Name: Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Leer multiplex in situ hybridisatie toe te passen voor transcriptdetectie van G-eiwit-gekoppelde receptoren in vagale afferente neuronen van muizen. Deze methode genereert nauwkeurige transcriptiekaarten van heterogene celpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Neuroanatomy / Histology / Brain Injection Core gefinancierd door NIH-subsidie #5P01DK119130-02. De auteurs willen graag de hulp erkennen van de UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (onder leiding van Dr. Phelps) en zijn personeel (Abhijit Bugde en Marcel Mettlen), gedeeltelijk ondersteund door de NIH Grant #1S10OD021684-01, een gedeelde bron van het Harold C. Simmons Cancer Center, gedeeltelijk ondersteund door een NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.

OPMERKING: Muizen die in deze studie werden gebruikt, waren wilde mannetjes met een zuivere C57BL / 6J-achtergrond. In totaal werden 4 muizen gebruikt voor multiplex ISH. Alle muizen waren ongeveer 8 weken oud op het moment van offeren. Eén mannelijke muis (ongeveer een jaar oud) werd ook gebruikt om endogene fluorescentie geassocieerd met veroudering aan te tonen. Dieren werden gehuisvest in geventileerde kooien in een barrièrefaciliteit met ad libitum toegang tot voedsel en water. Het UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee heeft de hieronder beschreven procedures beoordeeld en goedgekeurd. Details over reagentia en gereedschappen zijn te vinden in de Tabel met materialen.
1. Monsterverzameling
<ol><li>Dien op de dag van het offer een overdosis chloraalhydraat (500 mg / kg, i.p.) toe aan de muizen. Perfuseer de diep verdoofde muizen transcardiaal met behulp van een peristaltische pomp met 5 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door 50 ml 10% formaline bij kamertemperatuur. OPMERKING: Dit wordt gedaan in een zuurkast om inademing van formaline te voorkomen.</li>
	<li>Omdat de nodose, petrosal en jugulaire ganglia worden samengevoegd tot een enkele ganglionische massa in de muis15,verzamel zorgvuldig de volledige vagale ganglionaire massa van elke kant (links en rechts) met behulp van een ontleedbare scope en fijne veerschaar en tang (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Bij het onthoofden van de muis met een grote schaar (zie de tabel met materialen),vermijd het verpletteren van de hersenstam.</li>
	<li>Na een dissectiebenadering die eerder bij de rat40is beschreven, verwijdert u de sternohyoïde en omohyoïde spieren lateraal naar de luchtpijp met een kleine tang (Tabel met materialen) om het achterhoofdsbeen bloot te leggen. Maak het hele gebied van spieren, vetweefsel en conjunctief weefsel vrij totdat de halsslagader, nervus vagus, de hypoglossale zenuw en foramen magnum zichtbaar zijn. Knip de gehele hypoglossale zenuw af met een kleine veerschaar(Tabel van Materialen).</li>
	<li>Zoek naar het nodose ganglion als een doorschijnende massa dicht bij het foramen magnum15. Breek met behulp van een kleine schaar(Table of Materials)voorzichtig het achterhoofdsbeen om het jugulaire ganglion verder bloot te leggen. Zoek naar zwarte melanocyten aan het oppervlak van de jugular als een visueel oriëntatiepunt.</li>
	<li>Knip zenuwaanhechtingen tussen de vagale ganglionische massa en haal de hele ganglionische massa eruit door voorzichtig aan het perifere uiteinde van de nervus vagus te trekken terwijl tegelijkertijd het jugulaire ganglion naar de hersenstam wordt gesneden met een kleine veerschaar (Table of Materials).</li>
