Name: Optimalisatie van het Retinal Vein Occlusion Mouse Model om variabiliteit te beperken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor retinale veneuze occlusie bij muizen met rose bengale en laserbeeldvorming. Deze methode maakt real-time monitoring van vasculair letsel en oedeem mogelijk zonder chirurgische ingreep.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<div>Dit werk werd ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (naar CCO), het National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (naar AMP) en het National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (naar CMT).</div>

Dit protocol volgt de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Knaagdierexperimenten werden goedgekeurd en gecontroleerd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Columbia University.
OPMERKING: Alle experimenten gebruikten twee maanden oude mannelijke muizen die ongeveer 20 g wogen.
1. Bereiding en toediening van tamoxifen voor induceerbare genetische ablatie van gevlokte genen
OPMERKING: De diameter van het netvliesvat kan worden beïnvloed door het gewicht van het dier. Zorg ervoor dat alle dieren die voor een experiment worden gebruikt, een vergelijkbaar gewicht hebben.
<ol><li>Verdun tamoxifen in maïsolie tot een concentratie van 20 mg / ml. OPMERKING: Tamoxifen is een giftig middel en is lichtgevoelig. Bescherm tegen licht, bijvoorbeeld met aluminiumfolie.</li>
	<li>Vortex de oplossing voor een paar seconden.</li>
	<li>Laat 15 min in de oven op 55 °C staan. OPMERKING: Zorg ervoor dat de tamoxifen volledig is opgelost. Extra vortexing kan nodig zijn.</li>
	<li>Bewaar de oplossing bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.</li>
	<li>Gebruik een spuit van 1 ml met een naald van 26 G voor tamoxifeninjectie. Reinig het injectiegebied met 70% ethanol.  Dien 2 mg tamoxifen (100 μL van 20 mg/ml) intraperitoneaal (IP) eenmaal daags toe gedurende de vastgestelde tijd volgens de specifieke induceerbare Cre-lijn.</li>
	<li>Zorg voor twee dagen rust voor de dieren voordat u met de experimenten begint.</li>
</ol>2. Bereiding van reagentia voor laserfotocoagulatie
<ol><li>Roos bengalen LET OP: Rose bengal is lichtgevoelig. Bewaren in het donker tot gebruik en bereid vers voor op het beste resultaat.<ol><li>Bereid rozenbeen door het te verdunnen tot 5 mg / ml in steriele zoutoplossing en filter het door een spuitfilter van 0,2 μm.</li>
		<li>Bereid een spuit van 1 ml met een naald van 26 G met roos.</li>
	</ol></li>
	<li>Ketamine/xylazine<ol><li>Verdun ketamine en xylazine in steriele zoutoplossing dienovereenkomstig voor de volgende concentraties: ketamine (80-100 mg / kg) en xylazine (5-10 mg / kg).</li>
	</ol></li>
	<li>Carprofen<ol><li>Verdun carprofen tot 1 mg/ml in steriele zoutoplossing.</li>
		<li>Bereid een spuit van 1 ml met een naald van 26 G met carprofen.</li>
	</ol></li>
	<li>Steriele zoutoplossing<ol><li>Bereid een spuit van 5 ml met een naald van 26 g met steriele zoutoplossing.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Laser instellen
<ol><li>Behandel de glasvezelkabel voorzichtig en sluit deze aan op de laserbesturingskast en de laseradapter van de retinale beeldvormingsmicroscoop.</li>
	<li>Schakel de retinale microscooplamp aan.</li>
	<li>Schakel de computer in en open het beeldbewerkingsprogramma.</li>
