Name: Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer een celcocultuurmodel ontwikkelen voor cardiale ischemie/reperfusie in vitro met endotheel- en cardiomyocytlagen. Deze methode optimaliseert ruimtelijke afstand voor onderzoek naar celbescherming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Us Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) en door institutionele fondsen aan M.L.R.

1. Experimentele voorbereiding/beplating
<ol><li>Onderhoud CM's en EC's volgens de instructies van de fabrikant.<ol>
<li>Ontdooi beide cellijnen wanneer ze van leveranciers komen. Plaat in T25-kolven na het wassen met verse media. Het wordt aanbevolen om elk celkweekmedium te kopen bij dezelfde leveranciers waar de cellen zijn gekocht. Ververs de volgende dag de cellen met media en gebruik deze bij confluent.</li>
		<li>Houd de celkweekincubator op 37 °C met 21% O2, 5% CO2, 74% N2 en bevochtigd. OPMERKING: De primaire coronaire endotheelcellen van de muis die in dit protocol worden gebruikt, worden geïsoleerd uit kransslagaders van C57BL / 6-muizen en cardiomyocyten van volwassen muizen worden geïsoleerd uit volwassen C57BL / 6J-muizenharten en commercieel verkregen (zie Tabel met materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaat-CMs onder steriele omstandigheden op de bodem van 24-well platen (inferieure laag). 24 uur later, plaat EC's in de insert (of een groter deel) van de co-kweekput. Plaats 24 uur na ec-beplating ec-inzetstukken op cm-plaatbodems, waarbij de cokweekperiode begint. Laat de cellen voor gebruik minstens 12-24 uur meekleven. Deze stappen worden hieronder in detail beschreven.<ol>
<li>Schat cm cellijn confluency onder een lichtmicroscoop. Wanneer cellen 90% -100% confluent lijken te zijn in kweekkolven, ga dan verder met experimentele plating.</li>
		<li>Verwijder de media uit de kolven met confluentcelculturen en trypsiniseren met 3-5 ml trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) voor T25-kolven. Roer de kolf voorzichtig, incubeer bij 37 °C gedurende 2-5 minuten en beoordeel vervolgens de enzymatische voortgang onder een lichtmicroscoop. Zodra de cellen beginnen af te ronden, gebruikt u een celschraper om de cellen van het oppervlak los te maken.</li>
		<li>Inactiveer na het losmaken de trypsine-oplossing door de trypsine/celoplossing toe te voegen aan een buis van 50 ml met 10 ml media voor T25-kolven. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 2 minuten bij 120 x g om een zachte celkorrel te verkrijgen. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 5 ml media.</li>
		<li>Om het tellen van cellen uit te voeren en de levensvatbaarheid van cellen te bevestigen, mengt u een aliquot van 10 μL geresuspendeerde cellen en 10 μL trypan blauwe kleurstof. Tel de levende cellen met behulp van een celteller. Verdun de cellen met verse reguliere media om de gewenste zaaidichtheden te bereiken. Volumes worden berekend afhankelijk van de gewenste zaaddichtheid en celconcentratie van stamoplossingen. Alle beplating moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.</li>
		<li>Plaat-CM's bij zaaidichtheden van 300.000 per put op de bodem van een 24-putplaat voorgecoat met extracellulaire matrix. Houd de cellen 's nachts op 37 °C met 21% O2 en 5% CO2 .</li>
		<li>Na 24 uur worden EC's in inserts geplaatst met een optimale beplatingsdichtheid van 100.000 per insert (kweekgebied is 33,6 mm2) (figuur 1). Plaats na 24 uur EC-beplating EC-inserts in de CM-putten, waardoor de co-kweek wordt gestart. Laat cellen 12-24 uur meekleven voordat de experimenten worden uitgevoerd.</li>
		<li>Zorg ervoor dat tegen de tijd dat experimenten worden uitgevoerd, zowel CM's als EC's 80% -90% samenvloeiing hebben bereikt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hypoxie/reoxygenatie om ischemie/reperfusieschade in vitro te simuleren
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd zoals beschreven, pauzeer niet tussendoor.
<ol><li>Bereid de hypoxische media voor door ~ 25 ml media in een conische buis van 50 ml te gieten. Luchtdicht de bovenkant af met een siliconenmembraan en gebruik een gesteriliseerde pipet om een gat te ponsen. Maak nog een gat, dit keer laat de pipet ongeveer 2/3 ondergedompeld in de media.</li>
