Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Dit protocol maakt gebruik van brekingsindexdetectie om bijproducten van koolstofmetabolisme te meten die gewoonlijk worden geaccumuleerd in op lysaat gebaseerde, celvrije systemen. Het maakt ook gebruik van massaspectrometrie om een nog breder panel van centrale metabolieten te detecteren die worden gegenereerd in metabolisch actieve lysaten. De twee technieken die in dit protocol worden gebruikt, bieden de mogelijkheid om de chemische reacties die plaatsvinden in een op lysaat gebaseerd, celvrij systeem kwantitatief te beschrijven, waardoor het mogelijk is om een breder scala aan metabolieten te detecteren, inclusief die welke in lage concentraties aanwezig zijn in de complexe lysaatachtergrond.

Jaime Lorenzo Dinglasan en David Reeves, afgestudeerde onderzoekers van de afdeling Biowetenschappen, demonstreren de procedures. Begin met het combineren van de verschillende componenten in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter om eindreacties voor te bereiden met 4,5 milligram per milliliter totaal lysaateiwit. Bereid celvrije metabole engineering, of CFME, reacties voor met uiteindelijke volumes van 50 microliter in drievoud per tijdspunt.

Beëindig de drievoudige reacties onmiddellijk op hun geschikte tijdstippen door een gelijk volume van 5% trichloorazijnzuur toe te voegen aan het uiteindelijke reactievolume van elk monster. Verdun vervolgens elk monster door twee keer het volume steriel water aan elk reactiemengsel toe te voegen. Om tijd nul samen te vatten, mengt u hetzelfde volume van 5% trichloorazijnzuur als het totale eindreactievolume met het lysaat voordat u de rest van de reactiecomponenten toevoegt.

Deze verzuringsstap slaat lysaatenzymen neer voordat ze glucose aanzienlijk metaboliseren. Vortex de monsters en centrifugeer op een benchtop microcentrifuge op 11, 600 keer g gedurende vijf minuten, en breng de supernatanten die de organische analyten bevatten over naar schone buizen. Bewaar de monsters bij min 20 graden Celsius als later HPLC-analyses moeten worden uitgevoerd.

Zorg ervoor dat u de opgeslagen monsters op ijs ontdooit voordat u doorgaat naar de volgende stap. Filter elk supernatant met een poriefilter van 0,22 micrometer. Breng na de centrifuge elk filtraat over in een schone injectieflacon met HPLC-glas.

Plaats de injectieflacons in de autosamplerlade van het HPLC-systeem die al is ingesteld voor analyse. Selecteer in de menubalk Volgorde, Nieuwe reekssjabloon. Selecteer Volgorde.

Sla de reekssjabloon op als de naam van de reekssjabloon S.Select Volgorde, Volgordetabel. Voeg N-rijen toe die overeenkomen met N injectieflacons. Voer vervolgens injectieflaconposities en monsternamen in onder respectievelijk de injectieflacon en de monsternaam, volgens hun opstelling op de autosampler-lade.

Selecteer de methode die is gegenereerd zoals beschreven in het manuscript in het vervolgkeuzemenu Methodenaam en voer 50 microliter in als injectieflacon per injectieflacon voor elke rij. Klik op Toepassen en sla de reekssjabloon op door Reeks, Reekssjabloon opslaan te selecteren. Zorg ervoor dat de sequentiesjabloon wordt geladen door Sequentie, Load Sequence Template, sequentiesjabloonnaam S. Te selecteren Nadat u een stabiele basislijn op de online plot hebt bereikt, klikt u met de rechtermuisknop op het paneel RID-module, Control, Off Recycling Valve om de oplosmiddelstroom door de RID-detector naar afval te leiden.

Als u gegevensverzameling wilt starten, selecteert u Volgorde in de menubalk en selecteert u vervolgens Reekstabel, Uitvoeren. Selecteer Gegevensanalyseweergave in het menu Beeld. Zoek de naam van het reeksbestand in de bestandenlijst aan de linkerkant van het scherm.

Ga op het middelste paneel op het scherm naar signaalweergaveselectie, RID-signaal om de samplechromatogrammen te bekijken. Selecteer een rij die overeenkomt met een van de voorbeelden in het bovenpaneel op het scherm. Pieken die overeenkomen met de doelanalyten worden langs de retentietijdas gerangschikt als glucose, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol in monsters waar al deze metabolieten aanwezig zijn.

Onderscheid of de pieken van interesse goed zijn geïntegreerd door de software. Er moet automatisch een rode lijn worden getrokken als basis van elke piek. Als de rode lijn scheef staat, is de automatische integratie mislukt.

Selecteer vervolgens de knop Handmatige integratie in de integratietoolset en teken handmatig een piekbasis om het piekgebied te integreren. Selecteer het gereedschap Cursor in de Common Tool Set om op correct geïntegreerde pieken te klikken. Het piekgebied en de bijbehorende reactietijd van de geselecteerde piek worden gemarkeerd als een tabelrij op het onderste paneel van het scherm.

Als u piekgebieden wilt exporteren, selecteert u Bestand, Exporteren, Integratieresultaten. Zet piekgebiedwaarden tegenover bekende concentraties van monsters in een spreadsheet. Klik met de rechtermuisknop op de uitgezette gegevens en selecteer vervolgens Trendlijn toevoegen, Trendlijn opmaken, Vergelijking in grafiek weergeven.

