Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Ons onderzoeksteam ontwikkelt technologieën en protocollen voor cryo-elektronenmicroscopie en cryo-elektronentomografie. We hebben protocollen ontwikkeld voor het micropatriëren van TEM-rasters om celgroei en positionering voor cryo-ET-experimenten te sturen. Hele-cel cryo-elektronentomografie wordt gebruikt om resolutiestructuren op nanometerniveau van macromoleculaire complexen te produceren in cellen die bewaard zijn gebleven in een inheemse bevroren gehydrateerde toestand.

Micropatterning kan de doorvoer van cryo-ET voor hele cellen, cryo-correlatieve lichtelektronenmicroscopie en cryo-gerichte ionenbundelfreesexperimenten verhogen. Het aantal en de verdeling van cellen op EM-rasters zijn cruciaal voor cryo-ET-studies met hele cellen. Dit protocol biedt een snelle, reproduceerbare en breed aanpasbare methode om celgroei op EM-rasters te sturen door middel van micropatterning.

De onderzoeker moet zich comfortabel voelen bij het gebruik van pipetten, pincetten, basiscelkweektechnieken en fluorescentie- en transmissie-elektronenmicroscopen. Gebruik bij het voor de eerste keer patroonvorming een bekende celtype- en ECM-combinatie en test ze op coverslips of MatTek-schotels. Leden van het onderzoeksteam die betrokken zijn bij deze protocolontwikkeling zijn:Dr.

Brian Sibert, Mr.Joseph Kim en Dr.Jae Yang. Breng om te beginnen de roosters over naar een netvoorbereidingshouder en gloei de koolstof van de roosters naar boven. Breng vervolgens de roosters met de koolstofzijde over naar een schone glazen schuif of afdekplaat met ten minste één centimeter afstand tussen de roosters.

Pipetteer 10 microliter van 0,05 poly-L-lysine op elk rooster en incubeer de roosters in een vochtige kamer gedurende ten minste 30 minuten. Was na incubatie elk rooster driemaal met 15 microliter van 0,1 molaire HEPES bij pH 8,5. Incubeer het rooster in elke wasbeurt gedurende 30 seconden en verwijder vervolgens het grootste deel van de vloeistof van het rooster met een pipet zonder het rooster te laten drogen.

Laat na de laatste wasbeurt elk rooster in 15 microliter van 0,1 kies HEPES. Bereid vervolgens de PEG-SVA-oplossing voor en vervang de HEPES-oplossing onmiddellijk op de roosters door 10 microliter van de PEG-SVA-oplossing en incubeer de roosters vervolgens gedurende ten minste één uur in een vochtige kamer. Was na incubatie elk rooster drie keer met 15 microliter steriel water en incubeer het rooster in elke was gedurende 30 seconden.

Laat na de laatste wasbeurt elk rooster in 15 microliter water staan. Plaats een druppel water van één microliter op het midden van een nieuwe schone afdekplaat en breng vervolgens voorzichtig het rooster over van de waterdruppel van 15 microliter naar de druppel op de nieuwe afdekplaat met de koolstofzijde naar boven. Plaats vervolgens voorzichtig het PDMS-stencil over het raster om het raster gecentreerd te houden en het stencilcontact met de koolstoffolie van het raster tot een minimum te beperken.

Voeg vervolgens een microliter PLPP-gel toe aan het rooster en pipetteer voorzichtig om te mengen. Verplaats de coverslip met het rooster naar een donkere locatie om te drogen. De gel droogt in 15 tot 30 minuten.

Voor micropatterning opent u de software met een live Brightfield-weergave vanaf de microscoop. Als u een nieuwe sjabloon wilt ontwerpen voor een eerste uitvoering, selecteert u ROI toevoegen en kiest u een cirkel van 3.000 micrometer. Plaats de ROI van de cirkel over het raster met behulp van de Brightfield-afbeelding op het scherm als leidraad en druk vervolgens op Vergrendelen om de ROI te beveiligen.

Nadat u de ROI op zijn plaats hebt vergrendeld, selecteert u Patroon toevoegen en kiest u het juiste patroon. Genereer met behulp van de replicatieopties kopieën van het initiële patroon om een vierkant gebied van acht bij acht rasters te maken. Pas de afstand en hoek zo nodig aan om de patronen uit te lijnen met de rastervierkanten.

Plaats het patroon in een hoek van het raster. Dupliceer vervolgens het patroon en plaats een kopie in elk van de vier hoeken van het raster en verplaats de microscooptrap indien nodig voor elk gebied. Gebruik de replicatieopties om een vierkant gebied van acht bij acht rasters te wijzigen in een vierkant gebied van twee bij acht rasters dat aan beide zijden van het midden moet worden geplaatst.

