Name: Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Ontdek hoe je met een omgekeerde genetische benadering regulatoren van pigmentatie identificeert in zebravissen. Deze methode combineert beeldvorming, flow cytometrie en spectrofotometrie om melanocytontwikkeling en melaninegehalte te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen de financiële steun van de Council for Scientific and Industrial Research vide project MLP2008 en het Department of Science and Technology voor het project GAP165 voor het ondersteunen van het werk dat in dit manuscript wordt gepresenteerd. We bedanken Jeyashri Rengaraju en Chetan Mishra voor hun hulp bij experimenten.

Zebravisexperimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele goedkeuring van dierethiek (IAEC) van het CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), India (voorstel nr. 45a). Alles werd in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken.
1. Morpholino injecteren in zebravisembryo's
<ol><li>Teken met behulp van een standaard naaldtrekker zeer scherpe en gesloten pipetten.</li>
	<li>Laad de oplossing met morfolino in de micropipetten met behulp van een microloaderpunt en steek deze in het micro-injectorapparaat. Draai de schroef goed vast om de micropipet te vergrendelen. OPMERKING: Doseringsstandaardisatie van morfolinos is noodzakelijk. De juiste dosering heeft een overlevingskans van >70% en een specifiek fenotype bij 24 hpf.</li>
	<li>Snijd de punt van de micropipette met een fijne tang en kalibreer deze11.</li>
	<li>Om te kalibreren, injecteert u 1 volume morfolino-oplossing in de capillaire buis van de micropipette, waarbij de injecteertijd op 1 s wordt gehouden. Herhaal dit vijf keer. Gebruik de standaard, 1 mm = 30 nL volume, zoek het volume geïnjecteerd in 5 s door de capillaire buis tegen een meetschaal te houden. Bereken met behulp van de bovenstaande informatie de tijd (in seconden) die nodig is om 1-3 nL per injectie te injecteren12. OPMERKING: De standaard, 1 mm = 30 nL, is specifiek voor de micro-injectordrukinstellingen en de diameter van het capillair dat wordt gebruikt voor kalibratie. Idealiter moet de injectie worden gemaakt in de dooier-cel interface, die binnen 15-20 minuten na de bevruchting wordt gevormd. Om meerdere injecties mogelijk te maken, kan de ontwikkeling enigszins worden vertraagd door embryo's op een lagere temperatuur (18 °C) te houden. Dit moet echter tot een minimum worden beperkt en niet langer dan 30 minuten worden verlengd vanwege het samengestelde effect van lagere temperatuur op genexpressieveranderingen.</li>
	<li>Monteer de embryo's op een in agarose gegoten petrischaaltje (60 mm). Stapel de embryo's stevig in de richels. Gebruik vuurgepolijste glazen pipetten om ze in de juiste richting uit te lijnen voor injectie.</li>
	<li>Gebruik onder een microscoop manipulatoren om de micropipette dichter bij het embryo te brengen en injecteer in de dooiercelinterface door op de voetschakelaar te drukken.</li>
	<li>Injecteer alle embryo's op dezelfde manier; verzamel ze in een petrischaaltje met vers embryowater en incubeer bij 28 °C.</li>
	<li>Controleer de geïnjecteerde embryo's na 6-8 uur. Verwijder alle dode embryo's die identificeerbaar zijn vanwege hun hoge ondoorzichtigheid en blijf het embryowater minstens één keer per dag verversen om infectie te voorkomen.</li>
</ol>2. Pigmentatie analyse
<ol><li>Voorbereiding voor het tellen van laterale middellijn melanoforen in 3 dpf zebravisembryo's<ol><li>Behandel embryo's met 0,016% neuro-musculair anestheticum om ze te immobiliseren.</li>
		<li>Om de embryo's te monteren voor beeldvorming, voegt u een paar milliliter 1,5-2% methylcellulose toe in de petrischaal (60 mm) zodat deze een dunne laag vormt. Pluk met behulp van een Pasteur-pipet embryo's en plaats ze voorzichtig in methylcellulose om verdere beweging tijdens de beeldvorming te beperken.</li>
		<li>Pas hun positie aan voor optimale laterale (dorsale streep, ventrale streep, dooierstreep en melanoforen in de middenlijn) of dorsale (melanoforen op het dorsale deel van het hoofd) beeldvorming. Voor een betere resolutie van aangrenzende melanoforen, beeld bij hogere vergroting (>5x)</li>
	</ol></li>
