtbronnen die aanwezig zijn in het lichtdichte compartiment en de kamer (bijv. LED-indicatoren op de microscoop of instrumenten).</li>
			<li>Stel het perfusiesysteem in met de gewenste oplossing voor inname en de buitenhaven van de kamer die leidt naar een afvalcontainer. OPMERKING: De beeldvormingsoplossing kan bijvoorbeeld Tyrode's Solution (natriumchloride (124 mM), kaliumchloride (3 mM), HEPES (10 mM), calciumchloridedihydraat (2 mM), magnesiumchloridehexahydraat (1 mM), D-glucose (20 mM)) zijn.</li>
			<li>Bereid een werkoplossing van luciferine in de beeldvormingsoplossing. Aliquot in evenveel microcentrifugebuizen als het aantal herhaalde stimulaties. Pas de concentratie van het luciferine zodanig aan dat de uiteindelijke concentratie in de beeldvormingskamer 100 μM is.</li>
			<li>Plaats een coverslip met getransfecteerde cellen in de kamer.</li>
			<li>Terwijl u de pomp draaiende houdt, verwijdert u de inlaatbuis van de pomp uit het inlaatbeker en dompelt u deze snel onder in de luciferine-oplossing, waarbij de overgangstijd zo kort mogelijk blijft om luchtleemte in de buis te voorkomen.</li>
			<li>Zodra de luciferine-oplossing is opgenomen, plaatst u de inlaatbuis terug in het inlaatbeker. Herhaal dit proces zo vaak als nodig is en met tussenpozen van enkele minuten tot uren, afhankelijk van het fysiologische patroon waaraan de cellen moeten worden blootgesteld.</li>
			<li>Breng de cellen gedurende 16-24 uur terug naar de lichtbeschermde incubator voor transcriptie, of voor de tijdsduur dat het effect van lichtstimulatie moet worden beoordeeld.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Bioluminescentie activatie van fotosensorische eiwitten in vivo
<ol><li>Constructies<ol>
<li>Selecteer een luciferasesequentie of luciferase-fluorescerende eiwitfusiesequentie die zal resulteren in de expressie van een lichtzender die licht produceert van een golflengte die overeenkomt met de te activeren fotoreceptor.</li>
		<li>Gebruik standaard moleculair biologische technieken om het DNA te klonen tot een pAAV-plasmide, indien nog niet beschikbaar bij andere onderzoekers of plasmideafzettingen.</li>
		<li>Kies sterke promotors voor de expressie van de lichtgevende modules, zoals CAG of CMV.</li>
		<li>Gebruik standaardbenaderingen voor het bereiden van virale voorraden met een hoge titer6 of laat virale vectoren commercieel bereiden.</li>
		<li>Gebruik voor de eerste studies afzonderlijke virale vectoren voor co-transductie van de lichtstraler en de lichtsensor om indien nodig de verhoudingen van de verschillende componenten aan te passen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AAV-transductie<ol>
<li>Injecteer het doelorgaan van het proefdier met virale vectoren van de lichtstraler, lichtsensor en reporter analoog aan de concentratieverhoudingen die worden gebruikt voor de in vitro transfecties (tabel 3).</li>
		<li>Breng de dieren gedurende ten minste 2 weken terug naar hun thuiskooien om maximale expressie van alle componenten mogelijk te maken. OPMERKING: Als het doelorgaan zich in het lichaam bevindt en beschermd is tegen omgevingslicht, kunnen de dieren onder normale lichtomstandigheden worden gehuisvest.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioluminescentie activatie in vivo
	<ol>
<li>Bereid het luciferase substraat (luciferine).<ol>
<li>Haal een injectieflacon met in water oplosbare CTZ uit de -80 °C vriezer en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur. Houd het beschermd tegen licht.</li>
			<li>Voeg per injectieflacon van 500 μg 250 μL steriel water toe met behulp van een spuit of door de injectieflacon te openen en water toe te voegen met een pipet en vervolgens de rubberen stop terug op de glazen injectieflacon te plaatsen.</li>
			<li>Incubeer de gereconstitueerde glazen injectieflacon gedurende enkele minuten in een waterbad van 55 °C om het poeder volledig op te lossen.</li>
			<li>Breng de oplossing over in een zwarte microcentrifugebuis. Spoel de wanden van de glazen injectieflacon om alle CTZ op te halen.</li>
			<li>Verwijder de hoeveelheid oplossing die nodig is voor de dag. Bewaar de resterende oplossing bij 4 °C voor gebruik de volgende dag. Niet in de vriezer bewaren!</li>
			<li>Voer dezelfde stappen uit (2.3.1.1.-2.3.1.5) voor een injectieflacon met het medium.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bioluminescentie lichtstimulatie<ol>
<li>Verwijder het volume luciferine/medium dat nodig is voor de grootte van het dier en de gekozen toedieningsroute (tabel 4).</li>
			<li>Injecteer de dieren met luciferine of voertuig. Herhaal de bioluminescentie lichtstimulatie volgens het experimentele ontwerp. Als bijvoorbeeld activering van een recombinase gewenst is tijdens een specifiek gedragsparadigma, injecteer de dieren dan vlak voor de gedragstest. Als faseve transcriptie van een molecuul het doel is, injecteer de dieren dan herhaaldelijk gedurende dagen.</li>
			<li>Verzamel gegevens van de bioluminescentie-gestimuleerde dieren zoals ontworpen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatiotemporal+limits+of+developmental+Erk+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling.</a> Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+BRET-based+optogenetic+device+for+pulsatile+transgene+expression+enabling+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 615(2021).</li>
<li>Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+channelrhodopsins+for+combined+optogenetic+and+chemical-genetic+control+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons.</a> PLoS One. 8 (3), 59759(2013).</li>
<li>Tung, J. K., Gutekunst, C. -A., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+luminopsins%3A+genetically-encoded+bioluminescent+opsins+for+versatile%2C+scalable%2C+and+hardware-independent+optogenetic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition.</a> Scientific Reports. 5, 14366(2015).</li>
<li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BioLuminescent-OptoGenetic+in+vivo+response+to+coelenterazine+is+proportional%2C+sensitive+and+specific+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).</li>
<li>Moore, C. I., Berglund, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BL-OG%3A+BioLuminescent-OptoGenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">BL-OG: BioLuminescent-OptoGenetics.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 469-470 (2020).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+luciferase-opsin+combinations+for+improved+luminopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).</li>
<li>Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motoneuron+activity+is+required+for+enhancements+in+functional+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+exercised+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).</li>
<li>Zenchak, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence-driven+optogenetic+activation+of+transplanted+neural+precursor+cells+improves+motor+deficits+in+a+Parkinson%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).</li>
<li>Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+activated+luminopsins+allow+optogenetic+inhibition+of+distributed+nodes+in+an+epileptic+network+for+non-invasive+and+multi-site+suppression+of+seizure+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity.</a> Neurobiology of Disease. 109, Pt A 1-10 (2018).</li>
<li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+sensory+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Algal sensory photoreceptors.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 167-189 (2008).</li>
<li>Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light+receptors+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blue-light receptors for optogenetics.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10659-10709 (2018).</li>
<li>Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+of+flavoprotein+miniSOG+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer+in+genetically+encoded+system+NanoLuc-miniSOG+is+comparable+with+its+LED-excited+phototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).</li>
<li>Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+Cre-loxP+recombination+system+for+optogenetic+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering.</a> Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavoprotein+miniSOG+cytotoxisity+can+be+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer.</a> Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).</li>