	<li>Verwijder het bindweefsel en vet dat aan de nervus vagus en ganglionaire massa kleeft zoveel mogelijk.</li>
	<li>Omdat het gemakkelijk is om één ganglion te verliezen tijdens de overdracht van de ene buis naar de andere, houdt u ~ 0,5 cm van de nervus vagus om de hantering en lokalisatie van monsters te vergemakkelijken.</li>
	<li>Plaats ganglia met behulp van een fijne tang in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en incubeer bij 4 °C in formaline gedurende 24 uur en met 30% sucrose gedurende nog eens 24 uur.</li>
	<li>Plaats ganglia in een kleine druppel (~ 4 mm Ø) van optimale snijtemperatuur (OCT) medium op een stuk aluminiumfolie. Vries vervolgens het monster in op een bed van droogijs.</li>
	<li>Snijd de monsters met een cryostaat bij -20 °C in secties van 14 μm dikte en verzamel op glazen microscoopglaasjes als 3 serie 42 μm uit elkaar. OPMERKING: Plaats secties niet dicht bij de randen van de dia. Om reagentia te besparen, houdt u de weefselsecties zo dicht mogelijk verpakt, maar zonder overlapping.</li>
	<li>Bewaar de monsters in een vriezer van -80 °C totdat ze nodig zijn voor ISH gedurende ten minste 6 maanden. OPMERKING: Raadpleeg figuur 1 voor het oplossen van problemen met endogene fluorescentie.</li>
</ol>2. Voorbehandeling en ISH
<ol><li>Vóór de dag van de experimenten moet autoclaaf laboratoriumglaswerk worden gebruikt voor ISH, inclusief vlekken op vaat en wasbufferpotten. OPMERKING: Hoewel werken onder RNase-vrije omstandigheden niet van cruciaal belang is, moet u te allen tijde handschoenen dragen. Houd de flessen van de ontsmettingsoplossing van RNase(Materiaaltabel)binnen handbereik in geval van verontreiniging.</li>
	<li>Breng de glijbanen op de eerste dag op kamertemperatuur op een bank die speciaal is gewijd aan ISH. Spoel de glaasjes af in 1x PBS en bak ze 30 minuten op 60 °C in een bakoven(Table of Materials).</li>
	<li>Bevestig de dia's na 4% formaline gedurende 15 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Breng de reagentia in de multiplexkit(Table of Materials)op kamertemperatuur.</li>
	<li>Droog de glaasjes uit in 50%, 70% en 100% ethanol gedurende elk 5 minuten. Breng de oplossing H2O2 gedurende 10 minuten aan op de monsters en spoel vervolgens af in dubbel gedestilleerd water (ddH2O).</li>
	<li>Behandel de monsters gedurende 5 minuten met het doelrecuperatiereagens, spoel ze in ddH2O gevolgd door 100% ethanol en droog ze aan de lucht. Maak met behulp van een hydrofobe pen een barrière rond de monsters. OPMERKING: Breng de hydrofobe barrière niet te dicht bij de weefselsecties aan.</li>
	<li>Breng protease gedurende 30 minuten aan bij 40 °C in een hybridisatieoven(Table of Materials).</li>
	<li>Verwarm ondertussen de sondes voor op 40 °C en koel ze voor gebruik op kamertemperatuur. Incubeer de dia's met de gewenste combinatie van doelsondes (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; of Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) gedurende 2 uur bij 40 °C in een hybridisatieoven.</li>
	<li>Incubeer negatief controleweefsel met de dihydrodipicolinate reductase (DapB) doel C1 sonde gedurende 2 uur bij 40 °C in een hybridisatieoven.</li>
	<li>Spoel de glaasjes af in wasbuffer en bewaar een nacht in 5x zout natriumcitraat (SSC) bij kamertemperatuur. Splits het experiment voor het gemak op in twee dagen. Spoel de volgende dag de dia's af met wasbuffer en incubeer ze met onderstaande versterkingsreagentia (zie de gebruikershandleiding in De tabel met materialen).</li>
