Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse
7 december 2021
Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.
De twee peelingtechnieken die hier worden gedemonstreerd, isoleren individuele staafsubcellulaire compartimenten en kunnen helpen de belangrijke fysiologische processen te onthullen die zich in elk gespecialiseerd compartiment voordoen bij gezonde en zieke staafjes. Het isoleren van verschillende staafcelcompartimenten van het netvlies van de muis kan een uitdaging zijn. Deze eenvoudige technieken maken gebruik van goedkope en alledaagse laboratoriummaterialen om staafsubcellulaire compartimenten betrouwbaar te isoleren voor eiwitanalyse.
Plaats om te beginnen een stuk filterpapier in een petrischaal gevuld met Ames HEPES-buffer met 100% zuurstof. Breng vervolgens met behulp van een transpetpet met brede boring één retinale rechthoek over die is ontleed van een twee tot drie maanden oude C57 Black 6J-muis. Oriënteer het gewanden van het netvlies omhoog en zorg ervoor dat de fotoreceptoren naar beneden gericht zijn naar de onderkant van de schaal.
Pak vervolgens met een pincet de zijkanten van het gehalveerde netvlies lichtjes vast en beweeg deze bovenop het filterpapier. Zodra het netvlies gecentreerd is, beweegt u het filterpapier naar boven zodat het gehalveerde netvlies het filterpapier raakt om het buitenste segment van de staaf te maken, of ROS om de hechting van het papier te filteren. Til het filterpapier met het aangesloten netvlies voorzichtig uit de Ames HEPES-buffer.
Leg de onderkant van het filtreerpapier op een keukenpapier en dep twee tot drie keer om te drogen. Voeg een druppel Ames HEPES toe aan de zijkant van het filterpapier met het netvlies en leg het filtreerpapier opnieuw op het keukenpapier om te drogen. Plaats vervolgens het filterpapier met het netvlies terug in de petrischaal en duw met een pincet voorzichtig alle randen van het gehalveerde netvlies aan alle kanten omhoog en weg van het filterpapier.
Pel het netvlies voorzichtig weg van het filterpapier en raak alleen de extreme omtrek van het netvlies aan om de structurele integriteit te behouden. Til vervolgens het filterpapier uit de petrischaal en verwijder overtollige vloeistof op een papieren handdoek, zodat de kant die in contact komt met het netvlies geen contact maakt met het keukenpapier. Plaats het filterpapier met de gedeeltelijke ROS-laag in een gelabelde buis op ijs en houd het geschilde netvlies ondergedompeld in de Ames HEPES-buffer.
Herhaal het peelingproces voor dit gehalveerde netvlies ongeveer zeven tot acht keer om de hele ROS-laag te verwijderen. Plaats na elke peeling het filterpapier in dezelfde buis om alle ROS geïsoleerd uit één gehalveerd netvlies te combineren. Bewaar de buis met alle filterpapierschillen van de geïsoleerde ROS op ijs voor onmiddellijk gebruik.
Breng met een pincet het overgebleven geschilde netvlies over in een op de juiste manier gelabelde buis en houd de buis op ijs voor onmiddellijk gebruik. Om het retinale monster voor te bereiden op lyofilisatie, plaatst u een stuk filterpapier en brengt u een gehalveerd netvlies over in een petrischaal gevuld met koude Ringer's buffer. Draai vervolgens met een pincet het netvlies voorzichtig om zodat het concaaf omhoog is georiënteerd en beweeg het om op het filterpapier te rusten.
Til het filtreerpapier bij de randen omhoog zodat het gehalveerde stuk netvlies het filterpapier raakt. Blijf het filterpapier uit de oplossing van Ringer tillen. Plaats vervolgens de onderkant van het filterpapier op een keukenpapier en dep voorzichtig twee tot drie keer om overtollige vloeistof te verwijderen.
Pak vervolgens het filterpapier op met een pincet en voeg een druppel koude Ringer's toe aan de zijkant van het filterpapier met het netvlies. Plaats het filtreerpapier nogmaals op het keukenpapier om overtollige vloeistof te verwijderen. Bewaar elk geplakt netvlies- en filterpapiermonster in een petrischaal gevuld met koude Ringer's totdat het klaar is om alle monsters in te vriezen.
Til vervolgens met een pincet elk monster uit de buffer van de koude Ringer en zorg ervoor dat het pincet alleen contact maakt met de randen van het filterpapier, waardoor het gehalveerde netvlies wordt vermeden. Plaats de onderkant van elk filtreerpapier op een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Voeg vervolgens een druppel koude PBS toe aan de zijkant van het filterpapier waar het netvlies is geplakt en dep het filterpapier opnieuw op het keukenpapier.
