Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen

Onze bevinding suggereert dat het optimaliseren van de endotheelcel cardiomyocyten co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming tegen gesimuleerde ischemie reprofusieschade. Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van cel-celinteracties op celfunctie en differentiatie te onderzoeken. Afzonderlijke behandelingen tussen celtypen en downstream-analyse van een enkel celtype zijn echter niet gemakkelijk haalbaar in de gemengde co-cultuur.

De huidige studie was gericht op het creëren van twee afzonderlijke cellagen met een betekenisvolle afstand ertussen, waar men hypoxie-reprofusieschade kan induceren en het resultaat en de effecten op een enkel celtype kan bestuderen. Begin de voorbereiding door beide cellijnen te ontdooien. Verguld de cellen in T25-kolven na het wassen met verse media.

Ververs de volgende dag de cellen met media en gebruik deze bij confluent. Houd de celkweekincubator op 37 graden Celsius met 21% zuurstof, 5% koolstofdioxide en 74% stikstof. Houd het bevochtigd.

Schat de cardiomyocyten cellijnconfluentie onder een lichtmicroscoop. Verwijder de media uit de kolven met confluentcelculturen en trypsiniseren met drie tot vijf milliliter trypsine-EDTA per kolf. Roer de kolf voorzichtig en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee tot vijf minuten.

Beoordeel daarna de enzymatische voortgang onder een lichtmicroscoop. Inactiveer na het losmaken de trypsine-oplossing door de trysin- of celoplossing toe te voegen aan een buis van 50 milliliter met 10 milliliter media per T25-kolf. Centrifugeer de celsuspensie gedurende twee minuten bij 120 x g om een zachte celkorrel te verkrijgen.

Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspend de pellet in vijf milliliter van een medium. Voer vervolgens het tellen van cellen uit en bevestig de levensvatbaarheid van de cel. Meng en aliquot van 10 microliter geresuspendeerde cellen en 10 microliter trypan blauwe kleurstof, tel vervolgens de levende cellen met behulp van een celteller.

Verdun de cellen met verse reguliere media om de gewenste zaaidichtheden te bereiken. Neem een 24-well plaat voorbestemd met extracellulaire matrix en plaat cardiomyocyten bij zaaidichtheden van 300.000 per put op de bodem van de plaat. Houd de cellen 's nachts op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Na 24 uur worden endotheelcellen in inserts geplaatst met een optimale platingsdichtheid van 100.000 per insert. Plaats na 24 uur endotheelcelbeplating endotheelcelinzetstukken in de cardiomyocytenputten en start de co-kweek. Laat cellen 12 tot 24 uur meekleven voordat de experimenten worden uitgevoerd.

Bereid de hypoxische media voor door ongeveer 25 milliliter media in een conische buis van 50 milliliter te gieten. Luchtdicht de bovenkant af met een siliconen membraan en gebruik een gesteriliseerde pipet om een gat te ponsen. Maak daarna nog een gat en laat ongeveer 2/3 van de pipetten ondergedompeld in de media.

Spoel de media gedurende vijf minuten met hypoxisch gas met een stroomsnelheid van 30 liter per minuut en gooi vervolgens de media van de 24-putplaten of kweekinzetstukken met aangehechte cellen weg. Was ze heel voorzichtig met 100 microliter van 10% PBS per put voeg 500 microliter van de vers bereide hypoxische media toe aan elke put van de platen of inzetstukken. Vervang de oorspronkelijke media door verse normale media met glucose en serum in de normoxische controlegroep.

Plaats een petrischaal gevuld met steriel water in de hypoxiekamer om de kamer te bevochtigen. Plaats vervolgens de platen met de hypoxische groepen in de kamer. Spoel de hypoxiekamer gedurende vijf minuten met hypoxisch gas bij een stroom van 30 liter per minuut.

Plaats daarna de kamer in een couveuse bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Gooi na hypoxie de oude media van de platen of inserts weg en voeg 500 microliter normale media met glucose en serum toe aan elke wand van de platen en bewaar de platen vervolgens gedurende twee uur in een incubator onder normale kweekomstandigheden om reperfusie na te bootsen. Breng de celkweekmedia van de 24-well-plaat over in een 96-well-plaat, neem vervolgens 200 microliter media uit elke put van de 24-well-plaat en gelijkmatig verdeeld in vier putten van de 96-well-plaat.

Meet de absorptie voor LDH met behulp van een cytotoxiciteitstestkit in een 96-well plaat en volg de instructies van de fabrikant om de mate van cellulair letsel te bepalen. In deze studie werden drie soorten inserts geëvalueerd. Alle drie de inserts hadden dezelfde poriegrootte van 0,4 micrometer.

Het enige verschil tussen hen was de insert tot basishoogte, waardoor de afstanden tussen de twee samen gekweekte cellagen 0,5, 1,0 en 2,0 millimeter konden zijn. Met behulp van dit protocol werden cellen gekweekt onder normale zuurstofomstandigheden en vervolgens opgesplitst in twee groepen, een normoxische controlegroep en de hypoxiegroep. Na 24 uur werden beide groepen ververst met media en nog eens twee uur onder normale zuurstofomstandigheden gekweekt voordat de eindpunttests werden uitgevoerd.

Een vergelijking van de drie soorten kweekinzetstukken bij het beoordelen van lactaatdehydrogenaseafgifte voor cardiomyocyten alleen, endotheelcellen alleen en co-cultuur van cardiomyocyten met endotheelcellen wordt hier getoond onder normoxische, hypoxie alleen en hypoxie reoxygenatie condities. Met een afstand van 0,5 millimeter tussen de cellagen leidde hypoxie tot een significant verhoogde LDH-afgifte in vergelijking met normoxie wanneer cardiomyocyten alleen werden gekweekt. De LDH was echter slechts licht verhoogd in de hypoxie-reoxygenatiegroep in vergelijking met de hypoxie-onlygroep.

Wanneer endotheelcellen en cardiomyocyten samen werden gekweekt, werd de toename van LDH-afgifte onder de hypoxie-omstandigheden niet verzwakt. Dit geeft aan dat de endotheelcellen geen beschermend effect hadden in vergelijking met de cardiomyocyten alleen groep onder de hypoxie alleen voorwaarden. Endotheelcellen oefenden echter een milde maar significante bescherming uit op cardiomyocyten tijdens HR. Wanneer de afstand tussen de cellagen één millimeter was, was de LDH-afgifte ook significant verhoogd in cardiomyocyten alleen onder de hypoxie-voorwaarde.

In tegenstelling tot de insert van 0,5 millimeter, werd de LDH-toename in cardiomyocyten echter alleen versterkt door HR over hypoxie-aandoeningen. Deze toename was nog meer uitgesproken met de insert van twee millimeter. De concentratie van endotheelcellen in inserts van twee millimeter werd getitreerd tot respectievelijk 25.000, 50.000 en 100.000 cellen per insert.

het bleek dat toenemende endotheelcelintensiteit in de co-cultuur leidde tot een dosisafhankelijke verzwakking van LDH-afgifte veroorzaakt door HR. Een dergelijk effect werd echter niet waargenomen onder normoxische omstandigheden. Deze co-kweekmethode is niet beperkt tot endotheelcellen en cardiomyocyten. Deze methoden moeten helpen bij een onderzoek naar specifieke cel-celinteracties tussen verschillende cellijnen over meerdere organen van belang.