Staartaderdoorsnede bloeden model bij volledig verdoofde hemofilie A muizen

Staartbloedingsmodellen kunnen belangrijke hulpmiddelen zijn om farmacologische effecten van hemostatische verbindingen in vivo te beoordelen om de reproduceerbaarheid tussen experimenten te garanderen. In vergelijking met andere gevoelige bloedingsmodellen gebruikt ons model bloedverlies en bloedingstijd als eindpunten in plaats van overleving. Ook wordt het model uitgevoerd onder anesthesie, waardoor pijn en angst voor de dieren worden verminderd.

Deze techniek is vooral nuttig voor de preklinische studie van hemofilie en andere stollingsstoornissen, omdat het het vermogen van het bloed meet om te stollen en een bloeding na een verwonding te stoppen. We hebben dit model uitgebreid gebruikt en procoagulante verbindingen getest in ons werk om nieuwe hemofilietherapieën te ontwikkelen met behulp van hemofilie A-muizen. Andere hemofiele muizenstammen, of muizen waarbij hemofilie wordt geïnduceerd met een antifactor VIII-antilichaam, kunnen echter ook worden gebruikt.

Het experiment wordt gedemonstreerd door Sarah en Dennis, die deskundige technici zijn in mijn lab. Na het verdoven van de muis, plaats je hem op een verwarmingsplaat en zorg je ervoor dat de neus in de neuskegel zit. Breng een geschikte oogzalf aan om uitdroging tijdens de narcose te voorkomen.

Markeer de staart met een diameter van 2,5 millimeter met behulp van het staartmarkeringsblok, zorg ervoor dat de staart niet in de spleet wordt gedwongen en zorg ervoor dat deze goed past. Plaats vervolgens de staart gedurende ten minste vijf minuten in de zoutoplossingsbuis om te zorgen voor een warme staartader die optimaal is voor intraveneuze dosering. Indien nodig kan iv-dosering na vijf minuten worden uitgevoerd.

Plaats vervolgens een plastic deksel over de muis om warmteverlies te verminderen. Laat de staarten vijf minuten onderdompelen na het doseren van de testoplossing en voer vervolgens de staartaderdoorsnede uit door de staart in het snijblok te plaatsen en deze 90 graden te draaien om de ader bloot te leggen. Maak de snede aan de andere kant van waar de testoplossing is gedoseerd.

Trek het scalpelblad van nummer 11 door de spleet van het snijblok en houd de staart vast om bloedingen te veroorzaken. Breng vervolgens onmiddellijk de staart terug naar de zoutoplossing en reset de stopwatch. Bloedingen moeten onmiddellijk zichtbaar zijn.

Het onderdompelen van de staart in zoutoplossing is belangrijk voor consistente bloedingen, omdat het snel zou stoppen in vrije lucht. Observeer de bloeding en annoteer het begin en de stop van de bloeding gedurende 40 minuten op het bloedstroomnotatiepapier. Diskwalificeer en vervang de muis als de primaire bloeding niet binnen drie minuten na het maken van de snee stopt, wat erop kan wijzen dat de snee te diep is of dat de muis een tekort heeft aan primaire hemostase.

Daag de staartsnede uit als er geen bloeding is, 10, 20 en 30 minuten na het letsel. Gebruik een gaasje geweekt en warm zoutoplossing, til de staart uit de zoutoplossing en veeg deze zacht maar stevig twee keer af met het natte gaas in distale richting over de staartsnede. Dompel de staart na elke uitdaging onmiddellijk opnieuw in de zoutbuis.

Wanneer het experiment is voltooid, verwijdert u de staart van de zoutoplossing, verzamelt u indien gewenst bloedmonsters en euthanaseert u de muizen terwijl u nog onder volledige anesthesie bent. Centrifugeer de bloedafnamebuizen van 15 milliliter met zoutoplossing op 4.000 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant uit de buizen.

Resuspendeer de pellet in twee milliliter erytrocytenlyserende oplossing. Verdun het vervolgens met maximaal 12 extra milliliter lysing-oplossing totdat het een lichte koffiekleur bereikt. Noteer het totale volume en breng twee milliliter van de verdunning over naar een hemoglobinebuis.

Koel het tot de hemoglobineanalyse. Een significante vermindering van bloedverlies voor recombinante stollingsfactor VIII-behandelingsgroepen werd waargenomen met behulp van het geoptimaliseerde protocol. Een dosis van 20 internationale eenheden per kilogram normaliseerde de bloeding volledig en 10 IE per kilogram veroorzaakte een significant effect, waardoor het bloedverlies bijna tot de bovengrens van het wild-type bereik werd verminderd.

Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor de bloedingstijd. Een vermindering werd waargenomen in groepen van 5, 10 en 20 IE per kilogram, volledig genormaliseerd in de groep van 20 IE per kilogram. Bij wild-type muizen varieerde het totale bloedverlies van 200 tot 840 nanomol hemoglobine en in voertuigmuizen van 5.300 tot 7.100 nanomol hemoglobine.

De gemiddelde bloeding was 5.200 nanomol bij met voertuigen behandelde muizen en 720 nanomol in de groep van 20 IE per kilogram. De bloedingstijd van wild-type muizen varieerde van één tot negen minuten en dosisniveaus van 10 en 20 IE per kilogram verminderden de bloedingstijd tot binnen dit bereik. Een sterke correlatie tussen bloedverlies en bloedingstijd werd waargenomen in de gecombineerde gegevens.

Alle opgenomen bloedingsepisoden werden uitgezet om een visualisatie te geven van de lengte en het aantal bloedingen dat voor elke individuele muis werd ervaren. Merk op dat in de voertuiggroep, na de tweede uitdaging, de meeste dieren blijven bloeden tot het einde van het experiment. Meting van de plasmafactor VIII-concentratie bevestigde dat het waargenomen effect bij het verminderen van bloedverlies en bloedingstijd recombinant factor VIII-concentratieafhankelijk was.

Het aantal bloedplaatjes werd niet merkbaar beïnvloed en de hematocrietspiegels lagen binnen het normale bereik bij dieren die matige en hogere recombinante factor VIII-doses kregen, maar significant lager bij dieren die uitgebreid bloedden, zoals in het medium en één IE per kilogram groepen. Bij dieren die zware bloedingen ervaren, kan een geringe impact op het bloedbeeld, met name totaal hemoglobine of hematocriet, optreden. Om het effect van geslacht in dit geoptimaliseerde model te evalueren, werden zowel bloedverlies als bloedingstijdresultaten onderworpen aan tweerichtings ANOVA-analyse, met geslacht en dosis als factoren.

Deze resultaten gaven aan dat de respons op de behandeling niet verschilde tussen geslachten. Het correct markeren van de staart en het maken van de snede zijn essentiële stappen om betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid in de techniek te garanderen, net als de uitdaging als er geen bloeding is. Verder is een goede anesthesie-inductie en onderhoud van de lichaamstemperatuur van het dier bijzonder relevant.

We hebben dit model ook gebruikt om het stoppen van gevestigde bloedingen in een meer on-demand-achtige omgeving te onderzoeken door 10 minuten na het induceren van bloedingen te behandelen met factor VIIA.