Generatie van menselijke motorische eenheden met functionele neuromusculaire juncties in microfluïdische apparaten

Deze relatief eenvoudige methode kan helpen bij onderzoek gericht op motorneuronen en neuromusculaire juncties in gezondheid en ziekte. Dit protocol maakt gebruik van standaard stamceltechnologie en in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaten die de reproduceerbaarheid verhogen. De ontkoppeling van motorneuronen en spiercellen is een vroeg fenomeen bij verschillende neuromusculaire ziekten.

Een eenvoudig gehumaniseerd model zou kunnen helpen bij het ontwikkelen van strategieën om dit fenomeen tegen te gaan. We gebruiken dit model om de motorneuronstoornis, amyotrofische laterale sclerose, te onderzoeken, maar dit model kan ook worden gebruikt voor andere aandoeningen waarbij de motorische eenheid essentieel is. Begin met het overbrengen van het apparaat met behulp van de tang van de zeecontainer naar de petrischaal met 10 milliliter 70% tot 100% ethanol voor sterilisatie gedurende 10 seconden.

Breng het apparaat met een tang over op een stuk papier om het gedurende ongeveer 30 minuten aan de lucht te drogen in de Laminar Flow. Zodra een apparaat is gedroogd, gebruikt u een tang om elk apparaat naar een individuele petrischaal van 10 centimeter te verplaatsen. Om het apparaat te coaten met Poly-L-ornithine of PLO, voegt u 100 microliter PLO-oplossing toe aan de bovenste put en observeert u de vloeistof die van de bovenste put door het kanaal naar de onderste put gaat.

Voeg vervolgens 100 microliter PLO-oplossing toe aan de onderste put en herhaal dit aan de andere kant van de microgroeven. Werk af door aan één kant 100 microliter PLO-oplossing toe te voegen om een volumegradiënt te creëren tussen de twee gespiegelde zijden van het apparaat om de microgroeven te coaten. Incubeer gedurende drie uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Was het apparaat na drie uur driemaal gedurende vijf minuten met DPBS. Coat het apparaat met 20 microgram per milliliter laminine en neurobasaal medium door de procedure te volgen die vergelijkbaar is met PLO-coating. Incubeer het apparaat 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Gebruik de volgende dag een pipet van 200 microliter en plaats de punt in de put tegenover de kanaalopening om de lamininecoating uit de putten te verwijderen. Nadat u DPBS aan alle putten hebt toegevoegd, laat u de apparaten met DPBS in de Laminar Flow op kamertemperatuur voor celzaaien. Knip de SCM-vellen op de grootte van het apparaat terwijl u aan elke kant een paar millimeter overlaat.

Na het steriliseren van de apparaten en SCM-vellen in een petrischaal met 10 milliliter 70% tot 100% ethanol gedurende 10 seconden, breng je de apparaten met een tang over op een zes-well plaat en de SCM-platen naar een petrischaaltje van 10 centimeter voor luchtdroging in de Laminar Flow. Plaats het apparaat op de rand zodat alle zijden ongeveer 30 minuten kunnen drogen. Coat de apparaten door één milliliter PLO-oplossing per put toe te voegen aan elk apparaat in de zes-putplaat.

Zorg ervoor dat het apparaat bovenop de PLO-oplossing zweeft met de kanaal- en microgroefzijde naar beneden gericht in de vloeistof. Coat de SCM-vellen door 10 milliliter PLO-oplossing toe te voegen aan de petrischaal van 10 centimeter en gebruik de tang om de SCM-vellen in de vloeistof te duwen. Incubeer apparaten en SCM-vellen gedurende drie uur zoals eerder gedemonstreerd.

Was de apparaten en SCM-vellen na drie uur twee keer gedurende vijf minuten met DPBS, gevolgd door nog een wasbeurt gedurende vijf minuten met steriel water. Breng vervolgens elk SCM-vel over op een individuele petrischaal van 10 centimeter om aan de lucht te drogen. Gebruik tijdens het werken onder een microscoop in de Laminar Flow een tang om het siliconenapparaat met het kanaal en de microgroef naar beneden in een hoek van 90 graden op het SCM-vel te monteren, zodat alle zijden zijn uitgelijnd.

Druk lichtjes op het apparaat om ervoor te zorgen dat u niet alleen de buitenranden afdicht, maar ook rond putten, kanalen en microgroeven. Om het apparaat te coaten met laminine, in de Laminar Flow en onder de microscoop, voegt u 100 microliter van 20 microgram per milliliter oplossing van laminine toe aan de bovenste put met behulp van een pipet van 200 microliter. Observeer de vloeistof die van de bovenste put door het kanaal naar de onderste put gaat zonder enige lekkage rond de put en het kanaal.

Voeg vervolgens 100 microliter laminine-oplossing toe aan de bodemput, herhaal dit aan de andere kant van de microgroeven en werk af met nog eens 100 microliter laminine aan één kant om een volumegradiënt te creëren tussen de twee gespiegelde zijden van het apparaat om de microgroeven te coaten en incubateer het apparaat vervolgens een nacht. Verwijder de volgende dag de coating van de putten met de pipet van 200 microliter door de punt in de put tegenover de kanaalopening te plaatsen, na dpbs aan alle putten te hebben toegevoegd, laat u de apparaten met DPBS in de laminaire stroom bij kamertemperatuur voor celzaaien. Om de neurale voorlopercellen of NPC's in het microfluïdische apparaat te platen, verwijdert u DPBS uit twee putten aan één kant van de microgroeven in het apparaat met behulp van een pipet van 200 microliter.

