Optimalisatie van het Retinal Vein Occlusion Mouse Model om variabiliteit te beperken
6 augustus 2021
Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor retinale ader occlusie met behulp van rose bengal en een lasergeleid retinaal beeldvormingscoopsysteem met aanbevelingen om de reproduceerbaarheid ervan in genetisch gemodificeerde stammen te maximaliseren.
Het protocol biedt een model om mechanismen van vasculair letsel en de daaropvolgende ontwikkeling van oedeem op een niet-invasieve manier te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u de blessure in de loop van de tijd live kunt volgen zonder chirurgische ingreep. Dit biedt mogelijkheden om behandelingen efficiënter te testen.
Het kan een uitdaging zijn om te leren hoe je de juiste staartader kunt uitvoeren en het dier op de juiste manier in het platform kunt onderbrengen. Voor beide technieken raad ik aan om geduldig te zijn en het rustig aan te doen. Om te beginnen, hanteert u voorzichtig de glasvezelkabel en sluit u deze aan op de laserbesturingskast en de laseradapter van de retinale beeldvormingsmicroscoop en schakelt u vervolgens de retinale beeldvormingsmicroscooplampdoos in.
Schakel de computer in en open het beeldbewerkingsprogramma. Plaats een stuk wit papier voor het microscoop oculair en pas de witbalans aan door te klikken op Aanpassen in het beeldvormingsprogramma. Schakel de laserbesturingskast in door aan de sleutel te draaien en de instructies op het scherm van de laserbesturingskast te volgen.
Om het basislaservermogen te controleren, stelt u de laserbesturingskast in op 50 milliwatt en 2.000 milliseconden. Schakel vervolgens de laser in en plaats de vermogensmeter voor het oculair. Druk op het voetschakelaarpedaal om de laser te activeren, waarbij u erop gericht bent dat de uitlezing van het laservermogen 13 tot 15 milliwatt is.
Pas vervolgens met behulp van het scherm van de laserbesturingskast het experimentele laservermogen aan op 100 milliwatt en 1.000 milliseconden en schakel de laser uit. Giet 300 milliliter water in een bekerglas van 500 milliliter en verwarm het bekerglas gedurende één minuut in een magnetron. Leg dan een gaasje in het warme water.
Plaats vervolgens een twee maanden oude mannelijke muis in een fixator. Druk het warme gaas voorzichtig in de muizenstaart en zoek naar de verwijde aderen. Injecteer met behulp van een naald van 26 gauge de juiste hoeveelheid roos bengalen op basis van het gewicht van het dier en oefen druk uit op de injectieplaats om hematoom of bloedingen te voorkomen voordat de site wordt afgeveegd.
Laat de muis vervolgens los van de fixator en breng hem terug naar de kooi. Laat de roos acht minuten circuleren voordat de anesthetica worden ingebracht. Schakel het verwarmde muisplatform in.
Voeg vervolgens een druppel fenylefrine en tropicamide toe in elk oog van de muis. Voeg na bevestiging van de anesthesie één druppel proparacaïnehydrochloride per oog toe en voeg vervolgens oogzalf toe aan beide ogen. Injecteer vervolgens 150 microliter carprofen subcutaan tussen de oren.
Plaats vervolgens de muis op het platform en pas het platform aan totdat het zicht op de retinale fundus duidelijk en gefocust is. Tel de retinale aderen en maak een foto van de fundus. Schakel vervolgens de laser in en richt op een retinale ader op ongeveer 375 micrometer van de optische schijf.
Bestraal het vat door op de voetschakelaar te drukken en de laserstraal lichtjes te bewegen tot 100 micrometer. Herhaal deze stap drie keer en beweeg de laserstraal na elke puls zodat de bestraling niet op één plek wordt gericht. Herhaal de bestraling op andere grote vaten om twee tot drie occlusies te bereiken.
Na het bestralen van de vaten, zet de lamp uit en wacht 10 minuten. Doe dan de lamp weer aan, tel het aantal afgesloten aderen en maak een foto van de fundus. Voeg na beeldacquisitie en zoutoplossinginjectie glijmiddeloogdruppels en gelzalf toe aan beide ogen.
