Gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuring van vier endometriumimmuunceltypen bij terugkerende miskraam
4 augustus 2021
Ondanks de vooruitgang in multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming, blijft het karakteriseren van de dichtheid en clustering van belangrijke immuuncellen tegelijkertijd in het endometrium een uitdaging. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd multiplexkleuringsprotocol en beeldvorming voor de gelijktijdige lokalisatie van vier immuunceltypen in het endometrium.
De huidige technologie maakt het gebruik van antilichamen in dezelfde soort mogelijk voor het detecteren van maximaal zeven markers. De procedure wordt gedemonstreerd door Loucia Chan, een technicus van het laboratorium. Begin met het voorbereiden van de formaline-gefixeerde paraffine ingebedde glazen dia's gemonteerd met het weefselmonster, door de dia's plat in een oven te plaatsen, om te bakken op 60 graden Celsius met het weefsel naar boven gericht.
Na een uur ontwas en rehydrateer de dia's per 10 minuten elk met de reeks chemicaliën, zoals beschreven in het manuscript. Dompel de dia's onder in tris-gebufferde zoutoplossing en vervolgens in een plastic diadoos gevuld met een mengsel van formaldehyde verdund in methanol, om de monsters te fixeren. Was vervolgens de glaasjes twee keer in gedeïoniseerd water gedurende twee minuten.
Ga verder met het ophalen van epitoop door het rek met dia's in een hittebestendige doos gevuld met citroenzuurbuffer bij pH 6,0 te plaatsen. En dan de doos in de magnetron plaatsen, om de dia's eerst 50 seconden op 100% vermogen te verwarmen, gevolgd door 20 minuten op 20% vermogen, om dezelfde temperatuur te behouden. Na het spoelen van de glaasjes in gedestilleerd water en het wassen met TBST, dompel je de glaasjes gedurende 10 minuten onder in een pot met een peroxidatieblokkerende oplossing.
Spoel na de incubatie de glaasjes in gedestilleerd water en was met TBST en gebruik vervolgens een hydrofobe barrièrepen om een grens rond het weefselgedeelte op de dia te markeren. Spoel vervolgens de dia af in TBST, bedek de weefselsecties met de blokkerende buffer en incubeer de dia's gedurende 15 minuten in een bevochtigde kamer. Om de blokkerende reagentia te verwijderen, incubeert u eerst de dia's met het primaire antilichaam van belang en verwijdert u vervolgens het primaire antilichaam door de dia's driemaal te wassen met TBST, vóór incubatie met het polymeer mierikswortelperoxidase gelabeld, secundair antilichaam.
Was na de incubatie de dia's voordat u de opaalflora voor TSA-werkoplossing aanbrengt en spoel de dia vervolgens af met de antigeenophaalbuffer. Voer de op microgolven gebaseerde stripping uit door de dia's in antigeenherstelbuffer in een magnetron te verwarmen op 100% vermogen, gedurende 50 seconden, gevolgd door 20% stroom gedurende 20 minuten in de magnetronveilige containers. Na het afkoelen van de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, spoel de glaasjes in gedestilleerd water en TBST en incubeer later gedurende vijf minuten met dappy oplossing.
Droog vervolgens de schuif aan de lucht voordat u deze monteert met het juiste montagemedium. Voordat u de dia's afbeeldt, worden de juiste filters in het werkstation ingesteld. Leg minimaal 10 velden vast voor analyse onder 200 keer vergroting.
Als u de cellen wilt tellen, klikt u op de knop Objecten tellen in de stappenbalk om het deelvenster instellingen voor het tellen van objecten weer te geven. Als het weefsel is gesegmenteerd, selecteert u de weefselcategorie waarin de objecten zich bevinden. Selecteer vervolgens de gewenste signaalschaling uit auto-scale of fixed scale.
Voor objectsegmentatie selecteert u de primaire component in de vervolgkeuzelijst. Als u wilt detecteren dat objecten andere objecten aanraken als afzonderlijke en niet-gecombineerde objecten, vinkt u het selectievakje Maximale grootte en pixels aan en kiest u vervolgens voor de verfijnde splitsing. Tel vervolgens alle stromale cellen in de immuuncellen afzonderlijk, om de gegevens uit te drukken als de percentages van de immuuncellen ten opzichte van het totale aantal stromale cellen voor elk vastgelegd beeld.
Rapporteer later het uiteindelijke celgetal als een gemiddelde van alle velden. Bekijk met behulp van de weergave-editor de resulterende gegevenstabellen nabewerking en exporteer vervolgens de tabel met telgegevens. In de representatieve analyse, vier immuunceltypen in het endometriummonster, zijn we gedifferentieerd.
De bewerkte afbeelding toont weefselsegmentatie als epitheliale en stromale compartimenten. De multiplex immunostaining werd uitgevoerd op de endometriumbiopten van een vruchtbare controlevrouw en een vrouw met onverklaarbare terugkerende miskraam, enkele vloer voor ons die CD3, CD56, CD68 en CD20 vertegenwoordigde, werden onthuld in de immunostaining. Zodra het immuungeluid is geïdentificeerd, kan verdere kleuring onder het cytokine helpen om hun interactie en mechanisme voor implantatiesucces aan te pakken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie behandelt de uitdagingen bij het gelijktijdig karakteriseren van de dichtheid en clustering van belangrijke immuuncellen in het endometrium met behulp van multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming. Er wordt een gedetailleerd kleuringsprotocol beschreven voor de gelijktijdige lokalisatie van vier typen immuuncellen in het endometrium.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Immunologie
- Endometriumbiologie
- Multiplex imaging-technieken
Achtergrond
- Belang van immuuncelkarakterisering in de reproductieve biologie.