	<li>Spoel de media gedurende 5 minuten met hypoxisch gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) met een debiet van 30 l/min. Dit minimaliseert O2 opgelost in de media wanneer hypoxie begint (stap 2.5).</li>
	<li>Gooi de media van de 24-well platen of kweekinzetstukken met aangehechte cellen weg en was met 100 μL/putje van 10% Phosphate Buffered Saline (PBS) heel voorzichtig. Voeg daarna 500 μL van de vers bereide hypoxische media toe aan elk putje van de platen of inserts. OPMERKING: Hypoxie in de media wordt tijdens deze stap zo kort mogelijk onderbroken voordat echte hypoxie voor cellen en media begint in stap 2.5.<ol>
<li>Vervang in de normoxische controlegroep de oorspronkelijke media door verse normale media die glucose en serum bevatten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bevochtig de hypoxiekamer door een petrischaal gevuld met steriel water in de kamer te plaatsen. Plaats vervolgens de platen bestaande uit de hypoxische groepen in de kamer.</li>
	<li>Spoel de hypoxiekamer met hypoxisch gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) gedurende 5 minuten bij een debiet van 30 L/min. Plaats de kamer gedurende 24 uur in de incubator van 37 °C.</li>
	<li>Kweek na hypoxie CM's en EC's onder normale omstandigheden. Om dit te doen, gooit u de oude media van de platen/inserts weg, vervangt u deze door normale media (met glucose en serum; 500 μL van elke put/insert) en bewaart u deze gedurende 2 uur in de incubator onder normale kweekomstandigheden (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37 °C) om reperfusie na te bootsen.</li>
	<li>Om de effecten van mediavervanging te controleren, verandert u de media van normoxische cellen op hetzelfde moment dat de hypoxische media worden gewijzigd. OPMERKING: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van dit protocol.</li>
</ol>3. Eindpuntbeoordeling
<ol><li>Breng de celkweekmedia van de 24-putplaat over in een 96-putplaat. Gebruik 200 μL media uit elke put van de 24-well plaat en verdeel dienovereenkomstig in vier putten van de 96-well plaat. Gebruik elk één plaat voor normoxie versus hypoxie versus HR.</li>
	<li>Bepaal de mate van cellulair letsel, bijvoorbeeld door de absorptie voor LDH te meten met behulp van een cytotoxiciteitstestkit volgens de instructies van de fabrikant. Voer de test uit in een 96-well plaat zoals geïnstrueerd in het assayprotocol.</li>
</ol>4. Statistieken
<ol><li>Geef de parametrische gegevens weer als gemiddelde/standaarddeviatie en niet-parametrische gegevens als boxplots met mediaan/interkwartielbereik. Er moeten adequate parametrische versus niet-parametrische meervoudige vergelijkingstests met aanvaardbare post-hoctests worden uitgevoerd om de kans op een type-1-fout te verkleinen. Significantie wordt meestal ingesteld op een alfa van 0,05 (tweezijdig).</li>
	<li>Voor alle experimenten die in de huidige studie zijn uitgevoerd, moet u ten minste drie goed repliceren uitvoeren binnen één experiment. Er waren drie tot zes herhalingen van elk experiment dat werd gebruikt voor statistische analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury%3A+a+30+year+voyage+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).</li>
<li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+a+neglected+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+pathways+in+acute+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li>
<li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li>
<li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li>
<li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711(2012).</li>
<li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Kritieke stappen in het protocol Celco-cultuurmodellen zijn gebruikt om cellulaire mechanismen van cardioprotectie te bestuderen. Het creëren van twee afzonderlijke lagen met een betekenisvolle afstand ertussen is dus cruciaal voor de ontwikkeling van een geschikt co-cultuurmodel. Een uitdaging bij het bestuderen van gesimuleerde IR, d.w.z. HR, letsel is dat niet alleen ischemie (hypoxie) zelf, maar ook reperfusie (reoxygenatie) cellulaire disfunctie verergert. Daarom moet een realistisch model deze k...

Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit 1,2. Het behandelingsproces van reperfusie kan echter zelf de dood van cardiomyocyten veroorzaken, bekend als myocardiale ischemie / reperfusie (IR) -letsel, waarvoor er nog steeds geen effectieve remedie is3. Er is gesuggereerd dat endotheelcellen (EC's) cardiomyocyten (CMs) beschermen door de secretie van paracriene signalen, evenals cel-tot-cel interacties4.
Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van autocriene en /of paracriene cel-celinteracties op celfunctie en differentiatie te onderzoeken. Onder co-cultuurmodellen is gemengde co-cultuur de eenvoudigste, waarbij twee verschillende soorten cellen in direct contact staan binnen een enkel kweekcompartiment met een gewenste celverhouding5. Afzonderlijke behandelingen tussen celtypen en downstream-analyse van een enkel celtype zijn echter niet gemakkelijk haalbaar gezien de gemengde populatie.
Eerdere studies toonden aan dat hypoxische en ischemische beledigingen aanzienlijke schade toebrengen aan de integriteit van het celmembraan zoals gemeten door de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH). Dit letsel wordt verergerd bij reoxygenatie, waarbij reperfusieletselwordt nagebootst 6,7,8. Het doel van het huidige protocol was om de hypothesen te testen dat de aanwezigheid van EC's dosisafhankelijk celmembraanlekkage van CM's veroorzaakt door hypoxie en reoxygenatie (HR) kan dempen en dat het beschermende effect van EC's kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren. Daarom gebruikten we drie soorten celkweekinzetstukken en muis primaire coronaire endotheelcellen en cardiomyocyten van volwassen muizen. De inserts, gebrandmerkt door Corning, Merck Millipore en Greiner Bio-One, stelden ons in staat om drie verschillende celkweekkruisverwijzingen te creëren met intercellulaire afstanden van respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm. Per inzetstuk werden telkens 100.000 EC's verguld.
Om te bepalen of de dichtheid van EC's in co-cultuur bijdraagt aan hr-letselverzwakking in dit model, bestudeerden we bovendien de dosis-responsrelatie tussen EC-concentratie en LDH-afgifte door CM's. EC's werden geplateerd op respectievelijk 25.000, 50.000 en 100.000 per insert in de insert van 2,0 mm.
Dit rapport biedt een stapsgewijze aanpak voor onderzoekers om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.