	<li>Pas de witbalans aan door een stuk wit papier te gebruiken en dit voor het oogstuk van de muis te leggen en op Aanpassen te klikken in het beeldvormingsprogramma.</li>
	<li>Schakel de laserbesturingskast in door aan de sleutel te draaien en de instructies op het scherm van de laserbesturingskast te volgen. OPMERKING: De laser die in dit experiment wordt gebruikt, is klasse 3B en kan oogbeschadiging veroorzaken. Draag een beschermende bril bij het bedienen van de laser.</li>
	<li>Controleer het basislaservermogen.<ol><li>Gebruik een laservermogensmeter.</li>
		<li>Stel het scherm van de laserbesturingskast in op de volgende parameters: 50 mW en 2.000 ms.</li>
		<li>Schakel de laser in en plaats de vermogensmeter voor het oculair. OPMERKING: Zorg ervoor dat het microscooplicht is uitgeschakeld tijdens het testen van het basislaservermogen.</li>
		<li>Druk op het voetschakelaarpedaal om de laser te activeren.</li>
		<li>Streef ernaar dat de uitlezing van het laservermogen 13-15 mW is. OPMERKING: De uitlezing van het laservermogen bepaalt het slagingspercentage voor occlusies van retinale aderen. Als de uitlezing van het laservermogen te laag is, kunnen het vermogen en de tijd van de laserbelichting worden aangepast. Zie tabel 1 voor aanbevelingen.</li>
	</ol></li>
	<li>Pas het experimentele laservermogen aan door het scherm van de laserbesturingskast in te stellen voor de volgende parameters: 100 mW, 1.000 ms.</li>
	<li>Schakel de laser uit. OPMERKING: Voor de veiligheid en om oververhitting te voorkomen, is het het beste om de laser tussen muizen uit te houden.</li>
</ol>4. Muis staart ader injectie van rose bengal
<ol><li>Giet 300 ml water in een bekerglas van 500 ml.</li>
	<li>Verwarm het bekerglas 1 min in een magnetron.</li>
	<li>Doe gaas in het warme water in het bekerglas.</li>
	<li>Plaats de muis in een fixator.</li>
	<li>Druk het gaasje zachtjes in de muizenstaart en zoek naar de verwijde aderen. Desinfecteer de injectieplaats met een alcoholdoekje na de verwijding van het warme water.</li>
	<li>Steek de naald in de injectieplaats en trek aan de spuit om er zeker van te zijn dat u zich in de ader bevindt. Injecteer vervolgens de staartader van de muis en dien de juiste hoeveelheid toe op basis van het gewicht van het dier (37,5 mg / kg). Oefen druk uit op de injectieplaats om hematoom of bloedingen te voorkomen. Wis de site.</li>
	<li>Laat de muis los van de fixator en breng hem terug naar de kooi.</li>
	<li>Laat de roos 8 minuten circuleren voordat de anesthetica worden geïnjecteerd. OPMERKING: Dit levert in totaal 10 minuten op tussen de injectie van de roos en de laserbestraling.</li>
</ol>5. Occlusie van belangrijke aderen
<ol><li>Schakel het verwarmde muisplatform in.</li>
	<li>Voeg een druppel fenylefrine en tropicamide toe in elk oog.</li>
	<li>Injecteer 150 μL van de anesthetica, ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) IP. OPMERKING: Tijdens deze procedure kreeg de muis twee IP-injecties. Vandaar dat de zijkanten werden afgewisseld. De IP-injectie voor de anesthesie werd toegediend in het kwadrant van de rechteronderbuik en de zoutoplossing werd geïnjecteerd in het kwadrant van de linker onderbuik. Het wordt aanbevolen om vóór het injecteren aan de spuit te trekken om ervoor te zorgen dat de naald zich in de buik bevindt en niet in organen.</li>
	<li>Knijp het dier teen om de diepte van de anesthesie te bepalen en wacht tot het niet reageert.</li>