	<li>Pas AMP1 (30 min bij 40 °C), AMP2 (30 min bij 40 °C) en AMP 3 (15 min bij 40 °C) toe. Spoel af in wasbuffer tussen elke stap.</li>
	<li>Los elke opaalkleurstof(materiaaltabel)op in dimethylsulfoxide en bewaar de oplossingen bij 4 °C totdat ze nodig zijn.</li>
	<li>Incubeer voor kanaal 1 de dia's met HRP-C1 (15 min bij 40 °C) en Opaal 520 (groene kleur; verdunning 1/1.500; 30 minuten bij 40 °C). Spoel af in wasbuffer tussen elke stap.</li>
	<li>Incubeer voor kanaal 2 de dia's met HRP-C2 (15 min bij 40 °C) en Opaal 570 (gele kleur; verdunning 1/1.500; gedurende 30 minuten bij 40 °C). Spoel af in wasbuffer tussen elke stap.</li>
	<li>Incubeer voor kanaal 3 de dia's met HRP-C3 (15 min bij 40 °C) en Opal 690 (verre rode kleur; verdunning 1/1.500; gedurende 30 min bij 40 °C). Spoel af in wasbuffer tussen elke stap.</li>
	<li>Was de dia's en stel ze gedurende 30 s bloot aan 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI).</li>
	<li>Breng onmiddellijk montagemedium aan op elke dia en plaats een afdekplaat over het weefselgedeelte.</li>
	<li>Houd de weefsels horizontaal in een diahouder bij 4 °C totdat ze worden afgebeeld.</li>
</ol>3. Microscopie en data-analyse
OPMERKING: Multiplex ISH-gegevens kunnen worden afgebeeld met een breed scala aan instrumenten met de juiste filters. Een voorkeursmethode voor beeldvorming is echter confocale microscopie met 20x en 63x (olie) doelstellingen; verwijs naar de discussie voor de redenen. Zie figuur 2 voor de bepaling van de optimale signaal-ruisverhouding.
<ol><li>Gebruik een confocale microscoop uitgerust met 488, 561 en 633 nm laserlijnen. Gebruik de volgende acquisitieparameters (zie tabel 1):Opaal 690 (HeNe 633 nm, detectiebereik 668-696 nm, vermogen 2.0, versterking 724); Opaal 570 (DPSS-laser 561 nm, detectiebereik 579-627 nm, <vermogen 15.0, <gain 450); Opaal 520 (argonlaser 488 nm, detectiebereik 499-535 nm, <vermogen 6.0, <gain 830); DAPI (diodelaser 405, detectiebereik 415-502 nm, <vermogen 12.0, <gain 532).</li>
	<li>Om de kwaliteit van de afbeeldingen te verbeteren, verwerft u met een lijngemiddelde van 4 en een pixelgrootte van ten minste 1024 x 1024. OPMERKING: De bovenstaande parameters worden alleen als voorbeeld gegeven en wijzigingen worden aanbevolen afhankelijk van één instrument, vergroting (20x of 63x), expressieniveaus en endogene fluorescentieniveaus voor een bepaald weefsel.</li>
	<li>Zodra u tevreden bent met de acquisitieparameters, verzamelt u afbeeldingen met dezelfde instellingen. Wijs valse kleuren toe aan elk kanaal om visualisatie te vergemakkelijken. OPMERKING: Bijvoorbeeld rood (Phox2b of Prdm12), cyaan (Cck1r), geel (Ghsr) en grijs (DAPI).</li>
	<li>Voer celtelling uit met behulp van de digitale afbeeldingen door de omtrek van RNAscope-positieve profielen te identificeren met één kern die licht gekleurd is met DAPI. Bereken het percentage RNAscope-positieve profielen dat elk transcript uitdrukt [Figuur 3A-C].</li>
	<li>Om de nauwkeurigheid en nauwkeurigheid van de schattingen te verbeteren, telt u ten minste 2.000 neuronale profielen van ten minste 4 verschillende dieren. Voer het tellen van linker- en rechter ganglia afzonderlijk uit.</li>
	<li>Voer de gegevens in een cirkeldiagram in met het totale aantal getelde profielen.</li>
	<li>Gebruik beeldbewerkingssoftware om afbeeldingen te verkrijgen en 20x afbeeldingen samen te voegen. Gebruik ImageJ-Fiji en een andere foto- en ontwerpsoftware om de uiteindelijke platen te genereren. Pas aanpassingen voor contrast en lichtheid gelijkmatig toe op alle afbeeldingen.</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