	<li>Brightfield-beeldvorming OPMERKING: Brightfield-beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop met 8-10x vergroting.<ol><li>Leg de petrischaal met de zebravisembryo's onder de microscoop. Stel met behulp van een manipulator de vis in een dergelijke oriëntatie in, zodat alle vijf melanocyt-embryonale strepen tegelijkertijd zichtbaar zijn (dorsaal, ventraal, twee lateraal, dooier) (figuur 1C). Leg snel foto's vast met behulp van de acquisitiesoftware. In het geval dat het dier weer in beweging komt voordat het in beeld wordt gebracht, dompel het dan opnieuw onder in verdoving en ga verder met beeldvorming zodra het voldoende is geïmmobiliseerd.</li>
		<li>Herhaal dit met alle vissen en zorg ervoor dat de vergroting voor elk beeld hetzelfde blijft.</li>
	</ol></li>
	<li>Gemiddelde grijswaarde berekenen met ImageJ-software<ol><li>Maak dorsale en laterale beelden van 2 dpf zebravisembryo's.</li>
		<li>Open de afbeelding die u wilt kwantificeren in ImageJ met het gereedschap Openen . Gebruik het vormgereedschap uit de vrije hand om het gebied voor analyse te schetsen. Ga naar de optie Metingen instellen en selecteer Gemiddelde grijswaarde | gebied. Druk op M (of Analyseren | Meten) om de gemiddelde grijswaarde voor het geselecteerde gebied te berekenen.</li>
		<li>Houd het te analyseren gebied constant en bereken het gemiddelde grijze gebied voor elk dier afzonderlijk.</li>
		<li>Plot een staafdiagram met de verkregen gegevens (figuur 2F).</li>
	</ol></li>
	<li>Melaninegehalte assay<ol><li>Gebruik bij 2 dpf een glazen Pasteur-pipet om ~ 25 zebravisembryo's te verzamelen.</li>
		<li>Voer handmatige dechorionatie uit met behulp van insulinenaalden van 1 ml en voeg ze toe aan microcentrifugebuizen van 1,5 ml.</li>
		<li>Gooi het embryomedium voorzichtig weg en voeg 1 ml ijskoude lysisbuffer (20 mM natriumfosfaat (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) toe met proteaseremmercocktail en bereid eiwitlysaten door ultrasoonapparaat.</li>
		<li>Los de lysaten op in 1 ml 1 N NaOH en incubeer de monsters bij 100 °C gedurende 50 minuten in een waterbad. Vortex het met tussenpozen om de lysaten volledig te homogeniseren.</li>
		<li>Neem absorptiemetingen van de monsters bij 490 nm met behulp van een spectrofotometer.</li>
		<li>Bereken het melaninegehalte door de absorptie van het monster te vergelijken met een standaardcurve van bekende concentraties synthetische melanine (figuur 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Melanofore telling
OPMERKING: Fluorescentieanalyse in transgene zebravisembryo's kan op twee manieren worden uitgevoerd: 1) GFP-positieve cellen tellen; 2) het meten van de fluorescentie-intensiteit.
<ol><li>Voorbereiding voor FACS-gebaseerde telling van GFP-positieve cellen in vroege zebravisembryo's<ol><li>Verzamel 200-250 ftyrp: GFP-embryo's en was ze in een zeef met gewoon embryowater. Als een negatieve controle, verwerken GFP-negatieve, stadium-matched wild-type (Assam Wildtype) embryo's12.</li>
		<li>Breng op basis van het stadium van interesse de embryo's over naar een petrischaal met 0,6 mg / ml pronase. Breng na 5-10 minuten, met behulp van een Pasteur-pipet, de gedechorioneerde embryo's over naar een verse petrischaal met gewoon embryowater. Verzamel met behulp van een glazen Pasteur-pipet ~ 100 embryo's en breng ze over naar een microcentrifugebuis van 2 ml.</li>
		<li>Gooi het medium voorzichtig weg en voeg 200 μL ijskoude Ringer's oplossing (deyolking buffer) toe. Houd de buis op ijs en pipetteer de inhoud ~ 20 keer op en neer totdat de dooier is opgelost. Centrifugeer de buizen gedurende 1 minuut op 100 × g in een tafelcentrifuge bij 4 °C. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant voorzichtig weg.</li>
		<li>Breng met behulp van een pipet van 1 ml de ontdooierde embryo's over naar een petrischaal met 10 ml trypsine-oplossing (celdissociatiebuffer). Voer het uit in meerdere petrischalen om overbevolking van de embryo's en inefficiënte trypsinisatie te voorkomen. Gebruik een pipet van 1 ml, meng de oplossing met de embryolichamen een of twee keer om de aggregatie te verminderen.</li>
