Weefselvoorbereidingstechnieken voor contrastverbeterde microcomputertomografie beeldvorming van grote hartmodellen bij zoogdieren met chronische ziekte

Dit protocol geeft microstructureel inzicht in structurele pathologische ziekten op de hele orgaanschaal met behulp van microcomputertomografie. In dit protocol wordt een gespecialiseerde weefselvoorbereidingsmethode geïmplementeerd om hoge resolutie beeldvorming van hele hartmonsters van translationele grote mammalia-modellen bij mensen te optimaliseren met selectieve contrastverbetering van structurele ziekten. De cardiale microstructuur zoals de verspreiding van fibrose en de organisatie van het prikkelbare myocardium ligt ten grondslag aan een breed spectrum van hartaandoeningen en zet de toon voor de levensbedreigende aritmie.

Nestor Pallares-Lupon demonstreert de procedure, een postdoc en PhD-afgestudeerde voor mijn laboratorium. Bereid om te beginnen een cardioplegische oplossing met natriumheparine en bewaar de oplossing bij vier graden Celsius. Bereid vervolgens PBS / EDTA voor door eerst EDTA toe te voegen aan een liter gedestilleerd water voor een eindconcentratie van 10 millimol.

Verhoog en handhaaf vervolgens de pH van de oplossing op 12 met behulp van natriumhydroxide om de EDTA op te lossen. Zodra de EDTA volledig is opgelost, verlaagt u de pH tot 7,4 met behulp van zoutzuur. Voeg vervolgens een foliezakje PBS toe om een 0,01 molaire oplossing met pH 7,4 te verkrijgen.

Bewaar de bereide oplossing bij kamertemperatuur. Bereid ten slotte een 1% ethanol PMA-contrastmiddeloplossing door 10 gram PMA toe te voegen aan een liter absolute ethanol. Bewaar de bereide oplossing bij kamertemperatuur.

Bereid een reservoir van één liter dat 80 centimeter boven een dissectieschotel wordt ondersteund en koppel een thermoplastische buis aan een afvoerpoort van het reservoir. Bevestig een driewegkraan aan de afvoerbuis en koppel verdere thermoplastische buizen aan elke vrije poort op de driewegkraan. Bevestig tweewegkranen aan de vrije uiteinden van de slang.

Vul vervolgens het reservoir met de cardioplegische oplossing aangevuld met heparine. Open de kranen om de cardioplegische oplossing te laten draineren en verwijder alle luchtbellen. Sluit vervolgens de tweerichtingskranen.

Nadat u het hart van een geëuthanaseerd dier hebt geëxtraheerd, plaatst u het in een koude cardioplegische oplossing die op ijs is opgeslagen totdat het klaar is voor dissectie. Bereid vervolgens de canule voor de linker en rechter coronaire osteo door vijf centimeter PTFE-slang te snijden en het ene uiteinde te verwarmen door de punt naast een open vuur te plaatsen. Zodra een millimeter van de punt begint te smelten en doorschijnend wordt, drukt u de punt tegen een hard hittebestendig oppervlak om een richel aan de canulepunt te vormen om te voorkomen dat de canule uit de vaten glijdt en steekt u vervolgens een centimeter van het niet-verwarmde uiteinde van elke canule in de twee uiteinden van de afvoerreservoirafvoerslang.

Verwijder vervolgens de aortacanule en lokaliseer de linker- en rechterosteoste van de kransslagaders onder de koude cardioplegische oplossing. Gebruik een puntige schaar en scheid de aortawortel zorgvuldig van het omliggende weefsel boven en onder de coronaire osteo om het rijgen van een nulmeter zijden hechtdraad onder het coronaire vat mogelijk te maken. Open vervolgens de tweerichtingskranen en breng de canulepunten in de coronaire osteo.

Met de canulepunten die zich één tot twee centimeter uitstrekken in de osteo en voorbij de hechting, bindt u de canule af. Spoel vervolgens het hart terwijl u de ventrikels gedurende 15 minuten zachtjes masseert totdat het hart van bloed is ontdaan. Sluit na het spoelen de tweerichtingskranen, koppel ze los van de driewegkraan en breng het hart over naar een plastic chemicaliënbestendige container van één liter met 500 milliliter PBS / EDTA-oplossing.

Recirculeer de PBS/EDTA-oplossing in de thermoplastische buis onder een zuurkast met behulp van een peristaltische pomp met twee kanalen. Bereid de pompbuizen voor totdat de slang geen luchtbellen meer heeft. Bekijk vervolgens elke coronaire canule door recirculatie bij kamertemperatuur gedurende twee uur met 80 milliliter per minuut.

Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de zuurkast operationeel is, stopt u de pomp, giet u de oplossing uit de container en vervangt u deze door 10% formaline voor fixatie gedurende één uur bij 80 milliliter per minuut. Bekijk het hart met behulp van een reeks toenemende ethanolconcentraties, te beginnen met 20% ethanol gedurende minimaal drie uur. Vervang vervolgens de 20% ethanol door 30% ethanol en perfundeer gedurende twee uur.