	<li>Voeg één druppel proparacaïnehydrochloride per oog toe (pijnstillend).</li>
	<li>Voeg gelzalf toe aan beide ogen.</li>
	<li>Injecteer 150 μL carprofen subcutaan tussen de oren.</li>
	<li>Plaats de muis op het platform.</li>
	<li>Pas het platform aan totdat het zicht op de retinale fundus duidelijk en gefocust is.</li>
	<li>Tel de retinale aderen en maak een foto van de fundus. OPMERKING: Retinale aderen zijn donkerder en breder dan slagaders. Aderen en slagaders wisselen elkaar af; soms kan er echter een vertakte slagader dicht bij de oogzenuw zijn en daarom twee aangrenzende slagaders.</li>
	<li>Schakel de laser in en richt op een retinale ader op ongeveer 375 μm van de optische schijf.</li>
	<li>Bestraal het vat door op de voetschakelaar te drukken en de laserstraal lichtjes te bewegen tot 100 μm. Herhaal deze stap drie keer en beweeg de laserstraal na elke puls zodat de bestraling niet op één plek wordt gericht.</li>
	<li>Herhaal bestraling op andere grote vaten om 2-3 occlusies te bereiken.</li>
</ol>6. Vaststellen van het aantal aderen afgesloten op dag 0
<ol><li>Zet de lamp uit na het bestralen van de vaten en wacht 10 minuten. OPMERKING: Blootstelling aan licht kan schade aan het netvlies en ontsteking veroorzaken; schakel de lamp uit tijdens de wachttijd om de belichting te minimaliseren7.</li>
	<li>Zet de lamp weer aan en tel het aantal afgesloten aderen.</li>
	<li>Maak een foto van de fundus.</li>
</ol>7. Nazorg
<ol><li>Injecteer 1 ml steriel zoutoplossing IP. OPMERKING: Zie de details van de IP-injectie in rubriek 5, stap 3.</li>
	<li>Voeg glijmiddel oogdruppels toe aan beide ogen.</li>
	<li>Voeg gelzalf toe aan beide ogen.</li>
	<li>Kijk naar de muis terwijl deze herstelt van de anesthesie en breng hem niet terug naar de kooi met de andere dieren totdat hij volledig is hersteld. Carprofen (5 mg/kg) kan dagelijks worden toegediend tot 2 dagen na de procedure. Indien toegepast op mensen, is pijn geen symptoom van RVO. OPMERKING: Laat de dieren niet onbeheerd achter totdat ze volledig zijn hersteld van de anesthesie.</li>
</ol>8. Beoordeling van retinaal oedeem door optische coherentietomografie (OCT)
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd op het tijdstip van interesse van de onderzoeker. De piek van retinaal oedeem voor een C57BL/6J muis is 1 dag na de RVO procedure. Dit tijdstip kan variëren, afhankelijk van de achtergrond van de muis.
<ol><li>Schakel de retinale microscooplichtdoos, de OCT-machine en het verwarmde muisplatform in.</li>
	<li>Volg de dag na de occlusie stap 5.2 tot en met 5.7 om het dier voor te bereiden.</li>
	<li>Open de softwareprogramma's imaging en OCT.</li>
	<li>Stel in het OCT-programma de nudge in op 5.</li>
	<li>Neem OCT op 75 μm distal van de brandwond of 4 klikken.</li>
	<li>Maak OCT-beelden bij vier kwadranten van het netvlies.</li>
	<li>Analyseer de OCT-afbeeldingen met behulp van traceersoftware.</li>
	<li>Vergelijk de retinale dikte van voorbestraalde metingen met 1 dag na RVO of op het tijdstip van interesse. OPMERKING: Houd bij het analyseren van de gegevens rekening met het aantal bestraalde aderen, omdat dit de ontwikkeling van retinaal oedeem kan beïnvloeden. Dieren worden vervolgens geëuthanaseerd door het toedienen van verdoving gevolgd door perfusie niet-overlevingsoperaties.</li>
</ol>