Om in totaal 250.000 NPC's en 60 tot 100 microliter van dag 10 motorneuronmedium per apparaat te zaaien, zaai je rechtsboven de helft van de celsuspensie dicht bij de kanaalopening onder een hoek van 45 graden. Pauzeer een paar seconden om de celsuspensie door het kanaal te laten stromen voordat u de resterende helft van de celsuspensie in de onderste put toevoegt. Gebruik een pen om de gezaaide zijde te markeren als NPC of gelijkwaardig, voor eenvoudige oriëntatie van het apparaat zonder microscoop, en incubeer gedurende vijf minuten voor celbevestiging.

Vul vervolgens langzaam de twee NPC-gezaaide putten aan met een extra dag 10 motorneuronmedium tot een totaal volume van 200 microliter per put. Verwijder met een pipet van 200 microliter DPBS uit de twee putjes aan de andere kant van de microgroeven tegenover de vers gezaaide NPC's. Voeg 200 microliter motorneuronmedia per put toe aan de ongeplaatste putten.

Voeg vervolgens zes milliliter DPBS per schotel van 10 centimeter rond het apparaat toe om verdamping van het medium tijdens de incubatie te voorkomen. Om het medium te vervangen, verwijdert u langzaam media in beide putten met NPC's door de pipetpunt van 200 microliter aan de onderkant van de putwand tegenover de kanaalopening te plaatsen. Om te voorkomen dat een sterke mediumstroom de cellen op het kanaal beschadigt, voegt u langzaam 50 tot 100 microliter vers motorneuronmedium toe aan elke put door voortdurend te wisselen tussen de bovenste en onderste put.

Herhaal het proces totdat elke put 200 microliter medium bevat. Verwijder op dag 17 van de differentiatie van motorneuronen het motorneuronmedium aan de ongerichte kant van de microgroeven in het apparaat met een pipet van 200 microliter en was de putten met DPBS. Zaai in totaal 200.000 menselijke primaire mesoangioblasten of MABs, in 60 tot 100 microliter groeimedium per apparaat door de helft van de celsuspensie in de bovenste put te zaaien.

Pauzeer een paar seconden om de celsuspensie door het kanaal te laten stromen voordat de resterende helft van de celsuspensie in de onderste put wordt gezaaid, zoals eerder is aangetoond voor het platen van NPC's. Incubateer het apparaat gedurende vijf minuten voor celbevestiging. Vul vervolgens de twee vers MAB-gezaaide putten aan met een extra groeimedium en incubeer opnieuw zoals aangetoond.

Om de chemotactiek en volumetrische gradiënt op de 21e dag van de differentiatie van motorneuronen te initiëren, voegt u 200 microliter per put van motorneuron neurobasaal medium met groeifactoren toe aan het Myotube-compartiment en voegt u vervolgens 100 microliter per put van motorneuron basaal medium zonder groeifactoren toe aan het motorneuroncompartiment. Het is belangrijk om het differentiatiepotentieel van de cellijnen te beoordelen voordat ze worden meegekweekt in microfluïdische apparaten. De fusie-index van MABs werd bepaald en ongeveer 8% werd geschat als voldoende voor co-cultuur.

De gegenereerde motorneuronculturen waren 85 tot 95% positief voor motorneuronmarkers. Voor het karakteriseren en kwantificeren van de hoeveelheid neuromusculaire juncties of NMJ's, werd het aantal co-lokalisaties tussen het motorneuron en pre-synaptische markers neurofilament zware keten en synaptofysine en postsynaptische acetyleenreceptormarker alfa bungarotoxine geteld door elke ziektestapel en werd genormaliseerd bij een aantal myosine-zware keten gelabelde Myotubes aanwezig in de Z-stack. De NMJ's verschenen als één contactpunt NMJ's waar neuriet op één interactiepunt een cluster van een subtiele cholinereceptor aanraakte.

Of als meerdere contactpunt NMJ's waar een neuriet uitwaaierde en zich bezighield met de subtiele cholinereceptorcluster over een groter oppervlak. Kwantificering van het percentage motorneuron geïnnoveerde Myotubes gaf aan dat niet alle Myotubes NMJ's bevatten. Bij activering van motorneuronen met kaliumchloride werd calciuminstroom waargenomen in de Fluo-4 gelabelde Myotubes, die een functionele verbinding met motorneuronneuronneuriet in de Myotube bevestigden, de toevoeging van NMJ-blokker d-tubocurarine of DTC aan het Myotube-compartiment resulteerde in een remming van calciuminstroom.

Om het grootste succes met dit model te hebben, is het ongelooflijk belangrijk om een cellijnkwaliteitscontrole uit te voeren en de vorming van luchtbellen in de kanalen van het apparaat te voorkomen. Het combineren van de neuromusculaire junctie in een schotel met andere IPC directe celtypen bootst nog beter de in vitro situatie na, dit maakt het ook mogelijk om de rol van deze celtypen te bestuderen.