Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Fluorescentie cross-correlation spectroscopie is een statistische methode die tijdsresultaatfluorescentie gebruikt om de dynamische signatuur van G-eiwit-gekoppelde receptoren in levende cellen te lokaliseren. Hier zijn we vooral geïnteresseerd in bèta-2 adrenerge receptoren. Sfingolipide receptoren geven voornamelijk informatie over translationele diffusiedynamiek en met behulp van fluorescentie anisotropie ook rotatiediffusie.

Door een extra label te introduceren, kunnen we ook bindende of zelfs conformatische veranderingen bevorderen als de resonantie-energieoverdracht tussen de labels zoals onderzocht wordt bevorderd. Kwantitatieve tijd opgeloste fluorescentie vereist een zorgvuldige afstemming van de opstelling en kalibratiemetingen. In de volgende minuten zullen we een experimentele gids bieden voor levenscelfluorescentiescorrelatiespectroscopie, kruiscorrelatiespectroscopie en Forster-resonantie-energieoverdracht van G-eiwitgekoppelde receptoren, met behulp van kloon-in-nevels en synthetische stroomkracht.

Celzitting en transfixing moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Plaats een schone dekslip barbell op een zes put cultuurplaat en spoel deze af met steriele fosfaatbuffer zoutoplossing voeg twee ml celkweekmedium met fenolrood aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 microgram, per amine penicilline en 100 microgram per ml streptomycine toe aan elke put en houd het opzij. Neem de CHO-cellen die in hetzelfde medium zijn gekweekt met fenolrood bij 37 graden Celsius in vijf procent CO2 en was ze met vijf ml PBS om de dode cellen te verwijderen.

Voeg twee ml trypsine toe en incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Verdun de gegevenscellen met acht ml medium met fenolrood en meng voorzichtig door pipetteren. Tel de cellen in een Neubauer-kamer en plaats de cellen met een dichtheid van 150.000 cellen per put in de zes putkweekplaat met de afdekslip.

Laat de cellen 24 uur in een incubator groeien om ongeveer 80% confluentie te bereiken. Verdun twee microgram van het gewenste vector-DNA. Bijvoorbeeld CT SNAP of NT SNAP, en zes microliter van dat transfectiereagens in twee afzonderlijke buisjes.

Elk met 500 microliter gereduceerd serummedium voor elke put en incubeer ze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Meng de twee oplossingen samen om het transfectiemengsel te verkrijgen en incubeer het nog 20 minuten bij kamertemperatuur. Was ondertussen de zittende CHO-cellen eenmaal met steriel PBS.

Vervang de PBS door één ml per put fenolroodvrij medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum en geen antibiotica. Voeg het hele bouwmengsel van één ml druppelsgewijs toe aan elke put en incubeer de cellen een nacht bij 37 graden in vijf procent CO2. Verdun voor etikettering het juiste SNAP-substraat in één ml medium aangevuld met 10% foetaal runderserum om een eindconcentratie van één micromolair te verkrijgen.

Was de getransfecteerde cellen eenmaal met PBS en voeg één ml per putje van één micromolaire SNAP-substraatoplossing toe. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 37 graden in vijf procent CO2. Was de cellen driemaal met fenolroodvrij medium en voeg twee ml toe per goed fenolroodvrij medium.

Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in vijf procent CO2. Breng de afdekstrook van alle monsters vervolgens over in de beeldvormingskamer en was met 500 Microliter imaging Buffer. Voeg een beeldbuffer van 500 microliter toe voordat u naar de FRED FCS-opstelling gaat.

De FRED FCS-opstelling is uitgerust met een confocale microscopie waterdoel, twee laserlijnen, een tijdquilter enkel buitenlands telsysteem, twee hybride BMT's en twee aandelen voor fotonenverzameling en de software voor gegevensverzameling. Het is zeer cruciaal om de opstelling elke keer uit te lijnen voordat de meting in levende cellen wordt uitgevoerd. Voor het aanpassen van focus, pinhole en kleurpositie, plaatst u twee nanomolaire groene kalibratieoplossingen op een glazen afdekplaat en schakelt u de 485 nanometer en 560 nanometer laser in die in stapels worden bediend, interleaved excitatie of PI-modus.

Focus op de oplossing en pas de pinhole en kraagringpositie zodanig aan dat de hoogste telsnelheid en het kleinste confocale volume worden verkregen om de maximale moleculaire helderheid te krijgen. Herhaal dit proces voor de rode kanalen met 10 nanomolaire rode kalibratieoplossing en een mengsel van beide. Plaats 10 nanomolaire DNA-oplossing op de glazen afdekplaat en pas de focus van het gaatje en de positie van de kraagring zodanig aan dat de kruiskleuren tussen de groene en rode detectiekanalen het hoogst zijn.