Zet de perfusie voort door de ethanolconcentratie bij elke iteratie te verhogen met een minimale perfusie van één uur bij elke concentratie. Om het hartweefsel te versterken voordat het aan de lucht droogt, recirculeert u een gelijk mengsel van ethanol en HMDS gedurende 10 minuten gevolgd door 100% HMDS gedurende nog eens twee uur. Stop de perfusiepomp, koppel vervolgens de canule los van de slang en hang het hart op aan een aortanaag in de zuurkast.

Schuif voorzichtig een zak met ritssluiting over het hart en sluit de zakafdichting over de hechtdraad om de blootstelling van het hart aan de circulerende lucht te verminderen. Laat het hart een week drogen door verdamping. Voor contrastmiddelen voor diffusiebelasting verwijdert u de zak.

Was het hart gedurende 15 minuten in 100% ethanol met agitatie voordat u het onderdompelt in 100% ethanol aangevuld met 1% PMA gedurende 48 uur onder vacuüm, bedek het hart vervolgens met een zip lock-zak zoals eerder gedemonstreerd en laat het drogen. Monteer het luchtgedroogde hart op een geschikte monsterhouder. Om beweging tijdens de röntgenmicro-CT-metingen te voorkomen, gebruikt u een klem die aan de monsterhouder is verankerd en zet u het hart vast via de gedroogde en stijve aorta.

Monteer de monsterhouder in de micro CT-scanner. Open vervolgens de software en start het röntgenmicro-CT-systeem. Stel vervolgens het röntgenfilter aluminium in op één millimeter.

Röntgenbronspanning tot 60 kilovolt en stroom tot 120 microampère. Stel bovendien de afbeeldingsafmetingen in op 2, 016 bij 1, 344 pixels en pixelgrootte op 20 micrometer. Scout röntgentransmissiebeelden over de lengte van de ondersteuning om het totale beeldvormingsveld in de longitudinale toegang van het hart te bepalen.

Gebruik voor het scannen een rotatiestap van 0,18 graden, een framegemiddelde van vijf en een monsterrotatie van 180 graden door de optie voor een 360 graden acquisitie uit te schakelen. Selecteer de offset-scanmodus om de volledige breedte van de voorbeeldondersteuning weer te geven. Gebruik na het scannen de software voor tomografische reconstructie van een isotroop driedimensionaal beeldvolume.

Gebruik uiteindelijk recon-software acquisitiegerelateerde artefactcorrectie, inclusief bundelverhardingseffecten van 10% en ringartefactreductie van acht. Visualiseer vervolgens met behulp van Data Viewer-software de gereconstrueerde gegevensstack. Oriënteer het monster digitaal binnen de beeldgrenzen om de lange en korte as opnieuw uit te lijnen met het drieprincipe een as van het beeldvolume.

Snijd ten slotte het afbeeldingsvolume in alle drie de assen bij om de buitenste achtergrondlagen van de afbeelding te verwijderen en de totale afbeeldingsgrootte maximaal te verkleinen. Röntgentransmissiebeelden van luchtgedroogde varkensharten tonen belangrijke anatomische oriëntatiepunten, waaronder de ventriculaire holtes en de spierwand. Tomografische reconstructies van driedimensionale beeldvolumes toonden een duidelijke scheiding tussen weefsel en achtergrond op epicardiale en endocardiale grenzen.

Mason's trichrome kleuring toonde collageen positieve kleuring op de epitheliale en endotheellagen paravasculair in het sub-epicardiale weefsel. Heldere veldverlichting toonde donkere kleuring in collageenstructuren na PMA-kleuring, wat de preferentiële accumulatie van PMA ondersteunde. PMA-gekleurde fluorescerende beelden van ventriculaire weefselsecties hadden PMA-geïnduceerd verlies van fluorescentie op plaatsen van collageen.

Waar een hartmonster via perfusie werd gekleurd met een contrastmiddel voorafgaand aan het drogen, onthulde de beeldreconstructie zeer fragmentarische vlekken in het myocardiale compartiment. Bovendien vertoonde weefsel met een laag contrast een slechte scheiding van de achtergrondintensiteit. Micro CT-beeldvorming van een schapendeel dat leed aan een chronisch myocardinfarct onthulde een centrale dichte fibrotische laesie omgeven door een losse en heterogene grenszone.

De grootste signaalintensiteiten van gereconstrueerde beeldvolumes aan de weefselgrenzen en littekengebieden worden hier weergegeven. Contrastmiddelen bevlekten het gezonde myocard slecht, maar het microstructurele contrast bleef behouden. Bij de grenszone werd littekenweefsel afgewisseld met overlevend myocardium.

Dichte fibrose leek transmuraal maar toch getextureerd, wat wijst op variaties in samenstelling. Transmuraal linkerventrikelgebied van PMA-gekleurd weefselpreparaat vertoonde selectieve kleuring voor collageen en geen kleuring in gebieden met overlevend myocardium. Langere perfusietijden met ethanol worden aanbevolen om de volledige uitwisseling van het watergehalte van het hart met ethanol te garanderen.

Interacties tussen HMDS en het water produceren warmte, die het monster kan beschadigen. Een sterk voordeel van deze procedure is de mogelijkheid om micro CT-beeldvorming te valideren met behulp van histologie. Luchtgedroogde monsters kunnen direct worden ingebed in paraffine voor het snijden van kleuringen en microscopische beeldvorming.