<li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li>
<li>Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase-LOV+BRET+enables+versatile+and+specific+transcriptional+readout+of+cellular+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions.</a> Elife. 8, 43826(2019).</li>
<li>Parag-Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+BRET-based+biologic+light+sources+enable+spatiotemporal+control+over+diverse+optogenetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-luminescent+photodynamic+therapy+using+breast+cancer+targeted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins.</a> Science Advances. 6 (37), (2020).</li>
<li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+calcium+integrator+reveals+a+striatal+cell+type+driving+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion.</a> Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-+and+calcium-gated+transcription+factor+for+imaging+and+manipulating+activated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).</li>
<li>Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium-+and+light-gated+switch+to+induce+gene+expression+in+activated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).</li>
<li>Pathak, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+approaches+for+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+Arabidopsis+cryptochrome+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2.</a> Nucleic Acids Research. 45 (20), 167(2017).</li>
<li>Nishio, H., Walsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCAAT+displacement+protein%2Fcut+homolog+recruits+G9a+histone+lysine+methyltransferase+to+repress+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecV+recombinase+system+for+in+vivo+targeted+optogenomic+modifications+of+single+cells+or+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations.</a> Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).</li>
<li>Love, A. C., Prescher, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+%28and+using%29+the+light%3A+Recent+developments+in+bioluminescence+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology.</a> Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).</li>
<li>Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+with+bioluminescence+during+natural+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Er is een reeks luciferasen en luciferinen met lichtemissiegolflengten die overeenkomen met de activeringsspectra van fotosensorische eiwitten van blauw tot rood licht14,29. Afgezien van het uitlijnen van emissie- en excitatiegolflengten, is er geen betrouwbare manier om a priori te bepalen welke koppeling het beste werkt. Dus de noodzaak om experimenteel te bepalen hoe luciferine-luciferaseparen werken in cellen en organismen bij het aansturen van fotosensorische systemen.
De protocollen die in deze presentatie worden beschreven, beschrijven hoe het luciferine moet worden bereid en hoe het in vitro en in vivo kan worden toegepast, samen met richtlijnen voor het opzetten van kamers, weefselkweekkappen, incubators en microscopen voor experimenten met bioluminescentie. In de representatieve experimenten werden verschillende luciferasen (NanoLuc, Gaussia luciferase) met verschillende fotosensorische eiwitten (CRY / CIB, EL222, VVD, LOV) gebruikt, die de effecten van bioluminescentie versus fysiek licht, co-transfectie versus fusie-eiwitten, signaal-naar-ruis vergelijkingen en verschillende uitlezingen aantoonden. Meer toepassingen van bioluminescentie die fotosensorische eiwitten activeren, worden beschreven in publicaties van verschillende groepen, gericht op de inductie van celdood, cAMP-synthese en eiwitbeweging naast transcriptie (tabel 1).
Het eenvoudigweg co-transfecteren van lichtgevende en lichtgevoelige componenten is een goed begin. Variabelen zijn de molaire verhoudingen van emitter en sensor; onbekenden zijn achtergrondniveaus van sensoractiviteit in het donker, sensoractiviteit in relatie tot lichtintensiteit en -duur, en de efficiëntie van sensoractivering waarbij fysiek en biologisch licht wordt vergeleken. Hoewel fusieconstructies het voordeel hebben dat de molaire verhouding van emitter en sensor op 1: 1 blijft en de lichtzender dicht bij het lichtdetectiedomein komt, spelen andere overwegingen een rol, zoals waar tether (N- of C-terminus) en hoe te koppelen (linkerlengte en samenstelling) zonder de prestaties van de fotosensorische actuator te beïnvloeden. 
Voor experimenten zowel in vitro als in vivo zijn er meerdere opties voor het afstemmen van bioluminescente lichtemissie, hetzij door de concentratie van het luciferine te variëren, hetzij door de tijd te variëren waarop het luciferine beschikbaar wordt gesteld aan de respectieve sensor. De minimale hoeveelheid en tijd worden bepaald door de aan- of afwezigheid van het effect dat wordt verwacht bij lichtactivering. Daarentegen worden de respectieve maxima voornamelijk bepaald door de tolerantie van cellen voor hoge concentraties luciferine gedurende langere tijd. De concentratie CTZ die in de bovenstaande voorbeelden wordt gekozen, 100 μM, ligt dicht bij de bovengrens voor verschillende celtypen, van HEK293-cellen tot neuronen. Het doel is om zo laag mogelijke concentratie zo kort mogelijk te gebruiken om activering van het beoogde fotosensingdomein te bereiken. Dit zal gemakkelijker worden bereikt met luciferasen met een hoge lichtuitstraling en fotoreceptoren met een hoge lichtgevoeligheid.
Bioluminescentie voor het aansturen van fotoreceptoren is gebruikt bij knaagdieren (muizen, ratten) met fotosensibiliserende eiwitten die tot expressie komen in de lever, spieren, het ruggenmerg en de hersenen, evenals via fotoreceptor-tot expressie brengende cellen die subcutaan of intraperitoneaal zijn getransplanteerd. In principe zijn er geen grenzen die verhinderen dat de aanpak wordt toegepast op verschillende soorten, van niet-menselijke primaten tot vissen of vliegen. Afhankelijk van de permeabiliteit van het organisme voor het luciferine, kan de toepassing net zo eenvoudig zijn als het aanbrengen van het luciferine op het omringende water (bijvoorbeeld in vislarven30). Alvorens BL-OG in een nieuw organisme te gebruiken, moeten proefexperimenten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het luciferine zijn doelen bereikt via de gekozen toepassingsroute.
Kritische aspecten van het experimentele ontwerp zijn de verschillende controles die van belang zijn voor de interpretatie van resultaten. Cellen die een verslaggever tot expressie brengen die wordt aangedreven door een luciferase die inwerkt op een fotosensorisch eiwit, moeten worden vergeleken met cellen die het luciferase missen of het fotosensorische eiwit missen. Verder moeten vergelijkingen worden gemaakt tussen cellen die zijn blootgesteld aan luciferine, voertuig of in het donker worden gehouden. Het is ook belangrijk om de beperkingen van verschillende assays te realiseren voor het beoordelen van de effecten van bioluminescentie-gedreven fotoreceptoractivatie. De werkzaamheid van bioluminescentie-geactiveerde transcriptie kan bijvoorbeeld op verschillende manieren worden getest, afhankelijk van of het reporter-gen een orthogonaal luciferase (luminometer, IVIS) of een fluorescerend eiwit (fluorescentie-geactiveerde celsortering, microscopiebeeldanalyse) is. Hoewel de basiseffecten reproduceerbaar moeten zijn tussen testplatforms, kunnen de kwantitatieve aspecten van de effecten aanzienlijk variëren.
De bioluminescentieactivatie van fotoreceptoren is tot nu toe aangetoond voor respectievelijk een beperkt aantal luciferasen en fotosensorische eiwitten, zowel in vitro als in vivo. Het kan worden uitgebreid naar de grote klasse van fotoreceptoren voor het activeren van veel meer biologische processen. Een dergelijke uitbreiding van de benadering wordt verder bevorderd door de voortdurende ontwikkeling van nieuwe luciferasen en luciferase-fluorescentie-eiwitparen met een veel hogere lichtuitstraling dan natuurlijk voorkomende luciferasen en met kinetische kenmerken die niet in staat zijn tot verschillende toepassingen. Deze vooruitgang loopt parallel met het genereren van nieuwe luciferinen, wat verder bijdraagt aan verhoogde helderheid en kleurenpaletten29. Dit toolplatform biedt toepassingen om intracellulaire dynamica en celinteracties in levende cellen, weefsels en organismen te manipuleren en te onderzoeken.

