Whole Ovary Immunofluorescentie, Clearing en Multiphoton Microscopie voor kwantitatieve 3D-analyse van de zich ontwikkelende ovariële reserve bij muizen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een van de belangrijkste vragen op het gebied van voortplanting, namelijk hoe en wanneer genetisch gereguleerde processen de grootte van de ovariële reserve beïnvloeden waarvan we weten dat ze van invloed zijn op vrouwen, reproductieve levensduur Dit protocol kan worden aangenomen voor grootschalige studies met dezelfde technieken voor intacte eierstokken uit verschillende ontwikkelingsstadia. Het genereert produceerbare gegevens door een efficiënte kwantificering van geslachtscellen te bieden. Deze methode toegepast op genetisch diverse dieren van dezelfde soort kan inzicht geven in de genetische factoren direct kiemcel- en eierstokontwikkeling en andere ontwikkelingsorganen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Nathaniel Boechat, een onderzoeksstagiair uit mijn laboratorium Om te beginnen met de overdaadstapplaats en de verdoofde puberale vrouwelijke muis op zijn rug vast te zetten door alle benen zachtjes door de voetzolen in een ontspannen positie op een plank te pinnen. Om de thoracale holte van de muis te openen, snijdt u voorzichtig de ribben aan beide zijden van het borstbeen net onder de scapula, vermijdt u het doorboren van de longen, grijpt u de huid of ribflappen met de tang en pint u de flappen vast om de inwendige organen bloot te leggen, gebruikt u een dissectieschaar om het rechteratrium van het hart te knippen en bloed uit het systeem vrij te maken. Steek vervolgens door het hart met een tang vast te houden een perfusienaald in de linker ventrikel en pomp 10 milliliter PBS met een zachte en constante druk.

Wanneer de weefsels zoals de levernieren en het voortplantingskanaal van roze naar wit zijn gedraaid, vervangen ze de PBS door vers gemaakte 1% paraformaldehyde of PFA en gaan ze door met de perfusie met ongeveer 10 milliliter PFA. Lokaliseer vervolgens het vetkussen met de eierstokken onder de nier en ontleed voorzichtig het hele voortplantingskanaal inclusief de vetkussen eierstokken en baarmoederhoorns om het in een injectieflacon met 4% PFA te plaatsen. Fixeer de eierstokken gedurende 16 tot 24 uur op kamertemperatuur voordat u de 4% PFA vervangt door 70% ethanol.

Op de dag van de kleuring trim de eierstokken voordat u verder gaat met de immunokleuring. Op dag één van het immunokleuringsprotocol pipetteer één milliliter PBS per put in het gewenste aantal putten in een schone 24 putplaat. Snijd de punt van een pipetpunt van 1000 microliter af om een brede opening te maken en gebruik de brede punt om de puberale eierstokken voorzichtig van injectieflacons met 70% ethanol in de putten over te brengen en vervang PBS in de put door verse 0,8 milliliter PBS De volgende dag zuig PBS uit de putten om het te vervangen door 0,8 milliliter van de permeatiebuffer per put.

Na het incuberen van de platen op de shaker bij kamertemperatuur gedurende vier uur vervangt u de permeatiebuffer door de blokkerende buffer Op dag drie bereidt u de primaire antilichamen voor door verdunning in de blokkerende buffer. Om de eicellen te visualiseren, incuberen de prenatale en prepuberale eierstokken met de eicelmarkers. Was de monsters op dag acht gedurende twee uur met een verse wasbuffer en vervang vervolgens de wasbuffer door 0,5 milliliter van de secundaire antilichaammengsels verdund in een blokkerende buffer.

Sluit de plaat af met een parafilm om verdamping te voorkomen en incubeer de monsters bij kamertemperatuur in het donker gedurende drie dagen. Op dag 11 na de immunokleuringswas, zuig de wasbuffer op en incubeer de monsters met 0,8 milliliter van de schaalkubieke één oplossing bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen in het donker. Dagelijks de weegschaal één oplossing veranderen.