De techniek van ISH werd uitgevonden in de late jaren 196042. Het is echter pas in het midden van de jaren 1980 dat het werd toegepast voor de detectie van mRNA's in het centrale en perifere zenuwstelsel43,44. Gezien de heterogeniteit van het zenuwstelsel en terugkerende problemen met antilichamen, blijft het lokaliseren van een bepaald transcript op cellulair niveau een waardevol hulpmiddel. Niettemin zijn traditionele ISH-methoden bewerk...

De cellichamen van vagale afferente stoffen bevinden zich in de jugulaire, petrosale en nodose ganglia1,2,3. Hun axonen reizen samen via verschillende takken van de nervus vagus naar craniocervicale, thoracale en abdominale territoria4,5,6,7. Vanuit hun viscerale uiteinden kunnen vagale afferente stoffen reageren op een breed scala aan fysiologische en schadelijke stimuli8,9,10. De verdeling van signaalmoleculen en receptoren die betrokken zijn bij vagale detectie blijft echter slecht gekarakteriseerd. Dit komt deels omdat de vagale ganglia, ondanks hun kleine omvang, een breed spectrum van receptoren uitdrukken, waaronder een groot aantal GPCR's8,11,12,13. Bovendien zijn vagale afferente neuronen inherent heterogeen en vertonen ze verschillende moleculaire profielen14. Om de zaak te compliceren, worden de jugulaire, petrosale en nodose ganglia in de muis bevestigd, waardoor een enkele ganglionische massa wordt gevormd. Ten slotte is in een subset van dieren het nodose ganglion bevestigd aan het sympathische superieure cervicale ganglion15.
In het verleden hebben onderzoekers zich tot immunohistochemie gewend om de neurochemische samenstelling van vagale afferente neuronen te bestuderen16,17,18. Hoewel immunohistochemie met behulp van gevalideerde antilichamen nuttig is, moeten de resultaten van immunohistochemische studies met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Talrijke pogingen om specifieke antilichamen tegen GPCR's te identificeren, zijn bijvoorbeeld mislukt19,20,21,22,23,24,25, waardoor onderzoekers concluderen dat de meerderheid van de antilichamen tegen GPCR's onbetrouwbaar zijn. Om deze problemen te omzeilen, is kwantitatieve PCR (qPCR) op grote schaal gebruikt voor het beoordelen van genexpressie in de vagale ganglionaire massa van knaagdieren26,27,28,29. Het onderzoeken van genexpressie met behulp van qPCR gaat echter ten koste van een verlies van ruimtelijke informatie. In het bijzonder kan niet worden voorspeld hoeveel cellen of welk celtype (s) een bepaald gen van belang uitdrukken (bijv. Nodose vs. jugulaire cellen). Terugkerende problemen omvatten ook de besmetting met aangrenzende weefsels en de opname van variabele lengtes van de nervus vagus, superieure cervicale en jugulaire ganglia tijdens dissectie15. Als gevolg van de bovenstaande moeilijkheden is er controverse rond de expressie en distributie van verschillende GPCR's in vagale afferente neuronen. Een bijzonder raadselachtig voorbeeld heeft betrekking op de ghrelinereceptor (Ghsr). Terwijl sommige studies wijdverspreide expressie van deze receptor hebben gevonden in vagale afferente neuronen30,31,32,hebben anderen vastgesteld dat Ghsr-mRNA bijna niet detecteerbaar is in het nodose ganglion11,14. Gedetailleerde mapping van Ghsr-mRNA in de vagale ganglionaire massa is daarom gerechtvaardigd.
In situ hybridisatie (ISH) is ook gebruikt om genexpressiepatronen in de vagale ganglionaire massa7,11,12,33,34,35te beoordelen. Omdat op RNA gebaseerde technieken onder de meeste omstandigheden betrouwbaarder en specifieker blijven dan op antilichamen gebaseerde technieken36,37, zijn ISH-studies waardevol gebleken voor een beter begrip van de neurochemische codering van vagale afferente neuronen. Toch zijn traditionele ISH-technieken zelf niet zonder kanttekeningen. Radioactieve ISH is gevoelig maar genereert achtergrond en blijft omslachtig38. Niet-radioactieve ISH is minder ingewikkeld maar ook minder gevoelig38. De recent ontwikkelde RNAscope ISH-methode is daarentegen zeer gevoelig en genereert minimale achtergrond39. De huidige studie paste multiplex fluorescerende RNAscope toe op de detectie van GPCR's in vagale afferente neuronen van de muis. We concentreerden ons op het in kaart brengen van de distributie van Ghsr en vergeleken de distributie met die van de cholecystokininereceptor (Cck1r), een andere GPCR waarvan bekend is dat deze tot expressie komt in het nodose ganglion34. Ten slotte werden de twee transcriptiefactoren, gepaard-achtige homeobox 2b (Phox2b) en PR-domein zinkvingereiwit 12 (Prdm12), gebruikt als selectieve markers voor nodose en jugulaire afferente neuronen, respectievelijk14. Zonder Phox2b of Prdm12 te visualiseren, zou het een uitdaging zijn om jugulaire versus nodose afferente stoffen met zekerheid te identificeren. Mogelijke technische valkuilen worden ook in het hele artikel besproken.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>-80&deg;C vriezer</td><td>PHCBI</td><td>MDF-DU901VHA-PA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 2021</td><td>Adobe</td><td></td><td>foto- en ontwerpsoftware</td></tr><tr><td>Bakoven</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model:658</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM880 Airyscan</td><td></td></tr><tr><td>Dekglaasje</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>2460-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecomount</td><td>Biocare Medical</td><td>EM 897L</td><td>montagemedium</td></tr><tr><td>HybEZ oven</td><td></td><td></td><td>hybridisatieoven</td></tr><tr><td>Hydrofobe pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grote schaar</td><td>Henry Schein</td><td>100-7561</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>Minipomp variabele flow</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Opal 520</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1487001KT</td><td>Fluorescente biomarker</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1488001KT</td><td>Fluorescente biomarker</td></tr><tr><td>Opal 690</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1497001KT</td><td>Fluorescente biomarker</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td></td><td></td><td>montagemedium voor fluorescerend gelabelde cellen</td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>323100</td><td>multiplexkit</td></tr><tr><td>RNAscope sonde Muis Cck1r-C3</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>313751-C3</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope sonde Muis DapB</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>310043</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope sonde Muis Ghsr</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>426141</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope sonde Muis Phox2b-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>407861-C2</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope sonde Muis Prdm12-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>524371-C2</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Rnase ontsmettingsoplossing</td></tr><tr><td>Kleine dissectiescharen</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z265977</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus glazen schuifjes</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek OCT medium</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Gebruikershandleiding</td><td>ACD</td><td>323100 USM</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS 5620</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Imaging Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van g-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van multiplex in situ hybridisatie