Dat is de hoogste amplitude. Zoek voor metingen in levende cellen een geschikte cel door te beperken met de markeringslamp en te observeren door het oculair. Schakel beide lasers in PI-modus in en focus op het membraan door te zoeken naar de maximale tellingen per seconde.

Houd er rekening mee dat het laservermogen mogelijk moet worden verminderd voor de celmonsters. Bij voorkeur minder dan vijf microwatt bij objectief. Dit is sterk afhankelijk van de gebruikte bloemen en de opstelling.

Observeer de auto- en cross coll-curves van de bèta-2 AR gebonden aan EGP en snap tag probes in de online preview van de dataverzamelingssoftware en verzamel verschillende sorteermetingen met een acquisitietijd tussen 60 en 180 seconden. Exporteer de correlatiecursus en het contrast van alle metingen. Zorg er hier voor dat u de prompt- en vertragingstijdvensters correct definieert en een microtijdoptie gebruikt in de software voor gegevenscorrelatie.

In totaal zijn er drie verschillende correlaties nodig. Automatische correlatie van het prompttijdvenster van het groene kanaal. Automatische correlatie van de rode kanalen en het vertragingstijdvenster.

En ten slotte was de kruiscorrelatie van het groene kanaalsignaal en het prompttijdvenster het rode kanaalsignaal in het vertragingstijdvenster. Hier zijn de automatische correlatiefuncties van de groene en rode FRED voor oplossingen en passen ze aan op een 3 DT-diffusiemodel met een extra tripletterm die nodig is om de vorm en grootte van het confocale detectievolume voor de twee kleurkanalen te kalibreren, waarbij B de basislijn van de curve en het aantal moleculen en focus is, TD de diffusietijd en S, de nul over omega nul de vormfactor van het confocale volume-element. Het triplet knipperen en fotofysica wordt beschreven als amplitude AR en relaxatietijd TR. Gebruik de bekende diffusiecoëfficiënt voor de groene en rode kalibratie-uitsteekpunten en verkrijg vormfactoren om de afmetingen en het volume van het infectieuze confocale volume-element te bepalen.

Bereken het spectrum over zoals IFR, het groene fluorescerende signaal verzameld op kanalen nullen, en twee in het juiste detectiekanaal, kanaal één en drie, als een verhouding van de achtergrond verzamelde signalen. Bepaal de directe verwachting van de acceptorstroom van gegevens door de donorexcitatiegolflengten door de verhouding van het achtergrond verzamelde contrast van de rode kalibratiemetingen en de prompte tijdvensterexcitatie door groene laser tot de achtergrond correcte rekening direct in het vertragingstijdvenster excitatie door rode laser. Bereken de moleculaire helderheid van B zowel de groene als de rode stromingskracht op basis van het verzamelde contrast op de achtergrond, en om het aantal moleculen te verkrijgen en te focussen op de 3 DT diffusie fit.

Fit zowel ultra correlaties van het groene en rode kanaal, evenals over correlatie van de groene prompt en rode vertraging van het dubbel niveau DNA naar het 3 DT diffusiemodel houdt de verkrijgen gevormde factoren constant voor de auto correlatie functies. De vormfactor voor de kruiscorrelatiefuncties bevindt zich meestal tussen die twee waarden. Bepaal de amplitude bij nul correlatietijd op basis van de lettertypewaarden van het schijnbare aantal moleculen en focus.

De amplitudeverhouding voor een monster berekenen was een codiffusie van 100% van de groene en rode vloerkracht. Plaats de celmonsters in een geschikt model. Hoe ze worden getoond membraanreceptordiffusie niet nieuwsgierig op een bi-modale manier was een korte, geen lange diffusietijd.

Daarnaast moet rekening worden gehouden met de fotofysica en het uitknipperen van de vloerkracht. Hier naar TD1 en TD2, zijn de twee die nodig zijn om de diffusietijden te verspreiden. En een één is een fractie van de eerste diffusietijd In tegenstelling tot de kalibratiemeting waarbij de vrije dobbelstenen en DNA-strengen diffusie, alle richtingen, membraanreceptoren vertonen alleen 2D-diffusie langs de celmembranen berekenen de concentratie van groene of rode labeleiwitten uit het respect van het aantal moleculen en focus.