Fotosensorische eiwitten kunnen worden geactiveerd door licht van een fysieke lichtbron of van een luciferase-enzym in de aanwezigheid van zijn substraat, luciferine, om bioluminescentie te genereren. Voor toepassingen die milli- of zelfs femtoseconde tijdschalen en/of eencellige ruimtelijke resolutie vereisen, zijn fysieke lichtbronnen (lasers en light-emitting diodes (LED's)) de enige die niet in staat zijn tot deze schalen. Voorbeelden zijn de ruimtelijke beperking van licht die wordt gebruikt voor het stimuleren van tegengestelde polen bij het ontwikkelen van Drosophila-larven met milliseconde temporele controle1 of de precieze stimulatie van enkele subcellulaire structuren zoals mitochondriale tubuli2. Veel andere toepassingen voor optische schakelaars hebben echter andere prioriteiten, waaronder uitgebreide ruimtelijke controle en herhaalde toepassing niet-invasief en zonder lichtschade, maar met gedefinieerde temporele controle in minuscule tijdschalen en instelbare intensiteiten. Hier heeft het gebruik van luciferasen als alternatieve lichtbron om lichtgevoelige domeinen te activeren verschillende voordelen. In tegenstelling tot optische vezellichtactivering bereikt bioluminescentie elk lichtdetectiedomein dat tot expressie komt in de doelcelpopulatie, omdat de lichtbron genetisch gecodeerd is. Het gebruik van bioluminescentie verlicht zorgen over weefsel- en celschade door glasvezel en langdurige blootstelling aan fysiek licht. Het licht wordt ingeschakeld met de toepassing van het luciferasesubstraat. Het begin is onmiddellijk in vitro en in vivo , afhankelijk van de toedieningsweg en duurt ~ 15-30 minuten; uitgebreide aanwezigheid of fasische stimulatie van licht kan worden bereikt met verschillende luciferinen en met aanvullende of herhaalde toepassingen van substraat3. Ten slotte kan de bioluminescentie-emissie worden afgestemd door de concentratie luciferine te variëren.
Het gebruik van bioluminescentie om ionenbewegende fotoreceptoren te activeren, d.w.z. optogenetische elementen, zoals channelrhodopsinen of pompen, is uitgebreid aangetoond4,5,6,7,8. Deze BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) benadering is gebruikt in in vivo experimenten bij muizen en ratten5,6,7,9,10,11,12. BL-OG-activering van opsinen bleek een hoeveelheid bioluminescentie van ten minste ~ 33 μW / mm2 te vereisen, waarbij de efficiëntie van activering toenam met een hogere lichtemissie6,9. Ion-bewegende sensorische fotoreceptoren zijn een subgroep van het grote contingent sensorische fotoreceptoren in de natuur die niet-ionen bewegen13,14. De uitbreiding van bioluminescentie naar het activeren van niet-ion bewegende fotoreceptoren, zoals fotosensibiliserende domeinen van planten of bacteriën, wordt aangemoedigd door rapporten15,16 dat niet-ion bewegende fotosensoren aanzienlijk lichtgevoeliger zijn dan channelrhodopsinen, wat zorgt voor een nog betere aandrijving van lichtsensoren met bioluminescentie dan al is verkregen met ion-bewegende optogenetische elementen. Onlangs meldden verschillende publicaties het gebruik van bioluminescentie als lichtbron voor de activering van een verscheidenheid aan fotoreceptoren, waaronder licht-zuurstof-spanning-sensing (LOV) domeinen, blauw-licht-gebruiken-flavine (BLUF) domeinen en cryptochromen (CRYs)3,17,18,19,20,21,22 (Tabel 1 ). Toepassingen voor bioluminescentie-gedreven activering van optische schakelaars richtten zich op intracellulaire processen, variërend van reactieve zuurstofsoort-geïnduceerde celdood, cAMP-synthese, eiwitrekrutering en dissociatie tot genomische recombinatie en inductie van transcriptie.
Dit protocol schetst het algemene ontwerp van bioluminescentie-gedreven optogenetische hulpmiddelen en beschrijft de procedures voor de experimentele uitvoering van bioluminescentieactivatie in cellen en organismen. Het bevat beschrijvingen over het opzetten van een kamer, een weefselkweekkap en incubator en een microscoop voor het werken met bioluminescentie, evenals de stappen van het voorbereiden van de luciferine tot het aanbrengen ervan. Dit protocol biedt onderzoekers de basisprocedures voor het uitvoeren van BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) in vitro en in vivo. De beschreven benaderingen kunnen verder worden uitgebreid en geïndividualiseerd naar verschillende experimentele paradigma's. We verwachten dat dit protocol de adoptie van het gebruik van bioluminescentie in optogenetische biologische studies zal vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb</td><td>Amazon</td><td></td><td>te gebruiken met elke lampenstandaard</td></tr><tr><td>&nbsp;Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-166</td><td></td></tr><tr><td>Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-161</td><td></td></tr><tr><td>Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (dik)</td><td>THOR LABS</td><td>BK-5</td><td></td></tr><tr><td>C120-Fluc</td><td></td><td></td><td>K. Gardner</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C8106; CAS: 10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Ca-FLARE protease, transcriptiefactor en reporter</td><td></td><td>Addgene # 92214, 92213, 92202</td><td>A. Ting</td></tr><tr><td>CIB-VP64 (B1016)</td><td></td><td>Addgene # 92037</td><td>C. Tucker</td></tr><tr><td>CRY-Gal&Delta;DD (B1013)</td><td></td><td>Addgene # 92035</td><td>C. Tucker</td></tr><tr><td>CTZ</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>303</td><td>formulering voor in vitro toepassingen met Gaussia luciferases</td></tr><tr><td>CTZ (Wateroplosbaar natuurlijk coelenterazine)</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>3031</td><td>formulering voor in vivo toepassingen met Gaussia luciferases</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270; CAS: 50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Kaliumzout</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>hCTZ</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>301</td><td>formulering voor in vitro toepassingen met Oplophorus luciferases</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375; CAS: 7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>iCreV</td><td></td><td></td><td>A. Cetin en H. Zeng</td></tr><tr><td>In Vivo Imaging System (IVIS)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Lumina LT</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405; CAS: 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>LED Array Driver</td><td>Amuza</td><td>LAD-1</td><td></td></tr><tr><td>LED Array voor Multiwell Platen</td><td>Amuza</td><td>LEDA-x</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Hexahydraat</td><td>Sigma</td><td>M2670; CAS: 7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653; CAS: 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NanoFuel Solvent</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>399</td><td>voor het oplossen van CTZ-preparaten voor in vitro gebruik</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465; CAS: 1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>NES-CRY2PHR-TevC</td><td></td><td>Addgene # 89877</td><td>H. Kwon</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>transfectiemedium</td></tr><tr><td>PDL-gecoate dekglasjes (12 mm, 15 mm, 18 mm)</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12-PDL, GG-15-PDL, GG-18-PDL</td><td></td></tr><tr><td>pGL2-GAL4-UAS-Luc</td><td></td><td>Addgene #33020</td><td>M. Walsh</td></tr><tr><td>Prizmatix USB Pulser TTL Generator voor Optogenetica</td><td>Goldstone Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16</td><td></td><td>Addgene # 89878</td><td>H. Kwon</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Vehicle (Wateroplosbare drager zonder CTZ)</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>3031C</td><td>controle voor in vivo toepassingen met CTZ</td></tr><tr><td>VP-EL222</td><td></td><td></td><td>K. Gardner</td></tr></tbody></table>