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Deze studie beschrijft een protocol voor de multiplex in situ hybridisatie (ISH) van de muis jugulair-nodose ganglia, met een bijzondere nadruk op het detecteren van de expressie van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's). Formaline-gefixeerde jugulaire-nodose ganglia werden verwerkt met de RNAscope-technologie om tegelijkertijd de expressie van twee representatieve GPCR's (cholecystokinine en ghrelinereceptoren) te detecteren in combinatie met één markergen van nodose (gepaarde homeobox 2b, Phox2b) of jugulaire afferente neuronen (PR-domein zinkvingereiwit 12, Prdm12). Gelabelde ganglia werden afgebeeld met behulp van confocale microscopie om de distributie- en expressiepatronen van de bovengenoemde transcripten te bepalen. Kortom, Phox2b afferente neuronen bleken overvloedig de cholecystokininereceptor (Cck1r) tot expressie te brengen, maar niet de ghrelinereceptor (Ghsr). Een kleine subset van Prdm12 afferente neuronen bleek ook Ghsr en/of Cck1r tot expressie te brengen. Mogelijke technische kanttekeningen bij het ontwerp, de verwerking en de interpretatie van multiplex ISH worden besproken. De aanpak die in dit artikel wordt beschreven, kan wetenschappers helpen bij het genereren van nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen.