<ol><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Ehlers, J. P., Fekrat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vein+occlusion%3A+beyond+the+acute+event%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal vein occlusion: beyond the acute event.</a> Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).</li>
<li>Iftikhar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peak+vision+in+retinal+vein+occlusion+patients+treated+for+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema.</a> American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li>
<li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinal+morphology+alterations+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+a+mouse+model+of+retinal+branch+and+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion.</a> PLoS One. 10 (3), 0119046(2015).</li>
<li>Fuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+approach+in+newly+established+retinal+vein+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model.</a> Scientific Reports. 7, 43509(2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+and+chemokines+in+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration.</a> Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Nicholson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+disorganization+of+the+retinal+inner+layers+in+detecting+macular+capillary+non-perfusion+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).</li>
<li>Moein, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+angiography+to+detect+macular+capillary+ischemia+in+patients+with+inner+retinal+changes+after+resolved+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema.</a> Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).</li>
<li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+model+of+central+retinal+vascular+occlusion+and+the+therapeutic+potential+of+the+adrenomedullin-receptor+activity-modifying+protein+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system.</a> American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).</li>
<li>Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+a+mouse+model+of+retinal+vein+occlusion+induced+by+laser+treatment+reveals+a+predominant+inflammatory+and+tissue+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response.</a> PLoS One. 13 (3), 0191338(2018).</li>
<li>Drechsler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intravitreal+anti-vascular+endothelial+growth+factor+treatment+on+the+retinal+gene+expression+in+acute+experimental+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion.</a> Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).</li>
<li>Genevois, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+remodeling+after+occlusion-recanalization+of+a+branch+retinal+vein+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).</li>
<li>Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of retinal vein occlusion.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (14), 6175-6192 (2017).</li>
<li>Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+multimodal+photoacoustic+microscopy+and+optical+coherence+tomography+image-guided+laser+induced+branch+retinal+vein+occlusion+in+living+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10560(2019).</li>
<li>Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rose+Bengal+sensitized+bilayered+photoanode+of+nano-crystalline+TiO2-CeO2+for+dye-sensitized+solar+cell+application%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Nanoscience%22%5BJournal%5D)">Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application.</a> Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).</li>
<li>Emmart, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+absorption+spectra+of+fluorescein%2C+fluorescein+derivatives+and+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).</li>
<li>Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fading+spectrophotometric+method+for+the+determination+of+polyvinylpyrrolidone+with+eosin+Y%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y.</a> Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).</li>
<li>MacDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCs+of+RVO%3A+a+review+of+retinal+venous+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Optometry%22%5BJournal%5D)">The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion.</a> Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+weight+gain+modifies+severity+and+functional+outcome+of+oxygen-induced+proliferative+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy.</a> American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).</li>
<li>LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sensitivity+to+light-induced+photoreceptor+degeneration+in+albino+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice.</a> Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).</li>
<li>Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+albino+retina%3A+an+abnormality+that+provides+insight+into+normal+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development.</a> Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).</li>
<li>Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Albinism.</a> Survey of Ophthalmology. 30 (2), 75-101 (1985).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+weight+gain+modifies+severity+and+functional+outcome+of+oxygen-induced+proliferative+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy.</a> American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het muis RVO-model biedt een manier om RVO-pathologie verder te begrijpen en potentiële therapieën te testen. Hoewel het muis RVO-model veel wordt gebruikt in het veld, is er behoefte aan een actueel gedetailleerd protocol van het model dat de variabiliteit aanpakt en de optimalisatie van het model beschrijft. Hier bieden we een gids met voorbeelden uit ervaring over wat kan worden gewijzigd om de meest consistente resultaten te krijgen voor een cohort van proefdieren en betrouwbare gegevens te verstrekken.
<p class=...