		<li>Incubeer de petrischaaltjes bij kamertemperatuur gedurende 15 min (<24 hpf embryo's) of 30 min (24-30 hpf embryo's). Zuig en doseer de suspensie af en toe met behulp van een pipet van 1 ml om de desintegratie van cellen te bevorderen.</li>
		<li>Initialiseer tijdens de incubatieperiode de flowcytometermachine voor celtelling.</li>
		<li>Plaats een 70 μm celzeef boven een conische buis van 50 ml en laat de trypsinized suspensie door de zeef gaan om een eencellige suspensie te verkrijgen. Was de petrischaaltjes een paar keer met dezelfde suspensie om cellen te verwijderen die aan het oppervlak zijn gehecht.</li>
		<li>Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 450 × g en 4 °C in een draaibare bakrotor.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 1 ml ijskoude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
		<li>Draai opnieuw bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Tot slot, resuspensie de pellet in PBS + 5% foetaal runderserum en houd het op ijs totdat de FACS loopt.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van de flowcytometer<ol><li>Schakel de flowcytometer in en start de opstart. OPMERKING: Voordat u de machine inschakelt, leegt u de afvalbak en vult u de vloeistoftank van de mantel.</li>
		<li>Normaliseer de stroom van de stroom voor een mondstuk van 70 μm (of 85 μm). Laat het 10-15 minuten ongestoord als het onstabiel is.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescerend gelabelde cellen tellen met behulp van een flowcytometer<ol><li>Initialiseer een nieuwe experimentmap en maak een spreidingsplot van voorwaartse verstrooiing versus zijverstrooiing en een histogram van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) intensiteit.</li>
		<li>Laad eerst de wild-type cellen om de voorwaartse en zijwaartse spreidingspoorten (om doubletten en vuil uit te sluiten) en de FITC-drempel in te stellen.</li>
		<li>Nadat de poorten zijn ingesteld, verwijdert u het monster en laadt u de cellen geïsoleerd uit Tg (ftyrp1: GFP) embryo's om melanocyten te tellen. OPMERKING: Hier, aangezien ftyrp1:GFP specifiek rijpe melanocyten labelt, komt het aantal GFP-positieve cellen onder de FITC-poort overeen met het aantal melanocyten.</li>
		<li>Herhaal de bovenstaande stap met morfolino-geïnjecteerde monsters om het aantal melanocyten met de controle te schatten en te vergelijken.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescentie-intensiteit meten in zebravisembryo's<ol><li>Verzamel met behulp van een glazen Pasteur-pipet 100-120 embryo's en breng ze over naar een petrischaal met gewoon embryowater.</li>
		<li>Bij ~10-12 hpf, breng de embryo's over naar 0,003% 1-fenyl-2-thioureum om pigmentatie te remmen.</li>
		<li>Voer handmatige dechorionatie uit met behulp van insulinenaalden voor beeldvorming <48 hpf-embryo's.</li>
		<li>Om embryo's te immobiliseren, behandel ze met 0,016% tricaïne.</li>
		<li>Om embryo's te monteren voor beeldvorming, plaatst u een paar ml 1,5-2% methylcellulose in de petrischaal (60 mm) zodat deze een dunne laag vormt. Voeg de embryo's toe aan methylcellulose om verdere bewegingen tijdens de beeldvorming te beperken. Leg de petrischaal met de monsters onder de microscoop. Stel het dier met behulp van een pipetpunt in de gewenste richting in.</li>
		<li>Verkrijg afbeeldingen met behulp van de acquisitiesoftware. Voor embryo's <24 hpf, vang het hele embryo in één keer onder 10x vergroting. Voor >24 hpf-trappen meerdere scanvelden verwerven en vervolgens samenvoegen (naaien).</li>
		<li>Herhaal dit met alle vissen en zorg ervoor dat de instelling voor acquisitie constant blijft gedurende het experiment.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificering<ol><li>Analyseer de afbeelding verder met behulp van ImageJ-software.</li>
		<li>Open de afbeelding die u wilt kwantificeren in ImageJ met het gereedschap Openen .</li>
		<li>Gebruik het vormgereedschap uit de vrije hand om het gebied voor analyse te schetsen (figuur 3E).</li>
		<li>Druk op M (of Analyseren | Meten) om een geselecteerde gebiedsintensiteitsmeting te verkrijgen.</li>
		<li>Houd het te analyseren gebied constant en bereken de gemiddelde intensiteit per gebied voor elk dier afzonderlijk.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+evolution+of+pigment+patterns+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics and evolution of pigment patterns in fish.</a> Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).</li>
