Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Dit protocol is ontworpen om de submitchondrial lokalisatie van gist mitochondriale eiwitten te bepalen, wat wordt beschouwd als een fundamentele stap tijdens mitochondriale eiwitfunctie-opheldering. Het protocol is geschikt voor onze giststammen die in verschillende groeiomstandigheden worden onderhouden. Het vertegenwoordigt een krachtig hulpmiddel voor onderzoek als het bestuderen van mitochondriën.

Om te beginnen streep cellen van glycerolvoorraad opgeslagen bij 80 C op een YPD-agarplaat om enkele kolonies te isoleren van de stam van belang. En incubeer de plaat bij 30 C gedurende 2 tot 3 dagen. Bereid een startcultuur door 2 tot 3 afzonderlijke kolonies uit de YPD-agarplaat te enten in een Erlenmeyer van 100 ml met 10 tot 30 ml YPGal-medium.

Incubeer de kolf gedurende 24 uur bij 30 C met krachtig schudden bij 180 tot 200 tpm. Verdun de startercultuur tot 1 L vers YPGal-medium tot een optische dichtheid van minder dan 0,1 bij 600 nm. Cultiveer de cellen bij 30 C met krachtig schudden bij 180 tot 200 tpm gedurende ongeveer 12 uur, totdat de optische dichtheid 1 tot 1,5 bereikt.

Voer de isolatie van sterk gezuiverde mitochondriën uit zoals beschreven in de tekst. En bepaal de eiwitconcentratie van het sterk gezuiverde mitochondriale preparaat, met behulp van de Bradford-test, volgens de instructies van de fabrikant. Stel de eiwitconcentratie in op 10 mg/ml met ijskoude SEM-buffer.

Breng 40 l sterk gezuiverde mitochondriën over in vier voorgekoelde en gelabelde microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Voeg 360 l SEM-buffer toe in de eerste en tweede buis. En 360 l EM-buffer in de derde en vierde buis.

Voeg met behulp van het pipetteerschema, volgens de tekst, 4 L vers bereid proteïnase K toe in de tweede en vierde buis. Nadat je alle tubes voorzichtig hebt gemengd, incubeer je gedurende 30 minuten op ijs met af en toe mengen. Om de proteïnase K-activiteit te stoppen, voegt u 4 L van 200 mM PMSF toe aan alle vier de buizen.

Centrifugeer de buizen bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 C.En verzamel het supernatant, zonder de pellet te storen, in een nieuwe 1,5 ml voorgekoelde gelabelde microcentrifugebuis. Resuspendeer vervolgens de pellet in 400 l ijskoude SEM-buffer. Om de mogelijke sporen van proteïnase K te inactiveren, slaat u het verzamelde supernatant neer en resuspendeert u de pellet met trichloorazijnzuur tot een eindconcentratie van 10%Incubateer de buizen gedurende 10 minuten op ijs.

Centrifugeer de met trichloorazijnzuur behandelde monsters gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 C.En na het verwijderen van het supernatant, resuspend de pellet in 200 l monsterbuffer. Als het broomfenolblauw geel wordt, voeg dan 1 tot 5 l van 1 M Tris-basis toe, totdat het blauw wordt. Voeg 4 l van 200 mM PMSF toe aan alle buizen.

Bewaar de monsters bij 80 C tot verdere analyse door SDS-PAGE en western blot. Breng 200 l sterk gezuiverde mitochondriën over in een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Verdun mitochondriën eenvoudig met ijskoude SEM-buffer.

Met behulp van een sonicator die compatibel is met kleine volumes, soniceer mitochondriën 3 keer gedurende 30 seconden op ijs. Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 100.000 x g bij 4 C.En verzamel het supernatant in een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Nadat u de buis hebt gelabeld als S"voor oplosbare eiwitfractie, houdt u de buis op ijs.

Resuspend de pellet uit de vorige stap in 400 l ijskoude SEM-buffer. Breng 100 l van de geresuspendeerde pellet over in een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Label de buis als SMP"voor submitochondrial deeltjesfractie en houd de buis op ijs.

Verdun de resterende 300 l geresuspendeerde pellet eenvoudig met vers bereid 200 mM natriumcarbonaat. En incubeer het verdunde monster gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 30 minuten bij 100.000 x g bij 4 C.Verzamel het supernatant in een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml.

Label het monster als CS"voor carbonaat supernatant fractie, en houd de buis op ijs. Resuspend de pellet uit de vorige stap in 400 l ijskoude SEM-buffer. En noem het monster cp"voor carbonaat neergeslagen fractie.

Precipiteer alle monsters met trichloorazijnzuur tot een eindconcentratie van 10% en incubeer de buizen gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 C.Na het verwijderen van het supernatant, resuspendeert u elke pellet in de monsterbuffer. Als de monsterbuffer geel wordt, voegt u 1 tot 5 l van 1 M Tris-basis toe totdat deze blauw wordt.

Voeg 1 l van 200 mM PMSF toe aan alle buizen en bewaar bij 80 C tot verdere analyse door SDS-PAGE en western blot. De ruwe mitochondriale fractie werd gezuiverd op sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie en vermindering van andere cellulaire verontreinigingen werd waargenomen. Mitochondria naar mitoplast conversie werden gecontroleerd door het verdwijnen van het intermembraan ruimte-eiwit cytochroom b2 in de pellet.

Met de bijbehorende verschijning in het supernatant. De proteïnase K gemedieerde afbraak van het intermembraaneiwit Sco1 werd waargenomen als gevolg van verstoring van het buitenmembraan door osmotische shock. De buitenste mitochondriale membraanintegriteit werd bevestigd door de bescherming van cytochroom b2 en Sco1 tegen de afbraak van proteïnase K in de pelletfractie.

Evenzo bevestigde de bescherming van het matrixoplosbare eiwit KGD de integriteit van het binnenste mitochondriale membraan. Prx1 western blot profiel suggereerde dubbele mitochondriale lokalisatie in intermembrane ruimte en matrix. Mitochondriën werden onderworpen aan ultrasoonapparaat en carbonaatextractie om de topologie van membraaneiwitten te onderzoeken.

De integrale membraaneiwitgieten bleef in de pelletfracties. De KGD werd gedetecteerd in de supernatantfractie. De detectie van KGD-eiwit in de pellet was te wijten aan ultrasoonapparaatparametervariaties die de vorming van SMP's beïnvloedden.

Na behandeling met natriumcarbonaat werden de KGD- en de SMP-fractie opgelost en gevonden in de supernatantfractie. Prx1 western blot profiel suggereerde een associatie met membraan periferie. Voor het succes van het submitchondriële fractioneringsprotocol is het belangrijk om de proteïnase K-activiteit na hypotone zwelling te stoppen door PMSF aan de monsters toe te voegen.

Sites bieden informatie over de lokalisatie van het submitochondriale eiwit. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de integriteit van mitochondriale preparaten te controleren, wat fundamenteel is tijdens proteomische studies van mitochondriale subsecties.