Retinale ader occlusie (RVO) is een veel voorkomende retinale vaatziekte die in 2015 wereldwijd ongeveer 28 miljoen mensen trof1. RVO leidt tot achteruitgang en verlies van het gezichtsvermogen bij werkende volwassenen en ouderen, wat neerkomt op een voortdurende gezichtsbedreigende ziekte die naar schatting in de loop van het nabije decennium zal toenemen. Enkele van de verschillende pathologieën van RVO omvatten hypoxisch-ischemisch letsel, retinaal oedeem, ontsteking en neuronaal verlies2. Momenteel is de eerste behandelingslijn voor deze aandoening door de toediening van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) -remmers. Hoewel anti-VEGF-behandeling heeft geholpen bij het verbeteren van retinaal oedeem, worden veel patiënten nog steeds geconfronteerd met een achteruitgang van het gezichtsvermogen3. Om de pathofysiologie van deze ziekte verder te begrijpen en om potentiële nieuwe behandelingslijnen te testen, is het nodig om een functioneel en gedetailleerd RVO-muismodelprotocol voor verschillende muizenstammen samen te stellen.
Er zijn muismodellen ontwikkeld die hetzelfde laserapparaat implementeren dat wordt gebruikt bij menselijke patiënten, in combinatie met een beeldvormingssysteem dat is geschaald naar de juiste grootte voor een muis. Dit muismodel van RVO werd voor het eerst gerapporteerd in 20074 en verder vastgesteld door Ebneter en anderen 4,5. Uiteindelijk werd het model geoptimaliseerd door Fuma et al. om belangrijke klinische manifestaties van RVO te repliceren, zoals retinaal oedeem6. Sinds het model voor het eerst werd gerapporteerd, hebben veel studies het gebruikt met behulp van de toediening van een fotosensitizerkleurstof gevolgd door fotocoagulatie van belangrijke retinale aderen met een laser. De hoeveelheid en het type kleurstof die wordt toegediend, het laservermogen en de tijd van blootstelling variëren echter aanzienlijk tussen studies die deze methode hebben gebruikt. Deze verschillen kunnen vaak leiden tot een verhoogde variabiliteit in het model, waardoor het moeilijk te repliceren is. Tot op heden zijn er geen gepubliceerde studies met specifieke details over mogelijke wegen voor de optimalisatie ervan.
Dit rapport presenteert een gedetailleerde methodologie van het RVO-muismodel in de C57BL/6J-stam en een tamoxifen-induceerbare endotheel caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stam met een C57BL/6J achtergrond en van belang voor RVO pathologie als referentiestam voor een genetisch gemodificeerde muis. Een eerdere studie had aangetoond dat niet-apoptotische activering van endotheel caspase-9 retinaal oedeem aanwakkert en neuronale dood bevordert8. Ervaring met het gebruik van deze stam heeft geholpen bij het bepalen en inzichtelijk maken van mogelijke aanpassingen om het RVO-muismodel, dat toepasbaar kan zijn op andere genetisch gemodificeerde stammen, aan te passen.