<li>Jablonski, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+human+skin+and+skin+color%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Anthropology%22%5BJournal%5D)">The evolution of human skin and skin color.</a> Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).</li>
<li>Hoekstra, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+development+and+evolution+of+adaptive+pigmentation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates.</a> Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).</li>
<li>Quigley, I. K., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+pattern+formation+in+zebrafish%3A+a+model+for+developmental+genetics+and+the+evolution+of+form%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form.</a> Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).</li>
<li>Meyers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+development+of+a+vertebrate+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: development of a vertebrate model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+melanophore+development+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).</li>
<li>Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development%3A+insights+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Neural crest development: insights from the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).</li>
<li>Carney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+role+for+Sox10+in+specification+of+neural+crest-derived+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons.</a> Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).</li>
<li>Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxd3+controls+melanophore+specification+in+the+zebrafish+neural+crest+by+regulation+of+Mitf%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf.</a> Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).</li>
<li>Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fugu+tyrp1+promoter+directs+specific+GFP+expression+in+zebrafish%3A+tools+to+study+the+RPE+and+the+neural+crest-derived+melanophores%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores.</a> Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).</li>
<li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).</li>
<li>Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon+for+efficient+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery.</a> Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).</li>
<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+generating+mouse%2Fzebrafish+models+of+human+skeletal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).</li>
<li>Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+eumelanin+and+pheomelanin+markers+in+diverse+biological+samples+by+HPLC-UV-MS+following+solid-phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction.</a> PLoS One. 14 (10), 0223552(2019).</li>
<li>Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+quantification+of+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent quantification of melanin.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).</li>
<li>Hultman, K. A., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+direct-developing+and+stem+cell-derived+melanocytes+to+the+zebrafish+larval+pigment+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern.</a> Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).</li>
<li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142 (4), 620-632 (2015).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Pigmentatiefenotype manifesteert zich vaak als veranderingen in het gehalte aan melanine of het aantal pigmentdragende melanocyten. De hierin beschreven methode maakt de ontleding van deze dichotomie mogelijk en maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve beoordeling van het melaninegehalte en het aantal melanoforen per embryo mogelijk, ongeacht het melaninegehalte. De hoge vruchtbaarheid van zebravissen, de zichtbare aard van gepigmenteerde melanocyten en het gebrek aan melanosoomoverdracht maken de dissectie van melanoc...