Hoewel RNAScope kan worden toegepast op dieren van elke leeftijd, geslacht of genetische achtergrond, is het raadzaam om met jonge volwassenen (<3 maanden oud) te werken. Dit komt omdat fluorescerende artefacten (bijv. Lipofuscine) veel voorkomende bevindingen zijn in neuronen van oudere dieren41. De formaline-gefixeerde ganglia van oudere muizen bevatten vaak verrassend intense endogene fluorescentie die gemakkelijk kan worden aangezien voor echte kleuring(Figuur 1A,...

Multiplex in situ hybridisatie (ISH) werd gebruikt om tegelijkertijd de transcripten voor twee G-eiwit-gekoppelde receptoren en één transcriptiefactor in het gehele vagale ganglionaire complex van de volwassen muis te visualiseren. Dit protocol kan worden gebruikt om nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen te genereren.

Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Deze procedure is zeer gevoelig en maakt een visualisatie van verschillende transcripties met minimale achtergrond mogelijk. Deze methode kan nauwkeurige kaarten genereren van het transcriptionele profiel van zeer heterogene celtypen. De procedure wordt gedemonstreerd door mij en Johnson Bob-manuel, een onderzoekstechnicus in het laboratorium.Begin met het verzamelen van de volledige vagale ganglionische massa van de acht weken oude muis van elke kant, met behulp van een ontleedbare scope en chirurgische instrumenten. Gebruik na onthoofding van de muis een kleine tang om het sternohyoïde en de omohyoïde spieren lateraal naar de luchtpijp te verwijderen om het achterhoofdsbeen bloot te leggen. Maak het hele gebied van spieren en weefsels vrij totdat de halsslagader, de vagus en hypoglossale zenuw en foramen magnum zichtbaar zijn.Knip vervolgens de hele hypoglossale zenuw af met een kleine veerschaar. Zoek naar het nodose ganglion als een doorschijnende massa dicht bij het foramen magnum. Breek met een kleine schaar voorzichtig het achterhoofdsbeen.Om het jugulaire ganglion verder bloot te leggen, lokaliseer je zwarte melanocyten aan het oppervlak van de jugular als visueel oriëntatiepunt. Wanneer de ganglionen worden gevonden, snijdt u de zenuwaanhechtingen tussen de vagale ganglionische massa en trekt u zachtjes aan het perifere uiteinde van de nervus vagus terwijl u tegelijkertijd het jugulaire ganglion naar de hersenstam snijdt met een kleine veerschaar voor de extractie van de hele ganglionische massa. Verwijder het bindweefsel, de ganglionaire massa en het vet dat aan de nervus vagus kleeft.Het houden van ongeveer een halve centimeter van de nervus vagus om het hanteren en lokaliseren van monsters te vergemakkelijken. Plaats de remove op ganglia met behulp van een fijne tang in microcentrifugebuizen van 1,5 millimeter. En incubeer bij vier graden celsius in formaline gedurende 24 uur.En dan met 30% sucrose gedurende 24 uur. Plaats na incubatie de ganglia in een druppel van een diameter van vier millimeter van een optimaal snijtemperatuurmedium op een stuk aluminiumfolie. En formuleer het monster op een bed van droogijs.Snijd de bevroren monsters met een cryostaat in secties van 14 micrometer dikte bij min 20 graden Celsius en verzamel de gesneden secties op de glazen microscoopglaasjes als drie series 42 micrometer uit elkaar. Spoel de dia's af met weefselsecties in PBS. En bak 30 minuten op 60 graden Celsius in een bakoven.Plak vervolgens de dia's in 4% formaline gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Droog de glaasjes serieel uit in 50%70% en 100% ethanol gedurende elk vijf minuten. En breng waterstofperoxide-oplossing gedurende 10 minuten aan op de monsters voordat u in dubbel gedestilleerd water spoelt.Voor In situ hybridisatie, of ISH, behandel de monsters met het doel-ophaalreagens gedurende vijf minuten. Spoel de monsters vervolgens achtereenvolgens in dubbel gedestilleerd water en 100% ethanol, gevolgd door luchtdroging. Maak met behulp van een hydrofobe pen een barrière rond de