Plaats alle stukjes filterpapier in de petrischaal en gebruik pluisvrij tissuepapier om overtollige vloeistof rond het filterpapier af te voeren. Wikkel vervolgens de hele schaal goed in met aluminiumfolie en zorg ervoor dat de randen van de aluminiumfolie worden vastgezet en soepel in de bodem van de petrischaal worden gedrukt. Prik een handvol gaten van 0,1 tot 0,2 millimeter in het deksel van aluminiumfolie.
Laat vervolgens met behulp van een metalen tang de met aluminiumfolie bedekte petrischaal geleidelijk zakken tot vloeibare stikstof. Bewaar de monsters in vloeibare stikstof totdat ze klaar zijn om te lyofieliseren. Voor lyofilisatie plaatst u de met aluminiumfolie bedekte petrischaal in een vriesdroogkolf en bevestigt u deze aan de lyofilisatormachine volgens het protocol van de fabrikant.
Lyofiliseer het netvlies gedurende 30 minuten. Verzamel na lyofilisatie het buitenste en binnenste segment van de staaf door voorzichtig een klein stukje tape op het gelyofiliseerde netvlies te leggen en lichte druk uit te oefenen met het pincet om ervoor te zorgen dat het zich bindt met de fotoreceptorlaag. Trek de tape langzaam weg en zorg ervoor dat zowel de ROS als RIS zich aan de tape hebben vastgehecht.
Een dunne, witte film zal aanwezig zijn op het gebroken oppervlak. Dit is de RIS. Om deze RIS te scheiden, plaatst u nog een stuk tape en duwt u de tape naar beneden op het gebroken oppervlak.
Plaats vervolgens het stuk tape met alleen de oranje-roze laag in een microcentrifugebuis met het label ROS en stukjes tape met de dunne, witte laag in een andere buis met het label RIS. Verzamel vervolgens met behulp van tape het resterende retinale weefsel op het filterpapier door de dikke, witte laag af te pellen. Plaats dit isolaat vervolgens in een buis met het label OIS.
Als u dezelfde dag wordt gebruikt, bewaar dan de geïsoleerde lagen van het gelyofiliseerde netvlies bij kamertemperatuur. Bij aan het donker aangepaste dieren kwam de verdeling van GNAT1 en ARR1 nauw overeen met hun bekende dark-state distributies, waarbij het GNAT1-signaal zichtbaar het sterkst was in de ROS-isolatie en het ARR1-signaal robuuster was in de ROS-isolatie. Kwantificering van de GNAT1- en ARR1-signalen toonde significante verschillen tussen donkerlichtomstandigheden voor GNAT1 en ARR1 in ROS- en ROS-monsters.
In zowel donkere als licht-aangepaste monsters zijn G beat 5S, cytochroom C en actine signalen uitgesloten van de ROS-monsters, wat een afwezigheid van besmetting van andere cellulaire lagen aantoont. Bovendien was het G beta 5L-signaal duidelijk zichtbaar in de ROS-monsters. Scanning elektronenmicroscopie van de oppervlakken van intact en geschild gelyofiliseerd netvlies toonde aan dat, vóór het pellen met plakband, het oppervlak van intact gelyofiliseerd netvlies nauw overeenkwam met de karakteristieke cilindrische ROS.
Na de eerste tape peeling leken de ROS en RIS volledig te zijn verwijderd, zoals blijkt uit de uniforme nucleaire laag die aanwezig is op het oppervlak van het overgebleven, geschilde, gelyofiliseerde netvlies. Volgende tapepeelings verwijderden RIS van het vrije oppervlak van de geschilde laag. Deze techniek toonde ook aan dat GRK1-immunoreactiviteit het meest intens was in ROS-monsters in aan licht blootgesteld netvlies en afwezig in OIS-monsters.
Omgekeerd vertoonden ROS- en RIS-monsters een zwak signaal voor PKC-alfa, dat gewoonlijk niet wordt gedetecteerd in ROS of RIS door immunofluorescentiekleuring. Ten slotte kan suboptimale tapepeeling licht verontreinigde monsters opleveren. Het RIS-monster was besmet met een OIS-monster, waardoor zowel G beta 5L- als G beta 5S-banden en een hoger PKC-alfasignaal werden geproduceerd.
Voorzichtigheid is geboden bij het lyofiliseren van het netvlies. Als een onjuiste lyofilisatietechniek wordt gebruikt, kan het netvlies smelten, waardoor het isoleren van verschillende staafsubcellulaire lagen met tape onmogelijk wordt. Het gebruik van deze tape peeling methode in combinatie met qRT-PCR heeft de scheiding van fotoreceptor transcripties van de rest van het netvlies mogelijk gemaakt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert twee technieken voor het isoleren van subcellulaire compartimenten van muis-staafjesfotoreceptoren, met als doel het begrijpen van de fysiologische processen in zowel gezonde als zieke toestanden. De protocollen maken gebruik van levende netvlies en gevriesdroogde monsters, en gebruiken gebruikelijke laboratoriummaterialen voor effectieve isolatie voor eiwitanalyse.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Fotoreceptorbiologie
- Eiwitanalyse
Achtergrond
- Isolatie van subcellulaire compartimenten van staafjes is cruciaal voor het bestuderen van de fysiologie van fotoreceptoren.