Was de monsters op dag 15 driemaal gedurende 10 minuten en 0,8 milliliter PBS bij kamertemperatuur met zacht schudden. Vervang vervolgens de PBS door 0,8 milliliter van de vers bereide ontgaste 20% sucrose met PBS gevolgd door zacht schudden bij kamertemperatuur. Vervang na een uur de 20% sucrose-oplossing om de monsters te behandelen door 0,8 milliliter van de schaal kubieke twee oplossing gedurende vier tot vijf dagen, zoals eerder uitgelegd.

Om een monsteropstelling voor te bereiden, gebruikt u een pipetpunt van 200 microliter met de puntafsnijding om de puberale eierstokken met 15 tot 20 microliter schaalkubieke twee oplossing in het midden van de lijmput over te brengen. Zodra de eierstokken in de individuele put zijn overgebracht met een druppel opruimoplossing, plaatst u voorzichtig een dekglas op de kleefput en drukt u om een afdichting te maken die de monsters en de oplossing tussen twee afdekslips sandwicht. Voor beeldvorming plaats, de cover slip sandwich in een 3D-geprinte microscoop adapter dia.

Stel de parameters voor beeldacquisitie in op basis van de microscopiekernen of de specificaties van de fabrikant. Gebruik indien beschikbaar de bidirectionele beeldacquisitie om de scantijd te verkorten en de efficiëntie te verbeteren. Pas het lijngemiddelde, het framegemiddelde en de frameaccumulatie in de software aan.

Stel de Z-stack in door de begin- en eindpositie te identificeren en selecteer vervolgens een Z-stapgrootte van twee micrometer voor prepuberale eierstokken en vijf micrometer voor puberale eierstokken. Activeer vervolgens de Z-compensatiefunctie en de excitatieversterking. Stel de Z-compensatie voor de onderkant en bovenkant van het monster in door een laserintensiteit voor beide te selecteren.

Gebruik de tegelmodus voor grotere monsters die niet in één gezichtsveld kunnen worden vastgelegd. Activeer de afbeeldingsnavigator en geef het aantal tegels aan dat nodig is om het volledige monster vast te leggen met het rechthoekige markeergereedschap. Zodra de instelling is voltooid, begint u met de beeldacquisitie voor de afbeeldingen met meerdere tegels, begint u met de afbeeldingsacquisitie met de navigator om alle tegels vast te leggen.

Sla na de beeldacquisitie alle afbeeldingen op. En als er meerdere tegels zijn verkregen, voert u het gereedschap mozaïek samenvoegen uit om de tegels samen te voegen tot één afbeelding. Als u de grootte van de eicellen wilt bepalen, opent u de afbeelding en selecteert u de segmentoptie om de afbeelding van de Zs-stapel te openen.

Selecteer de lijnoptie en het meetpaneel en meet de afstand door een lijn te tekenen van de ene rand van een eicel of marker naar de andere rand op het breedste punt om de X Y-diameter van de eicel te bepalen. Beweeg door de stapel en verkrijg het bereik van diameters voor meerdere eicellen van hetzelfde type. Gebruik de kortste lengte als het grootteselectiecriterium voor eicellen telt.

Selecteer vervolgens in de optie 3D-weergave de spotfunctie. Activeer in het scènepaneel de functie Nieuwe spots toevoegen om het algoritmepaneel te openen. Schakel vervolgens alle algoritme-instellingen uit als het grootteselectiefilter met de eerder verkregen eicellengrootte.

Klik op de kanaal pijl vooruit om naar het bronkanaal te gaan. Selecteer vervolgens het kanaal met de gewenste marker en typ de verkregen diameter in de geschatte X, Y-diameter. Na de grootteselectie activeert u de psf-rek en achtergrondaftrek van het model die automatisch worden bepaald.