Kijk hoe de muis herstelt van de anesthesie en breng hem alleen terug naar de kooi met andere dieren als hij volledig hersteld is. Het aantal occlusies dat onmiddellijk na laserbestraling werd bereikt, verschilde niet tussen dieren die 10 en 20 minuten na toediening van rose bengal werden gelaserd. Het aantal occlusies dat tot één dag na retinale ader occlusie aanhield, nam significant af bij dieren die 20 minuten na toediening van rose bengalen werden gelaserd, onafhankelijk van het genotype.
Zonder het experimentele vermogen van 100 milliwatt te wijzigen, resulteerde een laag basislaservermogen van 11,5 milliwatt in geen occlusies. Daarentegen resulteerde een baseline laseroutput van 13,5 milliwatt in succesvolle occlusies. Vier hoofdtypen occlusies treden op na laserfotocoagulatie: volledig afgesloten vaten, gedeeltelijk afgesloten vaten, gedeeltelijk gereperfuseerde en volledig gereperfuseerde vaten.
De bestraalde vasculatuur van Tamoxifen-induceerbare endotheelcel Casp9 knock-out muizen brachten meer tijd door in gedeeltelijk gereperfuseerde en gedeeltelijk afgesloten toestanden dan die van C57 Black 6-muizen, die meer tijd doorbrachten in volledig afgesloten toestanden. De occlusietoestand van de bloedvaten verandert snel binnen de eerste 10 minuten na laserfotocoagulatie en vlamvormige bloedingen worden 24 uur na het letsel waargenomen. Verschillende oogheelkundige pathologieën traden op na retinale ader occlusie.
Het niveau van retinaal oedeem na retinale ader occlusie kan worden gekwantificeerd in de gewonde ogen met behulp van optische coherentie tomografie beelden. De toestand van neuronale lagen kan ook worden bepaald door de desorganisatie van retinale binnenste lagen te beoordelen. Een voorbeeld van een optische coherentie tomografie afbeelding met de bijbehorende labels voor elke laag wordt hier getoond.
Het meten van het basislaservermogen is belangrijk. Deze uitlezing zal een grote invloed hebben op het succes van de occlusies en kan worden geoptimaliseerd. Aanvullende methoden zoals OCT, ERG en Optiger kunnen worden uitgevoerd.
Dit zal helpen bij het aanpakken van de effecten van neurovasculair letsel op de neuronale integriteit van het netvlies en de visuele padfunctie. Deze techniek maakt de weg vrij om de moleculaire routes die neurovasculaire ziekten veroorzaken te ondervragen en levert, door individuele dieren in de loop van de tijd te volgen, gegevens op die gemakkelijker kunnen worden vertaald naar menselijke ziekten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor retinale vene-occlusie met behulp van rose bengaal en een lasergestuurd retinaal beeldvormingsmicroscoopsysteem. Het model faciliteert het onderzoek naar mechanismen van vasculaire beschadiging en de ontwikkeling van oedeem in real-time zonder chirurgische interventie, waardoor het testen van behandelingen efficiënter verloopt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oogheelkunde
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Modellen van retina-aderocclusie zijn belangrijk voor het bestuderen van vasculaire letsels.
- Rosebengal dient als een essentieel middel voor het verbeteren van de beeldvorming en de effectiviteit van de occlusie.
- De methode maakt live observatie van retina-schade en herstel mogelijk.
- Er wordt nadruk gelegd op een verbeterde mogelijkheid om retinale reacties te kwantificeren met technieken zoals optische coherentietomografie (OCT).
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een reproduceerbaar model voor het onderzoeken van retinale vasculaire beschadiging.
- Het meten en observeren van veranderingen in de toestand van de retinale bloedvaten na laser-geïnduceerde occlusie.
- Het vergroten van de kennis over de effecten van neurovasculaire beschadiging op de retinale functie.
Gebruikte methoden
- Het belangrijkste platform dat wordt gebruikt, is een lasergestuurde microscoop voor retina-beeldvorming.
- Het biologische model bestaat uit genetisch gemodificeerde muizen die worden gebruikt om vasculaire occlusies te beoordelen.
- Cruciale stappen omvatten de beeldacquisitie, de instellingen voor de laserbesturing en de juiste hantering van rosebengal.
- Metingen van het laservermogen en de juiste timing na toediening van rosebengal werden genoteerd.
- Protocollen voor anesthesie en herstelmonitoring werden gespecificeerd om het dierenwelzijn te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Het tijdstip van de laserapplicatie na toediening van rose bengal beïnvloedde het aantal blijvende occlusies.
- Er werden verschillende occlusiestatussen waargenomen, wat belangrijke inzichten verschaft in hemorragische reacties na letsel.