bioluminescente optogenetica 2.0: bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescentie - licht uitgezonden door een luciferase-enzym dat een substraat van een klein molecuul, een luciferine, oxideert - is in vitro en in vivo gebruikt om licht-gated ionkanalen en pompen in neuronen te activeren. Hoewel deze bioluminescente optogenetica (BL-OG) benadering een chemogenetische component verleent aan optogenetische hulpmiddelen, is het niet beperkt tot gebruik in de neurowetenschappen. Integendeel, bioluminescentie kan worden gebruikt om elk fotosensorisch eiwit te activeren, waardoor de manipulatie van een groot aantal lichtgemedieerde functies in cellen mogelijk wordt. Een verscheidenheid aan luciferase-luciferineparen kan worden gematcht met fotosensorische eiwitten die verschillende golflengten van licht en lichtintensiteiten vereisen.
Afhankelijk van de specifieke toepassing kan een efficiënte lichtafgifte worden bereikt door luciferase-fotoreceptor fusie-eiwitten te gebruiken of door eenvoudige co-transfectie. Fotosensorische eiwitten op basis van lichtafhankelijke dimerisatie of conformatieveranderingen kunnen worden aangedreven door bioluminescentie om cellulaire processen te beïnvloeden van eiwitlokalisatie, regulatie van intracellulaire signaalroutes tot transcriptie. Het onderstaande protocol beschrijft de experimentele uitvoering van bioluminescentieactivatie in cellen en organismen en beschrijft de resultaten met behulp van bioluminescentie-gedreven recombinases en transcriptiefactoren. Het protocol biedt onderzoekers de basisprocedures voor het uitvoeren van bioluminescente optogenetica in vitro en in vivo. De beschreven benaderingen kunnen verder worden uitgebreid en geïndividualiseerd tot een veelheid van verschillende experimentele paradigma's.

