Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen
March 1st, 2022
Regulatoren van melanocytenfuncties regelen zichtbare verschillen in de pigmentatie-uitkomst. Het ontcijferen van de moleculaire functie van het kandidaat-pigmentatiegen vormt een uitdaging. Hierin demonstreren we het gebruik van een zebravismodelsysteem om kandidaten te identificeren en in te delen in regulatoren van melaninegehalte en melanocytenaantal.
Dit protocol is een samensmelting van verschillende technieken die de onderzoekers in staat zouden stellen om de rol van kandidaat-gen in de melanocytenbiologie af te bakenen. Het is een holistische benadering om tot een logische gevolgtrekking te komen. Door verschillende methoden te combineren, kunnen verstorende factoren worden vermeden en kan het onderzoekers helpen een substantieel resultaat te behalen.
Om de analyse te beginnen, immobiliseert u de 48 HPF-embryo's met 0,016% tricaïne. Monteer de embryo's met behulp van enkele milliliters 1,5 tot 2% methylcellulose in een petrischaaltje. Pluk de embryo's met een Pasteur-pipet en plaats ze in methylcellulose om beweging tijdens de beeldvorming te beperken.
Voor optimale laterale of dorsale beeldvorming past u hun positie aan met een vergroting van meer dan 5x. Leg de petrischaal onder de microscoop. Stel met behulp van een manipulator de vis zo in dat alle vijf de embryonale strepen van melanocyten tegelijkertijd zichtbaar zijn.
Leg met behulp van de acquisitiesoftware de beelden vast. Als de vis ontwaakt, plaats hem dan in tricaïnewater totdat hij stabiliseert. Open met behulp van de open tool in ImageJ-software de afbeelding die moet worden gekwantificeerd.
Selecteer het vormgereedschap uit de vrije hand om het gebied voor analyse te schetsen. Selecteer de optie metingen instellen, klik op de gemiddelde grijswaarde en vervolgens op het gebied. Om de gemiddelde grijswaarde voor het geselecteerde gebied te berekenen, klikt u op M of gaat u naar analyseren en selecteert u meten.
Breng op basis van het stadium van interesse de embryo's over naar een petrischaal met 0,6 milligram per milliliter Pronase. Breng met behulp van een Pasteur-pipet de gedechorioneerde embryo's na vijf tot 10 minuten over in een petrischaal met gewoon embryowater. Verzamel met een glazen Pasteurpipet ongeveer 100 embryo's en breng ze over naar een microcentrifugebuis van twee milliliter.
Gooi het medium weg en voeg 200 microliter ijskoude deyolking Ringers-oplossing toe. Plaats de buis op ijs en meng de inhoud ongeveer 20 keer met een pipet om het juk op te lossen. Centrifugeer de buisjes twee keer op 100 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.
Breng de ontdooierde embryo's over met behulp van een pipet van één milliliter in een petrischaaltje met 10 milliliter trypsine-oplossing. Meng de oplossing een of twee keer met behulp van een pipet van één milliliter om de aggregatie te verminderen. Passeer de trypsinized suspensie door een 70 micrometer zeef geplaatst op een 50 milliliter conische buis om een enkele cel suspensie te verzamelen.
Was de petrischaaltjes met de trypsinized suspensie om de aangehechte cellen van het oppervlak te verwijderen. Voor het tellen van de fluorescerend gelabelde cellen met behulp van een flowcytometer, tekent u na het maken van een nieuwe experimentmap een voorwaartse versus zijverstrooiingsplot. Maak een histogram voor de intensiteit van fluoresceïne-isothiocyanaat.
Laad eerst de wildtypecellen om de voorwaartse en zijwaartse spreidingspoorten en de FITC-drempel in te stellen. Laad daarna de cellen geïsoleerd uit transgene FTYRP GFP-lijnembryo's om de melanocyten te tellen. Monteer de embryo's in 1,5 tot 2% methylcellulose in een petrischaaltje.
Plaats het onder de microscoop en stel het in de gewenste richting in met behulp van een pipetpunt. Met behulp van de acquisitiesoftware kunt u de afbeeldingen verkrijgen. Voor embryo's van minder dan 24 HPF, met behulp van 10X vergroting, leg het hele beeld vast, terwijl voor embryo's van meer dan 24 HPF, meerdere scanvelden worden verkregen en vervolgens worden samengesteld.
Na het uitvoeren van de test onthulde de Brightfield-beeldvorming na 48 uur de aanwezigheid van alle vijf gepigmenteerde melanofoorstrepen. In het 48 HPF-stadium werd het aantal laterale melanoforen berekend en bleek dat de histonvariant h2afv-morfanten een verminderd aantal melanoforen vertoonden in vergelijking met de controlegroep. De gemiddelde grijswaarde werd gemeten voor CA14- en h2afv-morfanten, waaruit bleek dat de waarden hoger waren voor de varianten dan de controlemorfanten.
Door gebruik te maken van een op natriumhydroxide gebaseerde spectrofotometrische absorptiemethode werd het melaninegehalte gekwantificeerd waarbij de CA14-morfanten minder inhoud vertoonden dan de controlemorfanten. Fluorescentiebeeldvorming werd uitgevoerd om morfolino-gebaseerde verandering voor verschillende stadia van de ontwikkeling van zebravismelanofoor te evalueren. Het aantal melanoforen in CA14- en h2afv-morfanten werd geanalyseerd met behulp van FACS.