- Belangrijke moleculaire veranderingen werden gekwantificeerd, wat de effectiviteit van het model aantoont voor het bestuderen van vasculaire herstelmechanismen.
- OCT-beeldvorming werd gebruikt om retinaal oedeem en desorganisatie van de binnenste laag te beoordelen.
Conclusies
- Dit protocol maakt een gedetailleerd onderzoek naar mechanismen van neurovasculaire ziekten mogelijk.
- De mogelijkheid om retinale veranderingen in de loop van de tijd te monitoren, zal helpen bij het vertalen van bevindingen naar menselijke aandoeningen.
- Over het algemeen verbetert de studie het begrip van vasculaire letsels en het potentieel voor therapeutische interventies bij retinale ziekten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit geoptimaliseerde model voor retinale vene-occlusie pakt de variabiliteit in preklinische oogheelkundige studies aan door kritische procedurele parameters te standaardiseren. Door de basislaseroutput en de timing na toediening van de kleurstof te controleren, verbetert deze methode de reproduceerbaarheid van de inductie van vasculaire beschadiging bij genetisch diverse muizenstammen. Dit maakt een betrouwbaardere evaluatie mogelijk van neurovasculaire therapeutica die gericht zijn op retinaal oedeem en hypoxicisch-ischemische beschadigingsmechanismen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om vasculaire letselpaden in retina-ziektemodellen te onderzoeken met een gecontroleerde consistentie van de occlusie.
- Operationele waarde: Vermindert experimentele ruis als gevolg van variabele laser-timing en vermogensinstellingen, waardoor de gevoeligheid van de assay wordt verbeterd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd model voor vasculaire beschadiging om de effecten van verbindingen op retinaal oedeem en reperfusiedynamiek te evalueren.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbare eindpuntmeting via optische coherentietomografie voor kwantitatieve screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert de progressie van neurovasculaire beschadiging, inclusief bloedingen en desorganisatie van de neuronale laag, die relevant zijn voor menselijke retina-pathologieën.
- Operationele waarde: Faciliteert longitudinale monitoring van vasculaire herstelmechanismen in hetzelfde dier over een bepaalde periode.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie tot preklinische efficiëntietests, door een kwantificeerbaar model van retinaire vasculaire beschadiging te bieden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypotheseonderzoek naar moleculaire drijvers van vasculaire lekkage en inflammatoire responsen na occlusie.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde beoordeling van therapeutische kandidaten mogelijk wat betreft de persistentie van de occlusie en de vermindering van oedeem.
- Analytica: Genereert kwantitatieve OCT-afgeleide metrieken over de retinale dikte en de integriteit van de lagen voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Modelleert mens-relevante neurovasculaire letselfenotypen, waaronder vlamvormige hemorragieën en disruptie van de binnenste retina.
- Zakelijke herbruikbaarheid: Aanpasbaar voor verschillende muizenstammen en genetische achtergronden voor consistente campagnes voor targetvalidatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellende vertrouwen bij doelvalidatie door biologische variabiliteit in letselmodellen te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de timingparameters van laser en kleurstof om de reproduceerbaarheid tussen laboratoria te verbeteren.
- Strategische waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van go/no-go-beslissingen door fout-negatieven als gevolg van inconsistente modelpenetrantie te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neurovasculaire kandidaten mogelijk op basis van reproduceerbare resultaten van oedeem en reperfusie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische injecties in de staartvene en retinale beeldvormingsmicroscopie.
- Afhankelijk van gekalibreerde lasersystemen met instelbare basislijn- en experimentele vermogensinstellingen.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor dierbehandeling en anesthesie om fysiologische confounders te minimaliseren.
- Houd rekening met stam-specifieke vasculaire reacties bij het vergelijken van de duurzaamheid van occlusies over verschillende genotypen.
- Beperkt door de leercurve bij het bereiken van een consistente veneuze canulatie en precisie bij het laserdoelwit.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Laser Setup
2:05
Mouse Tail Vein Injection of Rose Bengal
2:54
Occlusion of Major Veins
4:07
Establishing the Number of Veins Occluded at Day 0 and Aftercare
4:40
Results: Analysis of Types and Timelines of Photo-Occlusion, Baseline and Experimental Laser Output Measurement, Ophthalmic Pathologies, and Quantification of OCT Images
6:37
Conclusion