<table><tbody><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td>NADA #141-199</td><td>bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Corn Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Patch Cable</td><td>Thor Labs</td><td>M14L02</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal</td><td>Alcon</td><td>00658 06401</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Lasercheck</td><td>Coherent</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrine</td><td>Akorn</td><td>NDCL174478-201-15</td><td></td></tr><tr><td>Phoneix Micron IV with Meridian,&nbsp; StreamPix, and OCT modules</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride</td><td>Akorn</td><td>NDC: 17478-263-12</td><td>bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Refresh</td><td>Allergan</td><td>94170</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330000-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-5G</td><td>lichtgevoelig</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Akorn</td><td>NDC: 174478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

optimalisatie van het retinal vein occlusion mouse model om variabiliteit te beperken

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Muismodellen van retinale ader occlusie (RVO) worden vaak gebruikt in de oogheelkunde om hypoxisch-ischemisch letsel in het neurale netvlies te bestuderen. In dit rapport wordt een gedetailleerde methode gegeven die wijst op kritieke stappen met aanbevelingen voor optimalisatie om consistent succesvolle occlusiepercentages te bereiken bij verschillende genetisch gemodificeerde muizenstammen. Het RVO-muismodel bestaat voornamelijk uit de intraveneuze toediening van een fotosensitizerkleurstof gevolgd door laserfotocoagulatie met behulp van een retinale beeldvormingsmicroscoop die is bevestigd aan een oogheelkundige geleide laser. Drie variabelen werden geïdentificeerd als determinanten van occlusieconsistentie. Door de wachttijd na toediening van rose bengalen aan te passen en de baseline en experimentele laseroutput in evenwicht te brengen, kan de variabiliteit tussen experimenten worden beperkt en een hoger slagingspercentage van occlusies worden bereikt. Deze methode kan worden gebruikt om retinale ziekten te bestuderen die worden gekenmerkt door retinaal oedeem en hypoxisch-ischemisch letsel. Bovendien, omdat dit model vasculair letsel induceert, kan het ook worden toegepast om de neurovasculatuur, neuronale dood en ontsteking te bestuderen.

Het RVO-muismodel heeft tot doel met succes occlusies in de retinale aderen te bereiken, wat leidt tot hypoxisch-ischemisch letsel, afbraak van de retinale bloedbarrière, neuronale dood en retinaal oedeem8. Figuur 1 toont een tijdlijn van stappen om reproduceerbaarheid te garanderen, een schema van het experimentele ontwerp en schetst stappen die verder kunnen worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de experimentele vragen. De drie belangrijkste stappen die kunnen wor...

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor retinale ader occlusie met behulp van rose bengal en een lasergeleid retinaal beeldvormingscoopsysteem met aanbevelingen om de reproduceerbaarheid ervan in genetisch gemodificeerde stammen te maximaliseren.

Optimalisatie van het Retinal Vein Occlusion Mouse Model om variabiliteit te beperken