Hoewel het gebruik van melanine voor fotoprotectie verschillende keren in het dierenrijk is geëvolueerd, hebben gewervelde dieren het proces schijnbaar geperfectioneerd. Speciale pigmentproducerende cellen met een uitgebreide machinerie om melanine te synthetiseren en te bevatten, worden bewaard van vis tot mens1. Het resultaat van pigmentatie is echter dramatisch gevarieerd, variërend in de kleur tot recipience en presenteert zich als levendige patronen op integumenten, de huid en het haar2. Ondanks de diversiteit is het repertoire van genen die betrokken zijn bij pigmentatierespons opvallend bewaard gebleven. De kerncomponenten van de melanine-synthetiserende machinerie, zoals de belangrijkste melanine-synthetiserende enzymen, de componenten van de melanosomen en de stroomopwaartse connectiviteit met de signaalroute, blijven in wezen identiek tussen organismen. Subtiele genetische verschillen veroorzaken dramatische veranderingen in de patronen van pigmentatie die worden waargenomen bij soort3. Vandaar dat een omgekeerde genetische benadering in een lager gewerveld organisme, de zebravis (Danio rerio), een uitstekende gelegenheid biedt om de betrokkenheid van genen bij het weergeven van de gepigmenteerde toestand te ontcijferen4.
Zebravisembryo's ontwikkelen zich van een eencellige bevruchte zygote tot een larve binnen een tijdspanne van ~24 uur na de bevruchting (hpf)5. Opvallend is dat de melanocyt-equivalente cellen - de melanoforen - grote cellen zijn die aanwezig zijn in de dermis en opvallen door het donkere melaninegehalte6. Deze van neurale top afgeleide cellen stralen ~11 hpf uit en beginnen ~24 hpf 6,7 te pigmenteren. Geconserveerde genexpressiemodules hebben de identificatie mogelijk gemaakt van sleutelfactoren die melanocytenfuncties orkestreren en hebben geleid tot de ontwikkeling van transgene fluorescerende reporterlijnen Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) en Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10 die selectieve stadia van melanocytenontwikkeling labelen. Het gebruik van deze transgene vislijnen maakt de ondervraging van celbiologie van melanocyten op organismaalniveau in de weefselcontext mogelijk met geschikte aanwijzingen volgens de ontwikkelingstijdlijnen. Deze reporters vullen pigmentgebaseerde kwantificering van melanocyten aan en maken een duidelijke beoordeling van melanocytenaantallen mogelijk, ongeacht het melaninegehalte.
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het ontcijferen van de biologie van melanocyten door twee kritische parameters te beoordelen, namelijk melaninegehalte en melanocytenaantallen. Terwijl de eerste een veel voorkomende functionele uitlezing is die voortkomt uit een hypopigmentatierespons, wordt de laatste geassocieerd met een vermindering van de specificatie of overleving van melanocyten en wordt vaak geassocieerd met genetische of verworven depigmentatieomstandigheden. De algemene strategie van deze omgekeerde genetische screening is om geselecteerde genen het zwijgen op te leggen met behulp van een morfolino en de melanocyt-specifieke uitkomsten te onderzoeken. Het melaninegehalte wordt geanalyseerd met behulp van beeldgebaseerde kwantificering van gemiddelde grijswaarden, gevolgd door bevestiging met behulp van een melaninegehaltetest. Het aantal melanocyten in verschillende stadia van rijping wordt geanalyseerd met behulp van beeldgebaseerde kwantificering en verder bevestigd met behulp van FACS-analyse. Hier wordt het screeningsprotocol gedemonstreerd met behulp van twee kandidaatgenen, namelijk koolzuuranhydrase 14, betrokken bij melanogenese, en een histonvariant H2AFZ.2 die betrokken is bij de specificatie van melanocyten uit de neurale topvoorloperpopulatie. Terwijl de eerste het melaninegehalte verandert en niet het melanocytenaantal, verandert het laatste het aantal gespecificeerde melanocyten en bijgevolg het melaninegehalte in het embryo. Al met al biedt deze methode een gedetailleerd protocol om de rol van een kandidaat-gen in pigmentatie te identificeren en zijn rol te onderscheiden bij het beheersen van melanocytenaantallen versus melaninegehalte.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microtubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td>Voor het bereiden van MO-oplossing</td></tr><tr><td>2 mL Microtubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>Voor wasstappen in FACS-protocol</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9539-500G</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td>Voor celsorteer</td></tr><tr><td>Capillaire buis</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Corning celzeef</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td>Voor het maken van een enkele celsuspensie</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td>FACS-protocol</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Om ZF te immobiliseren voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Voor koude lysis buffer</td></tr><tr><td>FACS buizen</td><td>BD-Biosciences</td><td>342065</td><td>FACS-protocol</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270</td><td>FACS-protocol</td></tr><tr><td>Graphpad prism Software</td><td>Graphstats Technologies</td><td>NA</td><td>Voor gegevensweergave</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institute of health</td><td>NA</td><td>Voor beeldanalyse</td></tr><tr><td>Insuline spuiten (1 mL)</td><td>DispoVan</td><td>NA</td><td>Voor handmatige dechorionatie</td></tr><tr><td>Melanine, Synthetisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8631</td><td>Voor melaninegehalte-assay</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027-250G</td><td>Om ZF te immobiliseren voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Gene-tools</td><td>NA</td><td>Voor knock-down experimenten</td></tr><tr><td>N-fenylthioureum (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Om melaninevorming te remmen</td></tr><tr><td>Naaldtrekker</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Conische Sterile Polypropyleen Centrifugeerbuizen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>FACS-protocol</td></tr><tr><td>Petrischaal (60 mm)</td><td>Tarsons</td><td>460090</td><td>Voor embryoplaten</td></tr><tr><td>Fenylmethylsulfonylfluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>Voor koude lysis buffer</td></tr><tr><td>Fosfaat bufferoplossing (PBS)</td><td>HiMedia</td><td>TL1099-500mL</td><td>Voor het wassen van cellen</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53702</td><td>Voor dechorionatie</td></tr><tr><td>Protease-remmercocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Voor koude lysis buffer</td></tr><tr><td>Sheath vloeistof</td><td>BD FACSFlowTM</td><td>342003</td><td>FACS-protocol</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat</td><td>Merck</td><td>7558-79-4</td><td>Koude lysis buffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>Voor koude lysis buffer</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>1677119</td><td>Voor trypsinisatie</td></tr></tbody></table>

omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Melanocyten zijn gespecialiseerde neurale top-afgeleide cellen die aanwezig zijn in de epidermale huid. Deze cellen synthetiseren melaninepigment dat het genoom beschermt tegen schadelijke ultraviolette straling. Verstoringen in het functioneren van melanocyten leiden tot pigmentstoornissen zoals piebaldisme, albinisme, vitiligo, melasma en melanoom. Zebravis is een uitstekend modelsysteem om melanocytenfuncties te begrijpen. De aanwezigheid van opvallende gepigmenteerde melanocyten, het gemak van genetische manipulatie en de beschikbaarheid van transgene fluorescerende lijnen vergemakkelijken de studie van pigmentatie. Deze studie maakt gebruik van wild-type en transgene zebravislijnen die groene fluorescerende eiwit (GFP) expressie aandrijven onder mitfa- en tyrp1-promotors die verschillende stadia van melanocyten markeren. 
Morpholino-gebaseerde uitschakeling van kandidaatgenen wordt bereikt om de fenotypische uitkomst op larvale pigmentatie te evalueren en is van toepassing op screening op regulatoren van pigmentatie. Dit protocol demonstreert de methode van micro-injectie tot beeldvorming en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) -gebaseerde dissectie van fenotypes met behulp van twee kandidaatgenen, koolzuuranhydrase 14 (Ca14) en een histonvariant (H2afv), om de pigmentatie-uitkomst uitgebreid te beoordelen. Verder toont dit protocol het scheiden van kandidaatgenen in melanocytenspecificeerders en differentiatoren die respectievelijk selectief het melanocytenaantal en het melaninegehalte per cel veranderen.