Er zijn tal van intracellulaire gebeurtenissen die kunnen worden gemanipuleerd met actuatoren die reageren op licht en die vatbaar zijn voor bimodale activering met fysieke en biologische lichtbronnen. Hieronder vindt u voorbeelden met behulp van een fotosensibiliserende calcium (Ca2 +) integrator, lichtgeïnduceerde eiwittranslocatie, een lichtgevoelige transcriptiefactor en een lichtgevoelige recombinase. De voorbeelden illustreren de haalbaarheid van het gebruik van bioluminescentie om verschillende soorten fotoreceptoren te activeren. De gepresenteerde experimenten waren niet specifiek geoptimaliseerd met betrekking tot de toepassing van light-emitting diode (LED), het gekozen luciferase, of met betrekking tot concentraties en timing van luciferinetoepassing.
Snelle licht- en activiteitsreguleerde expressie (FLARE) is een optogenetisch systeem dat de transcriptie van een reporter-gen mogelijk maakt met de co-incidentie van verhoogde intracellulaire Ca2+ en licht23 (figuur 4A). De aanwezigheid van Ca2+ is nodig om het protease in de buurt van de proteasesplitsingsplaats te brengen die alleen toegankelijk is met lichtstimulatie, wat resulteert in het vrijkomen van de transcriptiefactor. HEK293-cellen werden getransfecteerd met de originele FLARE-componenten, een dubbele Firefly (FLuc) -dTomato reporter-constructie en een membraan-verankerde Gaussia luciferase-variant sbGLuc6. In aanwezigheid van verhoogde intracellulaire Ca2 + door de blootstelling van cellen aan 2 μM ionomycine en 5 mM calciumchloride (CaCl2), leidde de toepassing van blauwe LED tot robuuste expressie van de fluorescentieverslaggever in vergelijking met cellen die in het donker achterbleven, evenals tot de expressie van FLuc bepaald door luminescentie te meten bij het toevoegen van het FLuc-substraat, D-luciferine. Vergelijkbare niveaus van FLuc-expressie werden bereikt met bioluminescentie uitgestoten door sbGLuc bij de toepassing van het sbGLuc-substraat (CTZ) samen met ionomycine en CaCl2. Merk op dat de luciferasen die worden gebruikt voor lichtactivering (sbGLuc) en voor het melden van het effect van lichtactivering (transcriptie van FLuc) alleen licht produceren met hun respectieve luciferinen (CTZ vs. D-luciferine) en niet kruisreacties veroorzaken.
Verschillende componenten werden gecombineerd om een lichtgeïnduceerd transcriptiesysteem te genereren op basis van de heterodimerisatie van cryptochromen23,24 (figuur 4B). CRY2 werd gefuseerd tot een protease terwijl het membraangebonden CIB werd gefuseerd met de proteasesplitsingsplaats en transcriptiefactor. Lichtgeïnduceerde eiwittranslocatie gaf de transcriptiefactor vrij, wat leidde tot de expressie van FLuc en dTomato, zoals weergegeven in figuur 4A. Hoewel de aanwezigheid van de transcriptiefactorcomponent alleen resulteerde in een aanzienlijk achtergrondsignaal, mogelijk als gevolg van spontane proteolyse, verhoogden zowel fysiek licht (LED) als bioluminescentie (CTZ) de expressie van FLuc robuust zoals gemeten in een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS).
In een andere reeks experimenten werd NanoLuc (luciferine: furimazine of hCTZ) gebruikt voor de optogenetische regulatie van transcriptie door de dimerisatie van CRY / CIB en de lichtgevoelige transcriptiefactor, EL22225,26,27. Figuur 5A,B toont de schema's van de verschillende componenten in de donkere en lichte toestand en de luciferase co-transfected of gefuseerd met de lichtsensor. Verschillende vergelijkingen zijn weergegeven in figuur 5C. Bioluminescentie, geïnduceerd door het toevoegen van hCTZ aan HEK293-cellen die de constructen tot expressie brengen en na 15 minuten verwijderen, was efficiënter in het aansturen van reportertranscriptie dan 20 minuten LED-lichtblootstelling voor zowel CRY / CIB als EL222. Voor CRY/CIB was een uur LED-blootstelling voldoende om een transcriptieniveau te bereiken dat vergelijkbaar is met 15 minuten bioluminescentie. Voor EL222 daarentegen was zelfs 60 minuten LED nauwelijks half zo effectief als een korte blootstelling aan bioluminescentie. Er waren geen significante verschillen in de transcriptie-werkzaamheid tussen de twee systemen wanneer ze co-getransfecteerd waren, hoewel de fusie-eiwitten van CRY/CIB efficiënter waren dan die van EL222. Voor beide systemen leidden de fusie-eiwitten tot significant hogere transcriptieniveaus dan de co-getransfecteerde componenten. CRY/CIB toonde consistent hogere achtergrondniveaus met voertuigtoepassing in vergelijking met EL222, die een verwaarloosbare achtergrondtranscriptie had. Toenemende concentraties van hCTZ alleen hadden geen effect op de transcriptie van het reporter-gen.
Fotoactivalabele recombinases bieden een veelzijdig hulpmiddel voor optogenenomische manipulaties. We testten bioluminescentieactivatie van een lichtgevoelige split Cre-recombinase op basis van het Vivid LOV-eiwit, iCreV28. Figuur 6A toont een schema van de verschillende componenten, sbGLuc, iCreV en een lox-stop-lox fluorescentie reporter (tdTomato) voor en na de toepassing van CTZ. De resultaten van de CTZ-toepassing met betrekking tot besturingselementen (geen CTZ of LED) zijn weergegeven in figuur 6B. Er is enige achtergrondexpressie, zelfs in het donker (geen CTZ); in de aanwezigheid van CTZ is de expressie echter robuust verhoogd over de achtergrond en vergelijkbaar met die geïnduceerd met LED-toepassing.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig01.jpg"> Figuur 1: Licht afgesloten incubator. Kartonnen doosklep die het licht van het verlichte bedieningspaneel bedekt (pijl boven). Lichtdoordringbare afdekking over de glazen deur van de incubator (onderste pijl) om de cellen te beschermen tegen blootstelling aan licht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig02.jpg"> Figuur 2: Laminaire stromingskap verlicht door rood licht. Opstelling met een standaard laminaire flow tissuekweekkap die wordt verlicht door rood licht. Pijl geeft een standaard bureaulamp met een rode lamp aan. Alle manipulaties onder rood licht worden uitgevoerd in een anders donkere lichtdichte kamer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig03.jpg"> Figuur 3: Lichtdichte compartimenten rond live-cell imaging microscopen. Twee voorbeelden van live-cell imaging microscoopopstellingen die het gebruik laten zien van een stevige doos met plastic gordijnen alleen aan de voorkant (linkerpanelen: boven en onder) of zwarte gordijnen rondom de beeldvormingsopstelling (rechterpanelen: boven en onder). De voorzijden in beide exemplaren blijven open en opgerold wanneer ze niet in gebruik zijn (bovenpanelen: links en rechts). De zwarte gordijnen aan de voorkant zijn naar beneden gerold om te voorkomen dat licht in de kamer (bijv. computerschermen) het beeldvormingsgebied binnendringt bij het uitvoeren van live-cell bioluminescentiestimulatie en / of beeldvorming (onderste panelen: links en rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig04.jpg"> Figuur 4: Bioluminescentie voor de integratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen. (A) Schema's van de FLARE-componenten die samen met sbGLuc zijn getransfecteerd. In aanwezigheid van Ca2 + en de resulterende nabijheid van het protease tot de proteasesplitsingsplaats, zal bioluminescentie of LED leiden tot het ontvouwen van LOV, blootstelling van de splitsingsplaats en afgifte van de transcriptiefactor. Cellen werden blootgesteld aan LED (duty cycle 33%, 2 s aan/4 s uit gedurende 40 min; 3,5 mW licht vermogen, 4,72 mW/cm2 bestraling) of aan bioluminescentie (100 μM CTZ eindconcentratie gedurende 15 min) of in het donker gelaten. Microscopische beelden van HEK293-cellen die de bovenstaande componenten na de behandeling tot expressie brengen om de Ca2 + -niveaus en blootstelling aan LED te verhogen (links). FLuc-luminescentie gemeten in een luminometer die de blootstelling aan LED, bioluminescentie (CTZ) of links in het donker (rechts) vergelijkt. (B) Schema's van een niet-Ca2+-afhankelijk transcriptiesysteem gecotransfecteerd met sbGLuc. HEK293-cellen in 4-putplaten werden getransfecteerd met vier verschillende opstellingen van componenten zoals afgebeeld in het schema. Platen werden blootgesteld aan LED (duty cycle 33%, 2 s aan/4 s uit gedurende 40 min; 3,5 mW lichtvermogen, 4,72 mW/cm2 bestraling) of bioluminescentie (100 μM CTZ eindconcentratie) door CTZ toe te voegen en 15 min aan te laten staan; bedieningsplaten werden in het ongewisse gelaten. Transcriptie van de FLuc-verslaggever werd gemeten in een IVIS. IVIS-afbeeldingen van representatieve gerechten worden aan de linkerkant getoond; stralingsmetingen van verschillende replicaties met een basislijn naar de donkere controles worden aan de rechterkant weergegeven. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: FLARE = Snelle licht- en activiteitsgeregelde expressie; LOV = licht-zuurstof-spanning-detectie; LED = lichtgevende diode; CTZ = coelenterazine; FLuc = vuurvlieg luciferase; dTom = dTomato; CRY2 = cryptochroom 2; CRY2PHR = CRY2 fotolyase homologie regio; CIB1 = Ca2+- en integrinebindend eiwit 1; CIBN = N-eindpunt van CIB1; IVIS = in vivo beeldvormingssysteem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig05.jpg"> Figuur 5: Bioluminescentie voor het aansturen van transcriptie. (A) Schema's van twee fotoactivalabele transcriptiesystemen in hun donkere en lichte toestand. (B) NanoLuc werd ofwel getransfecteerd of gefuseerd met de lichtgevoelige moieties zoals afgebeeld (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-NanoLuc-VP16-EL222-C). (C) Vergelijkingen met behulp van beide systemen met betrekking tot lichtbronnen, constructieontwerp en signaal naar ruis. Cellen werden blootgesteld aan LED (duty cycle 33%, 2 s aan/4 s uit gedurende 40 min; 3,5 mW lichtvermogen, 4,72 mW/cm2 bestraling) of aan bioluminescentie gedurende 15 min (100 μM hCTZ eindconcentratie; tenzij verschillende concentraties worden genoteerd). Donkere, platen werden onaangeroerd gelaten in de incubator tussen de initiële transformatie van plasmiden en FLuc-meting; VEH, platen werden op dezelfde manier behandeld als die welke hCTZ ontvingen, maar kregen in plaats daarvan een voertuig. Verschillen in transcriptieniveaus: hCTZ, co-getransfecteerde CRY vs. EL222 - niet significant; hCTZ, luciferase - fotoproteïne fusie CRY vs. EL222 - p < 0,005; hCTZ, CRY co-transfectie vs. fusie - p < 0,005; hCTZ, EL222 co-transfectie vs. fusie - p < 0,01; voertuig, CRY vs. EL222 - p < 0,05. Afkortingen: UAS = upstream activating sequence; LED = lichtgevende diode; CTZ = coelenterazine; FLuc = vuurvlieg luciferase; CRY = cryptochroom; CIB = Ca2+- en integrinebindend eiwit; VEH = voertuig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig06.jpg"> Figuur 6: Bioluminescentie voor optogenomische manipulatie. (A) Schema's van bioluminescentie-gedreven optogenomische manipulatie met behulp van sbGLuc, de gesplitste iCreV-componenten en een LSL-reportercassette, voor en na het aanbrengen van licht. (B) HEK293-cellen werden gelipt met plasmiden en vervolgens in het donker bewaard. Vierentwintig uur later werden de cellen gedurende 30 minuten behandeld met slechts medium (geen CTZ) of met CTZ (100 μM eindconcentratie) of met LED (duty cycle 25%, 5 s on/15 s off gedurende 5 min; 14,81 mW lichtvermogen, 20 mW/cm2 bestralingssterkte) als positieve controle. Microscopische beelden van tdTomato-fluorescentie met behulp van omstandigheden zoals aangegeven. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: LSL = lox-stop-lox; CTZ = coelenterazine; LED = lichtgevende diode; VVD = Levendig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Bioluminescentie activatie van fotoreceptoren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%201_revised.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Richtlijnen voor het platen en transfecteren van cellen in verschillende formaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%202_revised.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: Verhoudingen van verschillende plasmiden voor transfectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%203.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 4: Injectieroutes, volumes en concentraties van luciferine voor in vivo toepassingen (25 g muis). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%204.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Bioluminescentie - licht uitgezonden door een luciferase-enzym dat een substraat met kleine moleculen oxideert, een luciferine - kan worden gebruikt om fotosensorische eiwitten te activeren, waardoor een andere dimensie wordt toegevoegd aan lichtstimulatie en de manipulatie van een veelheid aan lichtgemedieerde functies in cellen op temporele en ruimtelijke schalen mogelijk wordt.