Kies vervolgens de enkele pijl-vooruit om naar het deelvenster filterpunten te gaan en voeg het kwaliteitsfilter toe om een drempelwaarde te bepalen. Om de nauwkeurige schatting van het aantal eicellen te garanderen, vergroot u het beeld. Klik later op de dubbele pijl om geautomatiseerde tellingen te voltooien.

Gebruik het tabblad Bewerken om handmatig gemiste eicellen te selecteren of om niet-eiceldeeltjes te deselecteren die zijn geselecteerd door de automatische drempelwaarde. Als u klaar bent, registreert u de gegevens op het tabblad Statistieken onder het algemene tabblad voor verdere analyse. Om het totale aantal eicellen en de beschadigde eierstokken te schatten, opent u afbeeldingen van de intacte eierstokken met MRS en selecteert u de framefunctie.

Schakel onder de frame-instellingen de selectievakjes voor het raster en de toegangslabels in. Selecteer in de positie XYZ tab 200 microme om vinkjes te genereren met 200 micrometer ruimtes in alle XYZ posities. Selecteer met behulp van de vinkjes van 200 micrometer eicellen die binnen 50% van het volume van elke eierstok vallen.

Klik op de vlekkenfunctie en selecteer de bewerkingslabels om de eicellen die binnen het 50%-gebied vallen op kleur te classificeren. In de representatieve grijswaarden, multifotonenbeelden van de niet-geperfundeerde en geperfundeerde eierstokken, waren de kleine eicellen in primordiale follikels met de dunne laag cytoplasmatische DDX4-kleuring te zien. Bovendien werden de grotere eicellen in de groeiende follikels gespot.

De 3D-weergaven van de multifotonbeelden van de prenatale en de postnatale eierstokken werden bestudeerd. Op de postnatale dag 28 bevatte de eierstok van het niet-bestraalde vrouwelijke een grote populatie van kleine eicellen in de primordiale follikels. Daarentegen waren de eierstokken van het bestraalde vrouwtje met 0,5 grijs van de gammastraling volledig verstoken van kleine eicellen in de primaire follikels.

Maar grotere eicellen waren nog steeds aanwezig. Voor de kwantificering van de eicellen werden de 3D multifotonbeelden verwerkt in de MRS-software met behulp van het goucianfilter en de eicellen van kleine en grote afmetingen werden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van de spotfunctie. Vervolgens werd het gemiddelde percentage van de eicellen in elk stadium berekend in vergelijking met het gemiddelde aantal aanwezig in het vroegste stadium E 15,5 eicellen aantallen daalden sterk tussen E 15,5 en E 18,5 de E 15,5 en E 18,5 foetale oöcyten uitgedrukt lijn één of één P zoals te zien in de multifotonenafbeeldingen.

De intensiteitsanalyse toonde hogere expressies van lijn één of één P per eicel bij E 18,5 dan E 15,5. De eierstokken met kleine schade kunnen worden gebruikt voor analyse. Het totale aantal eicellen wordt bepaald met behulp van computationele correctie.

Het representatieve model toont G CNA-positieve eicellen in de E 15,5-eierstok met vijf 10%-gebieden gemarkeerd in een intacte eierstok. Op dezelfde manier werd een gesimuleerde eierstok gegenereerd met 10% incrementele gebieden die tot 50% van de eierstok misten. Het totale aantal eicellen en de gesimuleerde eierstokken werden vergeleken met de oorspronkelijke intacte eierstokken.

En het verschil werd gepresenteerd als de procentuele afwijking Goede perfusie resulteert in een goede beeldkwaliteit. Zorg er dus voor dat alle weefsels worden gewist met PBS voordat u overschakelt naar PFA. Zorg ervoor dat de eierstokken volledig worden blootgesteld door het extra weefsel weg te knippen.

Het protocol maakt een efficiënte analyse van een groot aantal monsters mogelijk, kwantitatieve gegevens verkregen uit genetische referentiepopulaties zoals gezamenlijke kruis- of diversiteitsoutput zullen helpen bij het identificeren van genetische modifiers van de ontwikkeling van eicellen en het aantal eicellen.