De workflow beschreven in figuur 1 werd gebruikt om op morfolino gebaseerde genetische verstoring uit te voeren in het eencellige stadium van de zebravis. Pigmentatieanalyse werd uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, zoals hieronder vermeld. Om de representatieve resultaten te illustreren, werden gestandaardiseerde volumes antisense morpholino gericht op h2afv - en ca14-genen geïnjecteerd in het dooier- of eencellige stadium van het zebravisembryo. De initiële f...

Regulatoren van melanocytenfuncties regelen zichtbare verschillen in de pigmentatie-uitkomst. Het ontcijferen van de moleculaire functie van het kandidaat-pigmentatiegen vormt een uitdaging. Hierin demonstreren we het gebruik van een zebravismodelsysteem om kandidaten te identificeren en in te delen in regulatoren van melaninegehalte en melanocytenaantal.

Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

Dit protocol is een samensmelting van verschillende technieken die de onderzoekers in staat zouden stellen om de rol van kandidaat-gen in de melanocytenbiologie af te bakenen. Het is een holistische benadering om tot een logische gevolgtrekking te komen. Door verschillende methoden te combineren, kunnen verstorende factoren worden vermeden en kan het onderzoekers helpen een substantieel resultaat te behalen.Om de analyse te beginnen, immobiliseert u de 48 HPF-embryo's met 0,016% tricaïne. Monteer de embryo's met behulp van enkele milliliters 1,5 tot 2% methylcellulose in een petrischaaltje. Pluk de embryo's met een Pasteur-pipet en plaats ze in methylcellulose om beweging tijdens de beeldvorming te beperken.Voor optimale laterale of dorsale beeldvorming past u hun positie aan met een vergroting van meer dan 5x. Leg de petrischaal onder de microscoop. Stel met behulp van een manipulator de vis zo in dat alle vijf de embryonale strepen van melanocyten tegelijkertijd zichtbaar zijn.Leg met behulp van de acquisitiesoftware de beelden vast. Als de vis ontwaakt, plaats hem dan in tricaïnewater totdat hij stabiliseert. Open met behulp van de open tool in ImageJ-software de afbeelding die moet worden gekwantificeerd.Selecteer het vormgereedschap uit de vrije hand om het gebied voor analyse te schetsen. Selecteer de optie metingen instellen, klik op de gemiddelde grijswaarde en vervolgens op het gebied. Om de gemiddelde grijswaarde voor het geselecteerde gebied te berekenen, klikt u op M of gaat u naar analyseren en selecteert u meten.Breng op basis van het stadium van interesse de embryo's over naar een petrischaal met 0,6 milligram per milliliter Pronase. Breng met behulp van een Pasteur-pipet de gedechorioneerde embryo's na vijf tot 10 minuten over in een petrischaal met gewoon embryowater. Verzamel met een glazen Pasteurpipet ongeveer 100 embryo's en breng ze over naar een microcentrifugebuis van twee milliliter.Gooi het medium weg en voeg 200 microliter ijskoude deyolking Ringers-oplossing toe. Plaats de buis op ijs en meng de inhoud ongeveer 20 keer met een pipet om het juk op te lossen. Centrifugeer de buisjes twee keer op 100 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.Breng de ontdooierde embryo's over met behulp van een pipet van één milliliter in een petrischaaltje met 10 milliliter trypsine-oplossing. Meng de oplossing een of twee keer met behulp van een pipet van één milliliter om de aggregatie te verminderen. Passeer de trypsinized suspensie door een 70 micrometer zeef geplaatst op een 50 milliliter conische buis om een enkele cel suspensie te verzamelen.Was de petrischaaltjes met de trypsinized suspensie om de aangehechte cellen van het oppervlak te verwijderen. Voor het tellen van de fluorescerend gelabelde cellen met behulp van een flowcytometer, tekent u na het maken van een nieuwe experimentmap een voorwaartse versus zijverstrooiingsplot. Maak