monsters.Terwijl de monsters gedurende 30 minuten worden behandeld met protease bij 40 graden Celsius en een hybridisatieoven, verwarmt u de sondes voor op 40 graden Celsius en koelt u ze voor gebruik af op kamertemperatuur. Na het verplaatsen uit de oven, incubeer de dia's met de gewenste combinatie van doelsondes gedurende twee uur bij 40 graden Celsius in een hybridisatieoven. Incubeer negatief controleweefsel met het dihydrodipicolinate-reductase of DapB, doel C1-sonde gedurende twee uur bij 40 graden Celsius.Spoel de glaasjes in wasbuffer en bewaar een nacht in vijf keer natriumcitraat bij kamertemperatuur. Spoel de volgende dag de glaasjes af met wasbuffer voordat u ze incubeert met versterkingsreagentia. En behandel met kanaalspecifieke reagentia zoals beschreven in het manuscript.Was de dia's gevolgd door een behandeling met DapB gedurende 30 seconden. Breng vervolgens onmiddellijk het bevestigingsmedium op elke dia aan en plaats een afdekslip over het weefselgedeelte. Houd de weefsels horizontaal in een diahouder op vier graden Celsius totdat ze worden afgebeeld.Bereid een confocale microscoop voor op beeldvorming door de vereiste parameters in te stellen. Verkrijg de afbeeldingen met een lijngemiddelde van vier en een pixelgrootte van ten minste 1024 bij 1024 om de kwaliteit van de afbeeldingen te verbeteren. Zodra u tevreden bent met de acquisitieparameters, begint u met het verwerven van de afbeeldingen met dezelfde instellingen.Wijs valse kleuren toe aan elk kanaal om visualisatie te vergemakkelijken. Gebruik de digitale afbeeldingen om cellen te tellen door de omtrek van RNA-scopepositieve profielen te identificeren met één kern die licht gekleurd is met DapB. Bereken het percentage RNA-scopepositieve profielen dat elk transcript tot expressie brengt.De optimale acquisitieparameters werden voor elke laser gekozen op basis van de niet-specifieke fluorescentie verkregen in het negatieve controleweefsel. De endogene fluorescentie in het nodose ganglion van een jongvolwassen muis is minimaal. En incubatie met een DapB-sonde, het resulteerde niet in signalen.Bij verhoogd vermogen laser en versterking met de 488 nanometer laser, ongewenste achtergrond en willekeurige fluorescerende stippen verschijnen. De RNA scope-techniek werd toegepast om drie genen te detecteren in weefselsecties van de vagale ganglionaire massa. Het weefselprofiel was positief voor GHSR en CCK1R.Het profiel omvatte zowel Phox2b- als CCK1R-transcripties in het rostrale deel van het nodose ganglion. Als gevolg van de multiplex ISH in nodose afferente neuronen, phox2b signalen specifiek opgehoopt in afferente neuronen, gelegen in de nodose ganglion. CCK1R-signalen hebben veel neuronen in het nodose ganglion intens gelabeld.Bij lage vergroting konden cellen die lage CCK1R- of GSHR-signalen tot expressie brachten niet gemakkelijk worden waargenomen. DapB hielp het weefsel te visualiseren en vagale afferente neuronen met een grote en licht bevlekte kern te identificeren. Bij hoge vergroting zijn Phox2b positieve profielen duidelijk.Profiel twee en drie zijn Phox2b-cellen met hoge en matige CCK1R-signalen. Profiel vier drukte zowel GHSR als CCK1R uit. Als gevolg van de multiplex ISH van de jugulaire afferente neuronen, kon het PRDM12-transcript specifiek worden gezien in afferente neuronen in het jugulaire ganglion.Bij hoge vergroting werden matige signalen voor CCK1R gedetecteerd in profiel één en twee. Profiel drie is een vertegenwoordiger van PRDM12-cellen die negatief zijn voor CCK1R of GHSR. Consistentie van dissectie is een belangrijke factor.Het is even belangrijk om te controleren of de parameters voor beeldvormingsacquisitie geen ongewenste achtergrondsignalen genereren. Multiplex In situ hybridisatie is uitgegroeid tot de gouden standaard in moleculaire gevestigde, vooral op het gebied van neuroanatomie. Deze methode kan gemakkelijk worden gecombineerd met immunohistochemie.

