Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

De hierin beschreven sferoïden van borstkankercellen zullen onderzoekers in staat stellen moleculaire mechanismen van endotheliale celinteracties van kankercellen te onderzoeken die betrokken zijn bij proliferatie en metastase van kankercellen. Het belangrijkste voordeel van dit 3D-model is dat het een meer realistische cellulaire opstelling biedt die de betrouwbaarheid van gevolgtrekkingen met betrekking tot de pathofysiologie en behandeling van borstkanker verbetert. De procedure wordt gedemonstreerd door Giovanna Azzarito, een promovendus uit mijn laboratorium.

Begin met het behandelen of transfecteren van de vergulde cellen gedurende 24 uur, of zoals gewenst. Voor het identificeren van de celverdeling in sferoïde, was de cellen met één milliliter Hanks'Balanced Salt Solution of HBSS, die calcium en magnesium bevat en blijf in HUVECs met behulp van 0,5 microgram per milliliter blauwe kleurstof. En MCF-7-cellen met behulp van 0,5 micromolaire groene kleurstof verdund in het opzicht van groeimedium.

Plaats de plaat gedurende 30 tot 40 minuten in een incubator van 37 graden Celsius en vijf procent CO2. Was de cellen met één milliliter HBSS zonder calcium en magnesium. Voeg vervolgens een milliliter enzymatische detachement re-agent, dat is 0,25% trypsine voor HUVEC en 0,5% trips in vier MCF-7 aan elke bruine schaal met behulp van een P1000 pipet.

Kies elk celtype afzonderlijk in een polystyreenbuis met vijf milliliter rond bodem en voeg één milliliter 10% Foetaal Kalfsserum of FCS-medium toe met behulp van een P1000-pipet om de enzymatische reactie te stoppen. Centrifugeer vervolgens de celsuspensies op 250 keer G gedurende vijf minuten. Aspirateer het supernatant zorgvuldig en suspenseer de cellen in een milliliter steroïdevrij medium.

Gebruik 100 microliter van elke celsuspensie verdund met 10 milliliter verdund verdund verdund stof 2 om het totale celnummer te bepalen. Schakel het apparaat in en spoel door op de functie- en startknoppen te drukken, met Verdunningsmiddel 2-oplossing in een injectieflacon met celteller. Gebruik de set-up als vier en druk op start om de blanco te meten met verse Verdunningsmiddel 2-oplossing.

Vervang de scintillatieflacon met 100 microliter celsuspensie in 10 milliliter verdunningsmiddel 2-oplossing. Gebruik de installatie als vier en druk op start om de monsters te meten. Let op het aantal cellen per milliliter op het digitale display, bereid vervolgens vijf milliliter van elke celsuspensie voor en meng ze om een eindvolume van 10 milliliter in een één-op-één verhouding te krijgen, met behulp van handmatig herhalende pipet om 100 microliter van de celsuspensie in elke put van de 96-well U-bottom plaat te pipetten.

Plaats de plaat in een incubator onder standaard weefselkweekomstandigheden en controleer na 48 uur op een sferoïdenvorming. Maak foto's van deze sferoïden bij 40 X vergroting met behulp van een fasecontrast of fluorescentie stereomicroscoop. Voor het bereiden van de hangende druppelcultuur mengt u de celsuspensies in een één-op-één-verhouding om een eindvolume van twee milliliter te krijgen.

Gebruik een P20-pipet om het celmengsel te zien in de vorm van 15 microliter druppels op het omgekeerde lood van een petrischaaltje van 10 centimeter. Keer het deksel om met de druppels en voeg vijf milliliter EBM-2 basismedium toe aan de onderkant van de schaal om verdamping van de druppels te voorkomen. Verzamel ongeveer 50 sferoïden in een buis van 1,5 milliliter met een darmpunt van een P200 microliter pipet.