Bioluminescente optogenetica 2.0: Bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

1(elektronische tonen)Bioluminescente optogenetica is een platformtechnologie waarin genetisch gecodeerde lichtbronnen biologische functies en netwerken binnen en tussen cellen kunnen visualiseren en controleren. Bioluminescentie bereikt elk lichtgevoelig domein dat tot expressie komt in de doelcelpopulatie zonder enige weefsel- en celschade door glasvezel en langdurige blootstelling aan fysiek licht. Begin om te beginnen met het bereiden van de Luciferin-voorraad door vijf milligram gelyofiliseerde CTZ op te lossen in 250 microliter van het respectieve oplosmiddel.Zorg voor het oplossen van CTZ langs de wanden door pipetteren. Terwijl u de injectieflacon beschermt tegen direct licht, bereidt u 50 microliter aliquots voor in zwarte microcentrifugebuizen van 0,5 milliliter en slaat u de aliquots op bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Voer alle verdere manipulaties uit in een lichte krappe kamer in een laminaire stroomkap verlicht door rood licht.Om enkele bioluminescentie lichtstimulatie uit te voeren, bereidt u een werkoplossing van Luciferine in een celkweekmedium, kort voordat u aan de cellen wordt toegevoegd bij een eindconcentratie van 100 micromolair. Voeg Luciferine-bevattend medium toe aan de cellen en incubeer voor de gewenste duur van lichtstimulatie. Schakel het rode licht uit.Na een paar seconden wachten totdat de ogen zich hebben aangepast aan volledige duisternis, controleert u de lichtuitstraling met het oog. Documenteer de lichtuitstraling door een foto te maken. Beëindig de lichtstimulatie door het Luciferin-bevattende medium te vervangen door het kweekmedium en was vervolgens de cellen een of twee keer met het kweekmedium om alle Luciferine te elimineren, afhankelijk van de gevoeligheid van het experiment.Om celverlies te voorkomen, plaats de cellen op PDL-gecoate schotels en incubeer de cellen. Om herhaalde bioluminescentie lichtstimulatie uit te voeren, stelt u de live cell imaging chamber in door een lichtdicht compartiment rond de live cell imaging microscoop te creëren met behulp van een doos en zwarte vellen. Zorg ervoor dat alle lichtbronnen die in de kamer aanwezig zijn, worden afgedekt.Stel het perfusiesysteem in met de gewenste oplossing voor inname en de kameruitgang die leidt tot een afvalcontainer. Afhankelijk van het aantal herhaalde stimulaties, aliquott de voorbereide werkende Luciferin imaging oplossing in de microcentrifuge buizen. Plaats een coverslip met getransfecteerde cellen in de kamer.Terwijl u de pomp draaiende houdt, verwijdert u de inlaatbuis van de pomp uit het inlaatbeker. Dompel de inlaatbuis snel onder in Luciferin-oplossing en houd de overgangstijd kort om luchtleemte in de slang te voorkomen. Zodra de Luciferin-oplossing is opgenomen, plaatst u de inlaatbuis terug in het inlaatbeker.Herhaal het verwijderen en onderdompelen van de inlaatbuis in Luciferin zo vaak als nodig is met tussenpozen van enkele minuten tot uren, afhankelijk van het fysiologische patroon waaraan de cellen moeten worden blootgesteld. Houd de cellen vervolgens gedurende 16 tot 24 uur in een lichtbeschermde omgeving voor transcriptie of de duur totdat het effect van lichtstimulatie is beoordeeld. Om de bioluminescentieactivering in vivo uit te voeren, bereidt u Luciferin voor door een CTZ-injectieflacon uit minus 80 graden Celsius te halen en vervolgens op te warmen tot kamertemperatuur in het lichtbeschermde gebied.Voeg voor elke injectieflacon met 500 microgram CTZ 250 microliter steriel water toe met behulp van een pipet en plaats de rubberen stop terug op de injectieflacon. Incubeer de gereconstitueerde glazen injectieflacon in een waterbad dat gedurende enkele minuten is getemperd op 55 graden Celsius om het poeder volledig op te lossen. Breng de oplossing over in een zwarte microcentrifugebuis en spoel de wanden om alle CTZ op te halen.Na het verwijderen van de benodigde hoeveelheid oplossing, bewaart u de resterende oplossing bij vier graden Celsius. Na het voorbereiden, reconstitueren en aliquoteren van het voertuig op een vergelijkbare manier, preformeert u de bioluminescentielichtstimulatie door het volume Luciferine of voertuig te verwijderen dat nodig is voor de grootte van het dier en de gekozen toepassingsroute. Injecteer het dier met Luciferin of voertuig zoals ontworpen.Voor gewenste recombinase-activering tijdens een specifiek gedragsparadigma, injecteer het dier vlak voor de gedragstest. Injecteer het dier voor fasische transcriptie herhaaldelijk gedurende dagen en verzamel de gegevens van het bioluminescentie gestimuleerde dier zoals ontworpen. Het snelle licht- en activiteitsreguleerde expressiesysteem maakte transcriptie van het reporter-gen mogelijk met verhoogde intracellulaire calciumionen en licht.De blauwe LED leidde tot robuuste reporterfluorescentie en de FLuc-expressie werd bepaald door luminescentiemetingen na Luciferin addition. In een in vivo beeldvormingssysteem verhoogden zowel LED als CTZ de FLuc-expressie robuust, terwijl de aanwezigheid van de transcriptiefactorcomponent alleen resulteerde in een aanzienlijk achtergrondsignaal, mogelijk als gevolg van spontane proteolyse. NanoLuc werd gebruikt voor optogene regulatie door middel van de CRY/CIB dimerisatie en lichtgevoelige transcriptiefactor EL222.De bioluminescentie geïnduceerd door de toevoeging van hCTZ aan HEK-293 cellen en de verwijdering ervan na 15 minuten was efficiënter dan 20 minuten LED-blootstelling voor CRY / CIB en EL222. Er werden geen significante verschillen in de transcriptie-werkzaamheid waargenomen tussen de twee systemen bij co-transfectie met hCTZ, hoewel de fusie-eiwitten van CRY/CIB efficiënter waren dan EL222. CRY/CIB vertoonde consistent hogere achtergrondniveaus in vergelijking met EL222, onafhankelijk van de hCTZ-concentratie.De bioluminescentie van een lichtgevoelige split Cre-recombinase op basis van het VVD LOV-eiwit iCreV werd getest. De resultaten van de CTZ-toepassing toonden aan dat de aanwezigheid van CTZ de expressie over de achtergrond robuust verhoogde en vergelijkbaar is met de LED-toepassing. Het gebruik van bioluminescentie om niet alleen ijzer bewegende fotoreceptoren te activeren, maar ook alle fotosensorische domeinen voegt een andere dimensie toe aan lichtstimulatie die de manipulatie van celfuncties over temporele en ruimtelijke schalen uitbreidt.Bioluminescente optogenetica is toegepast in cellen en modelorganismen. Deze protocollen kunnen worden aangepast om een breed scala aan gerichte hypothesen in vitro en in vivo te testen.