detection-g-protein-coupled-receptor-expression-mouse-vagal-afferent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Bij muizen, is de mogelijkheid om feromonen te detecteren hoofdzakelijk gemedieerd door de vomeronasale orgaan (VNO). Hier is een acute weefsel stuk voorbereiding van VNO voor het uitvoeren van calcium beeldvorming beschreven. Deze fysiologische aanpak maakt het mogelijk waarnemingen van subpopulaties en / of individuele neuronen in een levend weefsel en is handig voor het receptor-ligand identificatie.

Imaging Feromoon Sensing in een muis Vomeronasal Acute Tissue Slice Voorbereiding

De vomeronasale orgaan (VNO) detecteert intraspecies chemische signalen dat de sociale en reproductieve informatie over te brengen. Wij hebben Ca2 + imaging experimenten met transgene muizen die G-CaMP2 in VNO weefsel. Deze aanpak stelt ons in staat om de ingewikkelde reactie patronen van de vomeronasale neuronen te analyseren om een ​​groot aantal feromonen stimuli.

Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Source: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the detection of mRNA within cholinergic axons in fixed mouse hippocampal slices using fluorescent in situ hybridization and antibody staining. Fluorescence microscopy reveals the spatial localization of probe-tagged mRNAs and choline acetyltransferase in cholinergic neurons.

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Hier beschrijven we een fysiologische aanpak die identificatie en diepgaande analyse van een gedefinieerde populatie van sensorische neuronen in acute coronale weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis mogelijk maakt, met behulp van opnames met gehele cel patch-clamp.

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

Dit protocol beschrijft confocale microscopie detectie van G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) internalisatie in zoogdiercellen. Het omvat de basis-celkweek, transfectie, en confocale microscopie procedure en zorgt voor een efficiënte en gemakkelijk te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en de internalisering van-fusion uitgedrukt GPCR detecteren.

Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie

Dit protocol beschrijft de kritische stappen en voorzorgsmaatregelen moeten uitvoeren van eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp. Deze techniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het analyseren van het profiel van de expressie van een vooraf vastgesteld samenstel van genen van een enkele cel gekenmerkt door patch-clamp recordings.

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Leer multiplex in situ hybridisatie toe te passen voor transcriptdetectie van G-eiwit-gekoppelde receptoren in vagale afferente neuronen van muizen. Deze methode genereert nauwkeurige transcriptiekaarten van heterogene celpopulaties.

Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie (Video) | JoVE Journal

Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie

Meer video's verkennen