Er werd waargenomen dat het aantal melanoforen in CA14 onveranderd bleef, terwijl ze significant verminderd waren in h2afv in vergelijking met de controlemorfant. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit per gebied werd ook berekend, wat aantoont dat de h2afv-morfanten een aanzienlijke afname van de waarde ten opzichte van controlemorfanten vertonen. Terwijl je de vis aanpast voordat je de foto maakt, moet je ervoor zorgen dat je alle vijf melanofoorstrepen kunt visualiseren.
Je moet de vis een beetje kantelen om onderscheid te maken tussen de twee zijstrepen. Nadat we de rol van een kandidaat-gen in de ontwikkeling van melanocyten hebben vastgesteld, kunnen we het gen op een weefselspecifieke manier elimineren met behulp van CRISPR-technologie. Dat zal een meer gerichte aanpak zijn.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van kandidaat-pigmentatiegenen in de biologie van melanocyten met behulp van een zebravismodelsysteem. Door verschillende beeldvormingstechnieken en assays te gebruiken, identificeert het onderzoek belangrijke regulatoren van melaninegehalte en melanocytenaantal.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Ontwikkeling van melanocyten
- Genetica van pigmentatie
- Zebravis als modelorganisme
Achtergrond
- Het begrijpen van de moleculaire functie van pigmentatiegenen is essentieel voor het ontcijferen van variaties in huidskleur.
- Verstorende factoren in onderzoek kunnen een nauwkeurige beoordeling van genfuncties belemmeren.
- Zebravis-embryo's bieden een effectief model voor het bestuderen van vroege ontwikkelingsprocessen in pigmentatie.
Gebruikte methoden
- Immobilisatie van embryo's en beeldvormingstechnieken
- Zebravis als het biologische model
- Flowcytometrie voor het tellen van melanocyten en spectrofotometrische assays voor melaninegehalte
Belangrijkste resultaten
- Er werden minder melanoforen waargenomen in h2afv morphants in vergelijking met controles.
- CA14 morphants vertoonden minder melaninegehalte dan controlemorphants.
- Fluorescentiebeeldvorming bevestigde ontwikkelingsverschillen in melanoforen.
Conclusies
- De bevindingen illustreren het belang van specifieke pigmentatiegenen in de ontwikkeling van melanocyten.
- Dit onderzoek heeft bredere implicaties voor het begrijpen van genetische invloeden op pigmentatie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic interrogation of genetic regulators in melanocyte development, supporting target validation in pigment-related disorders. By combining phenotypic imaging, flow cytometry, and biochemical assays, it provides quantitative readouts for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach enhances predictive confidence in distinguishing genes affecting melanocyte number versus melanin content per cell, informing portfolio prioritization for topical or systemic modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional dissection of candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators based on effects on cell number versus pigment synthesis.
- Operational Value: Uses morpholino knockdown in zebrafish larvae to rapidly assess phenotypic consequences on pigmentation pathways.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing by linking gene perturbation to measurable changes in melanophore count and melanin content.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs including mean gray value from brightfield imaging and melanin concentration via spectrophotometry.
- Operational Value: Integrates FACS-based melanocyte counting with imaging to enable high-content phenotypic screening of genetic modulators.
- Scientific Value: Facilitates assay reproducibility through defined staging (48 HPF), immobilization, and imaging parameters for longitudinal comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses transgenic GFP reporters (mitfa, tyrp1) to track melanocyte specification and differentiation stages relevant to human pigmentation biology.
- Operational Value: Enables segregation of hits into mechanistic classes (specifiers vs. differentiators) to guide downstream validation in mammalian models.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating genes implicated in piebaldism, albinism, or vitiligo pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are validated for effects on melanocyte biology before compound screening or mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports target validation by isolating gene-specific effects on melanocyte development through morpholino phenocopy and quantitative imaging.
- Screening: Enables assay-ready zebrafish models with fluorescent reporters for scalable evaluation of genetic or small-molecule modulators.
- Analytics: Delivers multiparametric readouts—melanophore number (FACS), melanin content (spectrophotometry), and spatial distribution (imaging)—to support data-driven hit triage.
- Translational Research: Uses conserved melanocyte markers (mitfa, tyrp1) to bridge zebrafish findings to human pigmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pigment genetics screening applicable across target families and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing genes that alter melanocyte specification from those affecting pigment production per cell.
- Operational Value: Standardizes embryo handling, imaging, and dissociation protocols to ensure reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic confidence in target mechanism before investing in medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic validation of melanocyte-specific phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology, microinjection, and morpholino design is required for accurate phenotypic assessment.
- Instrumentation includes fluorescence microscopes, flow cytometers, and spectrophotometers for multiparametric readout.
- Standardization across teams requires synchronized staging (HPF), immobilization protocols, and imaging settings to minimize variability.
- Adaptation to other models may require validation of conserved promoter-driven reporters and phenotypic endpoints.
- Limitations include morpholino off-target effects and transient knockdown, necessitating follow-up with CRISPR or mutant lines for target confirmation.