Gebruik in een afzonderlijke spreadsheet de vergelijkingen van standaardcurvetrendlijnen om piekgebiedwaarden om te zetten in concentraties voor elke analyt uit elk monster. Bereken de gemiddelde piekgebieden en standaardfoutwaarden voor drievoud voor gegevensvisualisatie. Stel drievoudige reacties in per tijdspunt, behalve tijd nul, op ijs zoals beschreven in het manuscript.

Gebruik in plaats van glucose een eindconcentratie van 100 millimolair glucose-13C6 in de reacties. Incubeer de reacties bij 37 graden Celsius gedurende één, twee en drie uur. Pipetteer om te beginnen met de analyse een equivalent volume van het extractiemiddel naar elk monster.

Als de monsters zijn ingevroren, voeg dan het extractiemiddel toe voordat de monsters volledig ontdooien om de reactivering van het glucosemetabolisme te voorkomen. Voer alle monsterverwerkingsstappen op ijs uit. Om tijd nul te recamenteren, pipetteert u het uiteindelijke volume extractieoplosmiddel tot een geschikt volume lysaat voor de gewenste eindconcentratie van 4,5 milligram per milliliter in 50 microliter reactievolume.

Voeg de rest van de reactiecomponenten toe zoals eerder beschreven. Deze verzuringsstap slaat lysaatenzymen neer voordat ze glucose aanzienlijk metaboliseren. Incubeer de monsters in extractiemiddel op ijs gedurende 30 minuten met zacht schudden.

Centrifugeer vervolgens de monsters op 21.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het supernatant van het neergeslagen eiwit te scheiden. Breng 50 microliter van het supernatant over naar autosampler-injectieflacons en laad de injectieflacons op de lade binnen de vier graden Celsius autosampler. Nadat u het instrument hebt voorbereid voor analyse, stelt u een run-reeks in met behulp van de data-acquisitie- en interpretatiesoftware van het LC-MS /MS-systeem.

Klik in Roadmap, Sequence Setup, met de rechtermuisknop op de tabel om zoveel rijen als voorbeelden in te voegen. Stel voor elke rij het injectievolume in op vijf microliter en de positie op de respectieve positie van de injectieflacon op de autosamplerlade. Voer bestandsnamen in als voorbeeldnamen en stel het gewenste bestandspad in voor de resultaten van het uitvoeren.

Als u het uitvoeren wilt starten, markeert u alle bestandsnamen in de reeks. Selecteer in de menubalk Acties, Reeks uitvoeren. Open MZmine en importeer de eerder verkregen onbewerkte uitvoerbestanden.

Selecteer in de menubalk Raw Data Methods, Raw Data Import en selecteer de bestanden die overeenkomen met de voorbeelden. Volg de stappen die in het manuscript worden beschreven om de MZmine-analyse te voltooien. Exporteer de onbewerkte piekgebieden aan het einde van de MZmine-analyse als een CSV-bestand.

Open een spreadsheet om de massa's van 13C-gelabelde metabolieten uit het glucosemetabolisme te berekenen voor de gerichte zoekopdracht. Gebruik berekende massa's van 13C-gelabelde metabolieten om massa-to-charge-kenmerken van MZmine-resultaten te zoeken en te annoteren. Controleer handmatig de spectra van de vermeende annotaties in een kwaliteitsbrowser om de annotaties te bevestigen.

Open Roadmap, Qual Browser. Open het RAW-bestand op de werkbalk om onbewerkte MS-gegevens van elk monster te importeren. Teken een lijn onder het gewenste bereik van retentietijden die overeenkomen met de vermeende annotatie op het totale ionchromatogram om een massaspectrum te bekijken.

In HPLC-RID-experimenten werd glucose binnen de eerste drie uur na de reactie geconsumeerd en voornamelijk gefermenteerd tot lactaat. Ethanolaccumulatie trad ook significant op binnen de eerste drie uur van de reactie en stopte daarna. Acetaat was aanvankelijk aanwezig in de reacties als onderdeel van de S30-buffer en hoopte zich pas op als gevolg van het metabolisme na zes uur, toen de glucoseconsumptie was vertraagd.

Lactaat en ethanol kunnen dus worden beschouwd als de eindproducten van grote fermentatie in het op lysaat gebaseerde, celvrije glucosemetabolisme. Er werd waargenomen dat zowel formate als succinaat werden gesynthetiseerd als kleine fermentatieproducten. Glucose-13C6 werd waarneembaar geconsumeerd door glycolyse, zoals blijkt uit de fluctuaties in glycolytische tussenproducten.

In overeenstemming met de detectiegegevens van de HPLC-brekingsindex accumuleerde glucose tot lactaat-13C3 en werd het ook gefermenteerd tot succinaat-13C3 binnen de eerste drie uur na de reactie. De opname van glucose-13C6-afgeleide koolstofatomen in suikerfosfaten 6-fosfogluconolacton, 6-fosfogluconaat, ribulose-5-fosfaat en sedoheptulose-7-fosfaat werd ook waargenomen, wat de deelname van de pentosefosfaatroute in het lysaatglucosemetabolisme bevestigt. Het lysaatglucosemetabolisme bleek de tyrosine-13C9-synthese te voeden, terwijl het ook een voorloper was voor de productie van histidine-13C5.

Het is belangrijk dat de controlemonsters precies tijd nul weergeven. Zorg er daarom voor dat de eiwitten in het lysaat worden geïnactiveerd voordat de oplossing met energiebronnen wordt gemengd. Zorg er ook voor dat de automatische integratie van pieken uit testmonsters, controlemonsters en normen consistent is, zodat geëxtraheerde piekgebieden vergelijkbaar zijn.