bioluminescent-optogenetics-20-harnessing-bioluminescence-to-activate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en...

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Het uitbreiden van de stichting en de toepasbaarheid van fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) door inventarisatie van de relevante beginselen en demonstreren van de verenigbaarheid ervan met een veelheid aan fluoroforen en antilichaam-gerichte voorwaarden.

Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Dit protocol beschrijft hoe optogenetische experimenten kunnen worden uitgevoerd voor het beheersen van genexpressie met rood en verrood licht met behulp van PhyB en PIF3. Inbegrepen zijn stapsgewijze instructies voor het bouwen van een eenvoudig en flexibel verlichtingssysteem, dat de controle van genexpressie of andere optogenetica met een computer mogelijk maakt.

Het bouwen van een eenvoudig en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten

Dit protocol omvat het transfecteren van cAMP-sensoren en bPAC-nLuc, een optogenetisch eiwit, om nauwkeurig de cellulaire verdeling en respons op lichtstimulatie te volgen. De innovatieve aanpak van het creëren van een cAMP-responskaart met behulp van een puntscansysteem biedt het potentieel om onderzoek met optogenetische eiwitten op verschillende gebieden te bevorderen.

De cellulaire distributie van een optogenetisch eiwit in kaart brengen met behulp van een lichtstimulatieraster

Optogenetische manipulatie van signaalroutes kan een krachtige strategie zijn om te onderzoeken hoe signalering wordt gedecodeerd bij ontwikkeling, regeneratie, homeostase en ziekte. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor het gebruik van licht-zuurstof-spanningsgevoelige domeingebaseerde Nodale en botmorfogene proteïne (BMP) signaleringsactivatoren in het vroege zebravisembryo.

Optogenetische signaleringsactivering in zebravisembryo's

Leer bioluminescente optogenetica om cellulaire functies te besturen zonder weefselschade. Deze methode activeert fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo met luciferine.

Bioluminescente optogenetica 2.0: Bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren

Meer video's verkennen