<table><tbody><tr><td>Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td><td>Celprogen Inc</td><td>11041-14</td><td>Geïsoleerd uit hartweefsel van volwassen C57BL/6J muis</td></tr><tr><td>Automated Cell Counter Countess II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>Celtelling voor het berekenen van celaantal</td></tr><tr><td>Bio-Safety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU425400</td><td>Steriele kap voor celcultuur</td></tr><tr><td>Cell Culture Freezing Medium</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6916</td><td>Gebruikt voor celvrieswerk voor lange termijn celopslag</td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator</td><td>Nuaire</td><td>Nu-5500</td><td>Om normale leefomstandigheden voor cellen te bieden (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&deg;C, bevochtigd)</td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator Gas Tank</td><td>A-L Compressed Gases</td><td>UN1013</td><td>Gas voor celcultuur incubator</td></tr><tr><td>Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td><td>Corning Inc</td><td>353095</td><td>Gebruikt voor EC-CM co-cultuur</td></tr><tr><td>Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td><td>Millicell Millipore</td><td>PIHP01250</td><td>Gebruikt voor EC-CM co-cultuur</td></tr><tr><td>Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662640</td><td>Gebruikt voor EC-CM co-cultuur</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Anstel Enterprises Inc</td><td>4235</td><td>Voor celcultuur plateren en passeren</td></tr><tr><td>CMs Cell Culture Flasks T25</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14</td><td>Gebruikt voor reguliere CMs-cultuur, gecoat door fabrikant</td></tr><tr><td>CMs Cell Culture Medium Complete</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14S</td><td>Volledige CMs-cultuurmedium</td></tr><tr><td>CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14PN</td><td>CMs-cultuurmedium zonder fenol rood gebruikt tijdens LDH-meting</td></tr><tr><td>CMs Cell Culture Plates 96 well</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14-96well</td><td>Gebruikt voor experimenten van LDH-meting, gecoat door fabrikant</td></tr><tr><td>CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14GFPN</td><td>CMs-celcultuur onder hypoxische omstandigheden (glucose- en serumvrij)</td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Tellende slides gebruikt voor celteller</td></tr><tr><td>Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>C20301</td><td>LDH-meetkit</td></tr><tr><td>ECs Cell Culture Flasks T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012935</td><td>Gebruikt voor reguliere ECs-cultuur</td></tr><tr><td>ECs Cell Culture Medium Complete</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168</td><td>Volledige ECs-cultuurmedium</td></tr><tr><td>ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168PF</td><td>ECs-cultuurmedium zonder fenol rood gebruikt tijdens LDH-meting</td></tr><tr><td>ECs Cell Culture Plates 96 well</td><td>Fisher Scientific (Costar)</td><td>3370</td><td>Gebruikt voor experimenten van LDH-meting</td></tr><tr><td>ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6950</td><td>Gebruikt voor het coaten van flesschen en platen voor ECs</td></tr><tr><td>ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>GPF1168</td><td>ECs-celcultuur onder hypoxische omstandigheden (glucose- en serumvrij)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35011CV</td><td>FBS-HI USDA-goedgekeurd voor celcultuur en onderhoud</td></tr><tr><td>Hypoxia Chamber</td><td>StemCell Technologies</td><td>27310</td><td>Om een hypoxische omgeving met 0,01%O2 te creëren</td></tr><tr><td>Hypoxia Chamber Flow Meter</td><td>StemCell Technologies</td><td>27311</td><td>Om te verbinden met hypoxische gastank voor een consistente gasstroomsnelheid</td></tr><tr><td>Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td><td>A-L Compressed Gases</td><td>UN1956</td><td>Gebruikt om hypoxisch medium en kamer te spoelen (0,01%O2/5%CO2/94,99N2)</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Om celconditie waar te nemen</td></tr><tr><td>Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>C57-6093</td><td>Geïsoleerd uit coronaire slagader van C57BL/6 muizen</td></tr><tr><td>NUNC 15ML CONICL Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td>Voor celcultuur proces, experimenten, oplossingsvoorbereiding etc.</td></tr><tr><td>NUNC 50ML CONICL Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td>Voor celcultuur proces, experimenten, oplossingsvoorbereiding etc.</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Gebruikt voor celwassen tijdens cultuur of experimenten</td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>BioTek Instrument</td><td>11120533</td><td>Colorimetrische of fluorometrische platenlezing</td></tr><tr><td>Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565226</td><td>Gebruikt voor LDH-meting platenlezing</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA for CMs</td><td>Celprogen Inc</td><td>T1509-014</td><td>1 x sterieel gefilterd en getest voor weefselcultuur</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA for ECs</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6914/0619</td><td>0,25%, getest voor celcultuur</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit. Reperfusie veroorzaakt extra letsel buiten ischemie. Endotheelcellen (EC's) kunnen cardiomyocyten (CM's) beschermen tegen reperfusieschade door cel-celinteracties. Coculturen kunnen helpen bij het onderzoeken van de rol van cel-cel interacties. Een gemengde co-kweek is de eenvoudigste benadering, maar is beperkt omdat geïsoleerde behandelingen en downstream-analyses van enkele celtypen niet haalbaar zijn. Om te onderzoeken of EC's dosisafhankelijk CM-celschade kunnen dempen en of deze bescherming verder kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren, gebruikten we muis primaire coronaire endotheelcellen en volwassen muis cardiomyocyten om drie soorten celkweekinzetstukken te testen die varieerden in hun intercellelijke laagafstand bij 0,5, Respectievelijk 1,0 en 2,0 mm. In CMs-only nam cellulair letsel zoals beoordeeld door lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte significant toe tijdens hypoxie en verder na reoxygenatie wanneer de afstand 2,0 mm was in vergelijking met 0,5 en 1,0 mm. Wanneer EC's en CM's bijna direct contact hadden (0,5 mm), was er slechts een lichte demping van de reoxygenatieschade van CM's na hypoxie. Deze demping werd aanzienlijk verhoogd wanneer de ruimtelijke afstand 1,0 mm was. Met een afstand van 2,0 mm verzwakten EC's CM-letsel tijdens zowel hypoxie als hypoxie / reoxygenatie, wat aangeeft dat voldoende cultuurafstand nodig is voor EC's om te kruisverwijzingen met CM's, zodat uitgescheiden signaalmoleculen kunnen circuleren en beschermende paden volledig kunnen stimuleren. Onze bevindingen suggereren voor het eerst dat het optimaliseren van de EC / CM co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van EC's in CM-bescherming tegen gesimuleerde ischemie / reperfusieletsel. Het doel van dit rapport is om onderzoekers een stapsgewijze aanpak te bieden om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.