- Er zijn uitdagingen bij het behoud van de integriteit van retinale structuren tijdens isolatieprocessen.
- Gangbare technieken vereisen vaak geavanceerde of dure hulpmiddelen; deze studie biedt eenvoudigere alternatieven.
Doel van de studie
- Protocollen detailleren voor het isoleren van buitenste en binnenste segmenten van staafjes uit muisnetvlies.
- Eiwitanalyse van de geïsoleerde compartimenten mogelijk maken.
- Toekomstig onderzoek naar fysiologische veranderingen in fotoreceptoren ondersteunen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van levend netvlies met behulp van cellulosefilterpapier en Ames HEPES-buffer.
- Gevriestdrogingsproces voor zowel buitenste als binnenste segmentisolaties.
- Gebruik van plakband voor het verwijderen van lagen uit het gevriesdroogde netvlies.
- Meerdere peelingiteraties om een uitgebreide laagisolatie te garanderen.
Belangrijkste resultaten
- De beschreven methoden maken betrouwbare scheiding van buitenste (ROS) en binnenste staafjessegmenten (RIS) mogelijk.
- Testen bevestigde verschillende eiwitsignalen in ROS en RIS onder verschillende lichtomstandigheden.
- De studie benadrukt significante moleculaire verschillen tussen de geïsoleerde compartimenten.
Conclusies
- Dit werk maakt een beter begrip mogelijk van de functionaliteit van staafjesfotoreceptoren door gedetailleerde compartimentanalyse.
- De isolatietechnieken kunnen breed worden toegepast voor onderzoekstoepassingen in fotoreceptorbiologie.
- Bevindingen kunnen toekomstig onderzoek naar retinale ziekten en fotoreceptorfysiopathologie informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating subcellular compartments of rod photoreceptors enables precise measurement of protein distribution, supporting target validation in retinal disease research. These peeling methods provide enriched, compartment-specific fractions for quantitative western blot analysis, improving mechanistic de-risking of photoreceptor targets. The techniques are adaptable to healthy and degenerating retinae, offering translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating rod outer segment (ROS) and inner segment (RIS) for protein-specific analysis.
- Operational Value: Uses inexpensive, common lab materials (filter paper, tweezers, tape) to isolate subcellular compartments without specialized equipment.
- Predictive Value: Facilitates quantitative measurement of photoreceptor protein redistribution under dark- and light-adapted conditions, supporting functional target assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers enriched subcellular fractions (ROS, RIS, OIS) that reduce contamination from other retinal layers, improving assay specificity.
- Operational Value: Simple peeling workflow allows rapid preparation of samples for downstream protein analysis, increasing throughput in early screening.
- Predictive Value: Enables reliable detection of compartment-specific proteins (e.g., GNAT1 in ROS, ARR1 in ROS) under defined physiological conditions, supporting biomarker-aligned assay design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by allowing isolation of compartments from both healthy and degenerating retinae.
- Operational Value: Lyophilization and tape-based peeling preserve structural integrity, enabling consistent sample preparation across experimental conditions.
- Predictive Value: Demonstrates absence of contamination (e.g., exclusion of G beta 5S, cytochrome C, actin from ROS) confirming layer-specific protein signals for reliable translational readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven isolation of photoreceptor compartments prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating ROS and RIS to study protein localization and redistribution.
- Screening: Generates quantitative, compartment-specific protein outputs suitable for assay standardization and reproducibility testing.
- Analytics: Provides measurable readouts (e.g., GNAT1, ARR1, GRK1 signals) that allow comparison across light/dark conditions and disease states.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling protein analysis in disease models of retinal degeneration.
- Enterprise Reuse: Protocol uses standardized, low-cost materials, supporting adaptation across labs and model systems as a reusable isolation capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through compartment-specific protein resolution.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via simple, repeatable peeling steps using accessible lab supplies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of target engagement and subcellular specificity, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on target distribution in photoreceptor compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection and handling of delicate neural tissue under sterile or controlled conditions.
- Dependent on standard lab equipment: Petri dishes, filter paper, tweezers, tape, lyophilizer, and buffers (Ames HEPES, Ringer's, PBS).
- Necessitates cross-team standardization of peeling technique and lyophilization timing to ensure sample integrity and reproducibility.
- Must account for adaptation across model systems, as retinal curvature and layer thickness may vary between species or disease states.
- Practical limitation: suboptimal tape peeling or improper lyophilization can yield contaminated samples, requiring careful technique execution.