een histogram voor de intensiteit van fluoresceïne-isothiocyanaat.Laad eerst de wildtypecellen om de voorwaartse en zijwaartse spreidingspoorten en de FITC-drempel in te stellen. Laad daarna de cellen geïsoleerd uit transgene FTYRP GFP-lijnembryo's om de melanocyten te tellen. Monteer de embryo's in 1,5 tot 2% methylcellulose in een petrischaaltje.Plaats het onder de microscoop en stel het in de gewenste richting in met behulp van een pipetpunt. Met behulp van de acquisitiesoftware kunt u de afbeeldingen verkrijgen. Voor embryo's van minder dan 24 HPF, met behulp van 10X vergroting, leg het hele beeld vast, terwijl voor embryo's van meer dan 24 HPF, meerdere scanvelden worden verkregen en vervolgens worden samengesteld.Na het uitvoeren van de test onthulde de Brightfield-beeldvorming na 48 uur de aanwezigheid van alle vijf gepigmenteerde melanofoorstrepen. In het 48 HPF-stadium werd het aantal laterale melanoforen berekend en bleek dat de histonvariant h2afv-morfanten een verminderd aantal melanoforen vertoonden in vergelijking met de controlegroep. De gemiddelde grijswaarde werd gemeten voor CA14- en h2afv-morfanten, waaruit bleek dat de waarden hoger waren voor de varianten dan de controlemorfanten.Door gebruik te maken van een op natriumhydroxide gebaseerde spectrofotometrische absorptiemethode werd het melaninegehalte gekwantificeerd waarbij de CA14-morfanten minder inhoud vertoonden dan de controlemorfanten. Fluorescentiebeeldvorming werd uitgevoerd om morfolino-gebaseerde verandering voor verschillende stadia van de ontwikkeling van zebravismelanofoor te evalueren. Het aantal melanoforen in CA14- en h2afv-morfanten werd geanalyseerd met behulp van FACS.Er werd waargenomen dat het aantal melanoforen in CA14 onveranderd bleef, terwijl ze significant verminderd waren in h2afv in vergelijking met de controlemorfant. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit per gebied werd ook berekend, wat aantoont dat de h2afv-morfanten een aanzienlijke afname van de waarde ten opzichte van controlemorfanten vertonen. Terwijl je de vis aanpast voordat je de foto maakt, moet je ervoor zorgen dat je alle vijf melanofoorstrepen kunt visualiseren.Je moet de vis een beetje kantelen om onderscheid te maken tussen de twee zijstrepen. Nadat we de rol van een kandidaat-gen in de ontwikkeling van melanocyten hebben vastgesteld, kunnen we het gen op een weefselspecifieke manier elimineren met behulp van CRISPR-technologie. Dat zal een meer gerichte aanpak zijn.

reverse-genetic-approach-to-identify-regulators-pigmentation-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We tonen onze aanpak voor het vinden van potentiële enhancer elementen uit de op ontwikkelingsgebied gereguleerde genen en evalueren van hun functie door middel van mozaïek zebravis transgenese.

Mozaïek zebravis Transgenese voor het evalueren van Enhancer Sequences

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Een snelle manier om te screenen op melanoom modifiers met behulp van een zebravis autochtone tumor model gepresenteerd. Het maakt gebruik van de miniCoopR vector waarmee expressie van genen kandidaat melanoom in melanocyten. Een methode om melanoom-vrije overleving bochten, een invasie assay, een protocol voor antilichaam kleuring van schaal melanocyten en een melanoom transplantatie assay te verkrijgen zijn beschreven.

Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel

Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

Ontdek hoe je met een omgekeerde genetische benadering regulatoren van pigmentatie identificeert in zebravissen. Deze methode combineert beeldvorming, flow cytometrie en spectrofotometrie om melanocytontwikkeling en melaninegehalte te analyseren.

Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen

Meer video's verkennen