Laat ze door de zwaartekracht naar de bodem van de buis zakken en gooi het supernatant dan weg. Bevestig deze sferoïden met 500 microliter van 4% PFA gedurende één uur bij kamertemperatuur. Kook 2% Nobel Algor Solution in PBS met behulp van een hete plaat met een magnetische roer gedurende drie tot vijf minuten om het augureuze poeder volledig op te lossen en afgekoeld tot ongeveer 60 graden Celsius.

Verwijder de PFA met een P1000 pipet, was deze sferoïden met 500 microliter PBS en laat ze bezinken. Gooi het bovennatuurlijke middel na het afwikkelen voorzichtig 600 microliter Agora-oplossing in de buis van 1,5 milliliter met sferoïden en plaats de buis onmiddellijk in een centrifuge met een horizontale rotor op 177 maal G gedurende twee minuten. Voeg een kort touwtje toe in het midden van de Agro Solution om de plug eenvoudig uit de buis te verwijderen.

Versterk de Agros-plug op ijs, of voeg bij vier graden Celsius 500 microliter PBS toe aan de buis van 1,5 milliliter om uitdroging van de pellet te voorkomen. Verkrijg afbeeldingen van sferoïde secties met behulp van een stereomicroscoop. Bereken de hoeveelheid oplossing die nodig is om een 10 microliter per put toe te voegen van een mengsel van calcium Aam en ethidium homodimeren verdund met EBM-2 in een verhouding van één tot 50.

Voeg het kleuringsmengsel toe aan de sferoïden en plaats de plaat in de couveuse onder de standaard, de weefselkweekomstandigheden gedurende 30 tot 60 minuten. Verkrijg foto's met een vergroting van 40 X met behulp van de fluorescentie stereomicroscoop. In U-bodemplaten werd de vorming van sferoïden waargenomen 48 uur na het zaaien van MCF zeven cellen.

De vorming van sferoïden werd echter niet waargenomen in het geval van endotheelcellen of lymfecellen. Het zaaien van de MCF zeven plus endotheelcellen of MCF zeven plus lymfecellen in één-op-één verhouding resulteerde ook in sferoïde vorming. Tijdsafhankelijke sequentiële groei van MCF zeven sferoïde werd geregistreerd, variërend van 24 tot 120 uur.

De grootte van de sferoïden nam in vijf dagen toe van ongeveer 100 micrometer tot ongeveer 200 micrometer. Met een verhoogde groeisnelheid waargenomen in de sferoïden behandeld met de groeistimulator. De structuur van de sferoïden en de vorm van hun cellen vertoonden geen afwijkingen na transfectie met controle oligonucleotiden in aanwezigheid van Lipofectamine.

Cellen die hun proliferatieve marker Ki-67 tot expressie brachten, waren homogeen verdeeld in deze sferoïden. Kleef aan caspase drie kleuringen van deze sferoïden toonden apathische cellen na vier dagen cultuur. Studie van de cellen in deze sferoïden met CD-31 en Ki-67 onthulde dat 55% van de cellen epitheel zijn 45% endotheel en 25% van de cellen prolifereert.

Om het percentage levende en dode cellen te beoordelen, werden vier dagen oude sferoïden gekleurd met calcium Aam en ethidium-homodimeer. Een vers bedachte sferoïde ook vlek voor dode en levende cellen onthulde dat sferoïden erg gevoelig zijn voor vriesomstandigheden. Wanneer u zijn protocol volgt, zorg er dan voor dat gezonde cellen worden gebruikt om aphrodite te mengen Een ander ding om te onthouden is om te voorkomen dat deze aphrodite tijdens DP-dop wordt beschadigd om een goede sectie te verkrijgen die ook zorgt voor het gehemelte van de aphrodite voordat de overkant polymeriseert.

Dit model kan verder worden verbeterd door andere cellen op te nemen, zoals fibroblasten die betrokken zijn bij tumorprogressie en het te gebruiken om de werkzaamheid te beoordelen van therapeutische middelen die gericht zijn op een kankergroei.