En het volume van het confocale volume-element, met behulp van biasing mass. Pas de twee alto-correlaties van het dubbel gelabelde monster aan met hetzelfde model als voor de single level construct en de cross correlation functie met behulp van een bi-modaal diffusiemodel, Opmerking voor een globale beschrijving van het systeem. Alle drie de gewassen moeten samen geschikt zijn.

De diffusieterm is voor alle drie de gewassen identiek. En het enige verschil is dat er een reputatietijd valt, de kruiscorrelatiefunctie. Bereken de concentratie van groene of rode arbeidseiwitten uit het respectievelijke aantal moleculen en focus en het volume van het confocale volume-element.

Schat de fractie of concentratie van interagerende groene en rode labeleiwitten uit de celmonsters met behulp van de correctiefactoren verkregen uit de DNA-monsters, de amplitudeverhoudingen van het celmonster en de respectieve verkregen concentraties. Pas de twee alter correlaties van het FRED-monster aan als een enkele gelabelde monsters en de frontale kruiscorrelatie met een bi-modaal diffusiemodel met een anticorrelatieterm, waarbij AF de amplitude van de totale anticorrelatie en AR en TR de respectieve amplitude en ontspanningstijd weergeeft. In het geval van anti-gecorreleerde fluorescentieveranderingen als gevolg van FRED kunnen een of meer anticorrelatietermen nodig zijn, wat resulteerde in een dip van de Fred-kruiscorrelatiefunctie op lage correlatietijden die samenviel met een toename van de twee autocorrelatiefuncties.

De kalibratiemetingen van de groene en rode bloemenoplossingen voor scheerfactoren van 6,5 en de groene kanalen en 6,8 in de rode kanalen. Zo heeft het confocale volume later op deze meetdag de grootte van 1,4 en 1,9 femto, de molecuulhelderheid ligt op 12,5 kilohertz per molecuul en 2,6 kilohertz per molecuul. We hebben 15% van de overspraak van de groene bloem voor in de rode kanalen na donorexcitatie en 38% van de directe behalve excitatie van de rode bloemvorm door de groene, uit onze DNA-meting bepalen we de correctiefactoren voor het confocale overlapvolume tot 0,6 en 0,7 ook, de cellen getransfecteerd met single label construct vertonen bi-modale tweedimensionale diffusie op het celmembraan waar ongeveer de helft van de moleculen langzaam diffundeert op de tijdschaal van 50 tot honderd milliseconden en de andere helft relatief snel rond de twee milliseconden in beide constructies.

Daarnaast is triplet knipperen aanwezig. In de rode niveau snap construct wordt echter een andere ontspanningstijd verkregen op 180 microseconden, die zou kunnen voortvloeien uit Unbound snap straight. Van het dubbele label zelf, doorsneden met het anti-klikconstruct waar de twee labels aan twee verschillende zijden van het celmembraan, twee minder metingen de ruis en de rode laag op correlatie hebben verzameld.

En de PI-kruiscorrelatie is hier vrij hoog. Hier 70% van de moleculen, als je langzaam onder de honderd milliseconde tijdschaal komt, en slechts 30% snel rond een milliseconde, is de fractie van dubbel bevrijde moleculen laag en ligt tussen de 15 en 25% De gegevens voor de CT-snap zien er beter uit en het is minder luidruchtig. De verwachte front diepste anticorrelatie kan echter niet worden gezien en is hoogstwaarschijnlijk massa door de hoge hoeveelheid overspraak, directe acceptatie-excitatie en triplet knipperen van beide bloemenkracht, en zodra data-analyseschema's die profiteren van de verzamelde fluorescentie-intensiteit DKS kan helpen om dit te redden zoals getoond voor de gesimuleerde dataset.

Het voordeel van Fred FCS-techniek is dat we samen met mobiliteit de conferentiedynamiek van GPCRs kunnen onderzoeken. Het uitvoeren van FRED FCs in laboratoria is echter een uitdaging en vraagt om goede getransfecteerde cellen, efficiënte etikettering en een perfecte gekalibreerde opstelling. Alleen een FRED-paar pro force is ook erg cruciaal.

Kritische experimentele stappen omvatten de optimalisatie van transfectie-optimalisatie, het minimaliseren van achtergrond en de autofluorescentie. Bovendien zal de analysepijplijn van Atoms helpen om de verschillende dynamieken van preceptors in levende cellen te begrijpen. We hopen dat dit protocol nuttig zal zijn om de FRED FCS-aanpak uit te voeren in experimenten met levende cellen.