- Uitdagingen bij traditionele kleuringsmethoden.
- Vooruitgang in beeldvormingstechnologie.
Gebruikte methoden
- Multiplex immunohistochemie
- In formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde weefselmonsters
- Multispectrale beeldvorming
Belangrijkste resultaten
- Vier typen immuuncellen (CD3, CD56, CD68, CD20) in het endometrium succesvol gedifferentieerd.
- De distributie en clustering van immuuncellen gevisualiseerd.
- Protocolverbeteringen geleverd voor verdere studies.
Conclusies
- De studie demonstreert een betrouwbare methode voor de analyse van immuuncellen in het endometrium.
- Dit heeft implicaties voor het begrip van de reproductieve gezondheid en het succes van de implantatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Multiplexe fluorescent immunohistochemische kleuring maakt gelijktijdige kwantificatie van meerdere immuuncelpopulaties binnen één enkel weefselcoupe mogelijk, waarmee een kritisch hiaat in het onderzoek naar reproductieve immunologie wordt opgevuld. Deze aanpak ondersteunt het mechanistische risicobeheer van hypothesen over de endometriummicro-omgeving door ruimtelijk opgeloste, multiplexe immuunprofielgegevens direct uit patiëntafgeleide monsters te leveren. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen in inspanningen voor targetvalidatie met betrekking tot implantatiefalen en recidiverende miskramen door een directe vergelijking van immuunceldichtheid en clustering tussen fertile en pathologische toestanden mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen met betrekking tot interacties tussen immuuncellen in het endometrium mogelijk door de gelijktijdige detectie van CD3-, CD56-, CD68- en CD20-markers.
- Operationele waarde: Vermindert de noodzaak van seriële doorsneden en kleuringen, waardoor kostbare klinische monsters worden gespaard terwijl de datadichtheid per weefselcoupe wordt verhoogd.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Levert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste metrieken van immuuncellen die bijdragen aan biologische risicoreductie van targets die betrokken zijn bij de endometriale immuuncross-talk tijdens de implantatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare fluorescente uitlezingen die geschikt zijn voor high-content imaging-platforms en geautomatiseerde workflows voor beeldanalyse.
- Schaalbaarheid: Compatibel met biobanken van in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed (FFPE) weefsel, wat retrospectieve analyse van grote cohorten voor biomarkerontdekking mogelijk maakt.
- Multiplex-optimalisatie: Pakt fluorofoorinterferentie aan via sequentiële kleurings- en strippingcycli, waardoor de signaalspecificiteit voor elke immuuncelmarker wordt gewaarborgd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevante systeem: Direct toepasbaar op humane endometriumbiopten, wat een klinisch relevant model biedt voor het bestuderen van immuundisregulatie bij recidiverende miskramen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen immuunprofilering in de ontdekkingsfase en preklinische validatie door consistente immuunfenotypering over verschillende monster-types mogelijk te maken.
- Mechanistische risicoreductie: Ondersteunt het onderzoek naar cytokine-gemedieerde interacties tussen immuuncellen na de initiële identificatie van celtypen, wat de validatie van targets op pathway-niveau vergemakkelijkt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fase van discovery biology en ondersteunt specifiek de validatie van immuuntargets en fenotypische screeningsinspanningen in programma's voor reproductieve immunologie.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing mogelijk met betrekking tot de samenstelling van immuuncellen en de ruimtelijke organisatie in het endometrium tijdens het implantatievenster.
- Screening: Levert kwantitatieve immunofluorescentie-uitkomsten die vergelijking van immuunceldichtheden en clusteringpatronen over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Analytiek: Levert gemultiplexte fluorescentie-intensiteits- en co-lokalisatiegegevens die bijdragen aan het fenotyperen van immuuncellen en het afleiden van de functionele staat.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van menselijke monsteranalyse naar mechanistische vervolgstudies door gevalideerde immuuncelmarkers te leveren voor downstream functionele assays.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar immunostaining-platform dat toepasbaar is op meerdere immuunprofileringsstudies in het endometrium en andere weefsels.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door een directe, gemultiplexte vergelijking van immuuncelpopulaties in ziekte- versus controleweefsels mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de efficiëntie van reagentia en vermindert variabiliteit door geoptimaliseerde sequentiële kleurings- en strippingprotocollen op enkele coupes.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen bij reproductieve therapieën door de bijdragen van de immuunmicro-omgeving aan het succes of falen van de implantatie te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van immuunceldichtheid, clustering en ruimtelijke correlatie met epitheliale of stromale compartimenten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunohistochemie, fluorescentiemicroscopie en multispectrale beeldanalyse voor nauwkeurige signaaldetectie en kwantificering.
- Afhankelijk van toegang tot microgolfgebaseerde systemen voor antigeenherstel, slide-scanners met fluorescentiecapaciteit en gevalideerde Opal-fluoroforkits voor multiplex-cycli.
- Noodzaak tot standaardisatie van blokkerings-, antilichaamincubatie- en strippingcondities tussen laboratoria om de reproduceerbaarheid van multiplex-resultaten te waarborgen.
- Vereist aanpassing van antilichaampanels en validatiestappen bij het toepassen van de methode op verschillende weefseltypen of immuuncelmarkers buiten CD3, CD56, CD68 en CD20.
- Praktische beperkingen omvatten potentiële fluorofoor-bleed-through en de noodzaak van zorgvuldige spectrale scheiding tijdens de beeldvorming, wat wordt aangepakt via sequentiële stripping en gevalideerde filterinstellingen.