Alle drie de soorten inserts (A, B, C) die in dit experiment worden gebruikt, hebben dezelfde poriegrootte van 0,4 μm. Het enige verschil tussen hen is de insert-to-base hoogte, waardoor afstanden tussen de twee samengekweekte cellagen respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm kunnen zijn (figuur 3) en dat ze van verschillende leveranciers zijn (zie tabel met materialen voor details).
Om een in vitro co-kweekmodel op te zetten met afzonderlijke ...

Ruimtelijke afstand is een belangrijke parameter bij het beoordelen van hypoxie / reoxygenatieletsel in een co-cultuurmodel van afzonderlijke endotheel- en cardiomyocytencellagen, wat voor het eerst suggereert dat het optimaliseren van de co-culturele ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming.

Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Onze bevinding suggereert dat het optimaliseren van de endotheelcel cardiomyocyten co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming tegen gesimuleerde ischemie reprofusieschade. Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van cel-celinteracties op celfunctie en differentiatie te onderzoeken. Afzonderlijke behandelingen tussen celtypen en downstream-analyse van een enkel celtype zijn echter niet gemakkelijk haalbaar in de gemengde co-cultuur.De huidige studie was gericht op het creëren van twee afzonderlijke cellagen met een betekenisvolle afstand ertussen, waar men hypoxie-reprofusieschade kan induceren en het resultaat en de effecten op een enkel celtype kan bestuderen. Begin de voorbereiding door beide cellijnen te ontdooien. Verguld de cellen in T25-kolven na het wassen met verse media.Ververs de volgende dag de cellen met media en gebruik deze bij confluent. Houd de celkweekincubator op 37 graden Celsius met 21% zuurstof, 5% koolstofdioxide en 74% stikstof. Houd het bevochtigd.Schat de cardiomyocyten cellijnconfluentie onder een lichtmicroscoop. Verwijd

development-cell-co-culture-model-to-mimic-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Het epicardium is een essentiële bron van multipotente cardiovasculaire stamcellen en paracriene factoren die nodig zijn voor cardiovasculaire ontwikkeling en regeneratie. We beschrijven hier een methode om muis embryonale epicardiale cellen te kweken.

In Vitro Cultuur van epicardiale cellen uit muis embryonale Heart

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

We presenteren een model van ischemische hartziekten met behulp van cardiomyocyten afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, samen met een methode voor kwantitatieve evaluatie van weefselschade veroorzaakt door ischemie. Dit model kan een nuttig platform bieden voor screening van geneesmiddelen en verder onderzoek naar ischemische hartziekten.

Model van ischemische hartziekten en video-gebaseerde vergelijking van Cardiomyocyte Contractie met behulp van hiPSC-afgeleide Cardiomyocyten

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

De verschillende effecten van verschillende graden van onderkoeling op myocardbescherming zijn niet grondig geëvalueerd. Het doel van deze studie was om de niveaus van celdood na verschillende hypothermiebehandelingen te kwantificeren in een op humane cardiomyocyten gebaseerd model, dat de basis legde voor toekomstig diepgaand moleculair onderzoek.

In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Dit artikel beschrijft ischemie-reperfusie (I / R) modellering in een 3-daags kuikenembryo met behulp van een spinale naald aangepaste haak om de I / R-ontwikkeling en -behandeling beter te begrijpen. Dit model is eenvoudig, snel en goedkoop.

Generatie van Haak Ischemie-Reperfusie Model met behulp van een driedaagse ontwikkelende kuiken embryo

Driedimensionale hartweefsels die bio-engineered zijn met behulp van van stamcellen afgeleide cardiomyocyten zijn naar voren gekomen als veelbelovende modellen voor het bestuderen van gezond en ziek menselijk myocardium in vitro , terwijl ze de belangrijkste aspecten van de inheemse cardiale niche recapituleren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het vervaardigen en analyseren van gemanipuleerde hartweefsels met een hoog gehalte die zijn gegenereerd uit door de mens geïnduceerde...

Ontwerp van een bioreactor om de data-acquisitie en modeldoorvoer van gemanipuleerde hartweefsels te verbeteren

De huidige studie demonstreert een zeer reproduceerbaar diermodel van acute regionale myocardischemie en reperfusieletsel bij konijnen met behulp van een linker mini-thoracotomie voor overlevingsgevallen of een middellijnsternotomie voor niet-overlevingsgevallen.

Model van ischemie en reperfusieletsel bij konijnen

Zelfassemblage menselijke cardiale organoïden (hCO's) zijn een opkomend systeem voor het modelleren van menselijke hartontwikkeling en ziekte. Hier wordt een methodologie gegeven voor het genereren en beschadigen van hCO's met hypoxie-reoxygenatie en details van verwachte histologische en functionele uitkomsten na een verwonding.

Een hypoxie-reoxygenatie-schademodel bij zelf-assemblerende menselijke cardioïden

Leer een celcocultuurmodel ontwikkelen voor cardiale ischemie/reperfusie in vitro met endotheel- en cardiomyocytlagen. Deze methode optimaliseert ruimtelijke afstand voor onderzoek naar celbescherming.

Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen

Meer video's verkennen