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Het protocol biedt een model om mechanismen van vasculair letsel en de daaropvolgende ontwikkeling van oedeem op een niet-invasieve manier te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u de blessure in de loop van de tijd live kunt volgen zonder chirurgische ingreep. Dit biedt mogelijkheden om behandelingen efficiënter te testen.Het kan een uitdaging zijn om te leren hoe je de juiste staartader kunt uitvoeren en het dier op de juiste manier in het platform kunt onderbrengen. Voor beide technieken raad ik aan om geduldig te zijn en het rustig aan te doen. Om te beginnen, hanteert u voorzichtig de glasvezelkabel en sluit u deze aan op de laserbesturingskast en de laseradapter van de retinale beeldvormingsmicroscoop en schakelt u vervolgens de retinale beeldvormingsmicroscooplampdoos in.Schakel de computer in en open het beeldbewerkingsprogramma. Plaats een stuk wit papier voor het microscoop oculair en pas de witbalans aan door te klikken op Aanpassen in het beeldvormingsprogramma. Schakel de laserbesturingskast in door aan de sleutel te draaien en de instructies op het scherm van de laserbesturingskast te volgen.Om het basislaservermogen te controleren, stelt u de laserbesturingskast in op 50 milliwatt en 2.000 milliseconden. Schakel vervolgens de laser in en plaats de vermogensmeter voor het oculair. Druk op het voetschakelaarpedaal om de laser te activeren, waarbij u erop gericht bent dat de uitlezing van het laservermogen 13 tot 15 milliwatt is.Pas vervolgens met behulp van het scherm van de laserbesturingskast het experimentele laservermogen aan op 100 milliwatt en 1.000 milliseconden en schakel de laser uit. Giet 300 milliliter water in een bekerglas van 500 milliliter en verwarm het bekerglas gedurende één minuut in een magnetron. Leg dan een gaasje in het warme water.Plaats vervolgens een twee maanden oude mannelijke muis in een fixator. Druk het warme gaas voorzichtig in de muizenstaart en zoek naar de verwijde aderen. Injecteer met behulp van een naald van 26 gauge de juiste hoeveelheid roos bengalen op basis van het gewicht van het dier en oefen druk uit op de injectieplaats om hematoom of bloedingen te voorkomen voordat de site wordt afgeveegd.Laat de muis vervolgens los van de fixator en breng hem terug naar de kooi. Laat de roos acht minuten circuleren voordat de anesthetica worden ingebracht. Schakel het verwarmde muisplatform in.Voeg vervolgens een druppel fenylefrine en tropicamide toe in elk oog van de muis. Voeg na bevestiging van de anesthesie één druppel proparacaïnehydrochloride per oog toe en voeg vervolgens oogzalf toe aan beide ogen. Injecteer vervolgens 150 microliter carprofen subcutaan tussen de oren.Plaats vervolgens de muis op het platform en pas het platform aan totdat het zicht op de retinale fundus duidelijk en gefocust is. Tel de retinale aderen en maak een foto van de fundus. Schakel vervolgens de laser in en richt op een retinale ader op ongeveer 375 micrometer van de optische schijf.Bestraal het vat door op de voetschakelaar te drukken en de laserstraal lichtjes te bewegen tot 100 micrometer. Herhaal deze stap drie keer en beweeg de laserstraal na elke puls zodat de bestraling niet op één plek wordt gericht. Herhaal de bestraling op andere grote vaten om twee tot drie occlusies te bereiken.Na het bestralen van de vaten, zet de lamp uit en wacht 10 minuten. Doe dan de lamp weer aan, tel het aantal afgesloten aderen en maak een foto van de fundus. Voeg na beeldacquisitie en zoutoplossinginjectie glijmiddeloogdruppels en gelzalf toe aan beide ogen.Kijk hoe de muis herstelt van de anesthesie en breng hem alleen terug naar de kooi met andere dieren als hij volledig hersteld is. Het aantal occlusies dat onmiddellijk na laserbestraling werd bereikt, verschilde niet tussen dieren die 10 en 20 minuten na toediening van rose bengal werden gelaserd. Het aantal occlusies dat tot één dag na retinale ader occlusie aanhield, nam significant af bij dieren die 20 minuten na toediening van rose bengalen werden gelaserd, onafhankelijk van het genotype.Zonder het experimentele vermogen van 100 milliwatt te wijzigen, resulteerde een laag basislaservermogen van 11,5 milliwatt in geen occlusies. Daarentegen resulteerde een baseline laseroutput van 13,5 milliwatt in succesvolle occlusies. Vier hoofdtypen occlusies treden op na laserfotocoagulatie: volledig afgesloten vaten, gedeeltelijk afgesloten vaten, gedeeltelijk gereperfuseerde en volledig gereperfuseerde vaten.De bestraalde vasculatuur van Tamoxifen-induceerbare endotheelcel Casp9 knock-out muizen brachten meer tijd door in gedeeltelijk gereperfuseerde en gedeeltelijk afgesloten toestanden dan die van C57 Black 6-muizen, die meer tijd doorbrachten in volledig afgesloten toestanden. De occlusietoestand van de bloedvaten verandert snel binnen de eerste 10 minuten na laserfotocoagulatie en vlamvormige bloedingen worden 24 uur na het letsel waargenomen. Verschillende oogheelkundige pathologieën traden op na retinale ader occlusie.Het niveau van retinaal oedeem na retinale ader occlusie kan worden gekwantificeerd in de gewonde ogen met behulp van optische coherentie tomografie beelden. De toestand van neuronale lagen kan ook worden bepaald door de desorganisatie van retinale binnenste lagen te beoordelen. Een voorbeeld van een optische coherentie tomografie afbeelding met de bijbehorende labels voor elke laag wordt hier getoond.Het meten van het basislaservermogen is belangrijk. Deze uitlezing zal een grote invloed hebben op het succes van de occlusies en kan worden geoptimaliseerd. Aanvullende methoden zoals OCT, ERG en Optiger kunnen worden uitgevoerd.Dit zal helpen bij het aanpakken van de effecten van neurovasculair letsel op de neuronale integriteit van het netvlies en de visuele padfunctie. Deze techniek maakt de weg vrij om de moleculaire routes die neurovasculaire ziekten veroorzaken te ondervragen en levert, door individuele dieren in de loop van de tijd te volgen, gegevens op die gemakkelijker kunnen worden vertaald naar menselijke ziekten.

optimization-retinal-vein-occlusion-mouse-model-to-limit

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het knaagdier netvlies is lang erkend als een toegankelijke venster naar de hersenen. In dit technisch document bieden we een protocol dat het muismodel van zuurstof geïnduceerde retinopathie van de mechanismen die leiden tot het falen van vasculaire regeneratie binnen het centrale zenuwstelsel na ischemische schade te bestuderen in dienst heeft. Het beschreven systeem kan ook worden ingezet om strategieën te ontwikkelen om hergroei van functionele bloedvaten te bevorderen binnen het netvlies...

Beoordeling van de Vasculaire Regeneratie in het CZS met de muis Retina

Hier presenteren we het protocol voor laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) bij muizen, een experimenteel model dat de vasculaire kenmerken van neovasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) nastreeft. Eenmaal onder de knie, kan het op betrouwbare en effectieve wijze CNV induceren als modelsysteem om verschillende experimentele maatregelen te testen.

Een muismodel voor Laser-geïnduceerde Choroïdale Neovascularisatie

Hier tonen we een nieuwe benadering voor het gebruik van hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (HR-SD-OCT) helpen levering van gen-therapie-agenten in de subretinal ruimte, beoordelen van haar areal dekking en karakteriseren fotoreceptor vitaliteit.

Met resolutie muis optische coherentie tomografie steun intraoculaire injectie in het netvlies gentherapie onderzoek

Hier presenteren we het nut van longitudinale in vivo imaging in de follow-up van de morfologische veranderingen van laser-geïnduceerde choroidal neovascularization in muizen.

In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel

Zuurstofgeïnduceerde retinopathie (OIR) kan worden gebruikt om ischemische netvliesaandoeningen zoals retinopathie van prematuriteit en proliferatieve diabetische retinopathie te modelleren en om te dienen als model voor proof-of-concept studies bij het evalueren van antiangiogene geneesmiddelen voor neovasculaire ziekten. OIR induceert robuuste en reproduceerbare neovascularisatie in het netvlies die kan worden gekwantificeerd.

Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.

Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

Hier beschrijven we een in vivo beeldvormingstechniek met behulp van optische coherentietomografie om de diagnose en kwantitatieve meting van retinopathie bij muizen te vergemakkelijken.

Toepassing van optische coherentietomografie op een muismodel van retinopathie

Hier presenteren we drie data-analyseprotocollen voor fluoresceïneangiografie (FA) en optische coherentietomografie (OCT) beelden in de studie van Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Vasculaire letseluitlezingen in het netvlies van muizen om de reproduceerbaarheid te bevorderen

Subretinale injecties zijn een onmisbare techniek voor de preklinische ontwikkeling van therapieën voor fotoreceptor- en RPE-ziekten. We beschrijven een geoptimaliseerde transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen die de intraoperatieve slagingspercentages verbetert en schade aan het netvlies minimaliseert.

Geoptimaliseerde minimaal invasieve transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen

Leer een geoptimaliseerd protocol voor retinale veneuze occlusie bij muizen met rose bengale en laserbeeldvorming. Deze methode maakt real-time monitoring van vasculair letsel en oedeem mogelijk zonder chirurgische ingreep.

Optimalisatie van het Retinal Vein Occlusion Mouse Model om variabiliteit te beperken

Meer video's verkennen