Laat de middelste vier rastervierkanten ongeparfumeerd. Pas voor elk patroon indien nodig de totale dosis aan. 30 millijoules per vierkante millimeter is een goed uitgangspunt.

Herhaal onder Expertopties het aanpassen van de hoek, positie, ruimte tussen en verhouding van het patroon om de uitlijning van het patroon met de rastervierkanten te verfijnen. Verplaats de microscooptrap om het rastergebied in het Brightfield-display te wijzigen. Zodra de sjabloon en patronen zijn gepositioneerd, schakelt u op één na alle regio's in het actievenster van de software uit.

Gebruik de microscoopfase om naar dat gebied te navigeren en concentreer je op de koolstoffolie. Klik op het oogbolpictogram in het actiepaneel om de patroonoverlayweergave uit te schakelen. Zodra het raster scherp is, sluit u de Brightfield-sluiter en drukt u op het pictogram Afspelen in de rechterbenedenhoek van de software om het patroonproces te starten, dat live kan worden gevolgd.

Herhaal deze stap totdat alle regio's zijn gemodelleerd. Verwijder ten slotte de coverslip met het rooster uit de microscoop en voeg onmiddellijk 10 microliter steriel PBS toe aan het rooster. Verwijder na 10 minuten het stencil met een pincet, was het rooster vervolgens drie keer met 15 microliter PBS en laat elk rooster in PBS op een donkere locatie staan.

Bereid 15 microliter van de extracellulaire matrix voor elk raster, vervang vervolgens de PBS van elk raster door 15 microliter van de extracellulaire matrix en incubeer het rooster gedurende ten minste één uur in een vochtige kamer. Was na incubatie elk rooster vijf keer met 15 microliter steriel PBS zoals eerder aangetoond. Laat na de laatste wasbeurt elk rooster in PBS staan.

Detecteer met behulp van een fluorescentiemicroscoop de fluorofoor in de extracellulaire matrix om patronen te bevestigen en dat de koolstoffolie intact blijft. HeLa-cellen gezaaid op microgepatterde en ongepatterde TEM-rasters zijn zichtbaar door fluorescerende kleuring met behulp van een op calceïne AM en ethidium homodimer-1 gebaseerde cel levensvatbaarheidstest. Met behulp van een gemengde collageen en fibrinogeen extracellulaire matrix, HeLa cellen gemakkelijk hechten aan patronen over het raster.

De algemene morfologie van cellen die zich langs het patroon uitbreidden, is vergelijkbaar met die van cellen die op ongepatterde rasters zijn gegroeid. Een Brightfield-afbeelding van RSV-geïnfecteerde BEAS-2B-cellen 18 uur na het zaaien toont celadhesie en groei langs het centrale gebied van het patroon. De meeste geïnfecteerde cellen bevinden zich langs het centrale gebied met hogere dichtheid van het gradiëntpatroon.

De RSV-varianten bevinden zich dicht bij de periferie van de geïnfecteerde BEAS-2B-cellen die op microgepatterde rasters worden gekweekt. Veel RSV structurele eiwitten worden geïdentificeerd in de tomogrammen, waaronder het nucleocapside en virale fusie-eiwit. Op microgepatterde rasters kunnen Drosophila-neuronen met pan-neuronale GFP-expressie gemakkelijk worden gevolgd door lichtmicroscopie vanwege fluorescerende etikettering en hun locatie binnen de micropatronen.

Neuronen op ongepatterde rasters kunnen ook worden gevolgd via GFP-signalering door lichtmicroscopie. Het lokaliseren ervan in cryo-elektronenmicroscopie wordt echter moeilijk vanwege cellulair puin en verontreiniging door de media. Vanwege de afmetingen van het neuroncellichaam en uitgebreide neurieten, worden cryo-elektron tomografie tilt series verzameld langs dunnere gebieden van de cellen met een hogere vergroting.

Het neuronale celmembraan, mitochondriën, microtubuli, actinefilamenten, vesiculaire structuren en macromoleculen zoals ribosomen worden goed opgelost in hogere vergrotingsbeeldmontages en plakjes door het 3D-tomogram. Vergelijkbare subcellulaire kenmerken worden waargenomen van 3D-tomogrammen van niet-gepatterde neuronen. Het aanbrengen van het stencil op het rooster en het toevoegen van de PLPP-gel is de meest gevoelige stap die de patroonresultaten kan beïnvloeden en moet met voorzichtigheid worden gedaan.

Cryo-CLEM kan worden gebruikt om interessante doelen in cellen te lokaliseren voor cryo-ET-gegevensverzameling. Cryo-FIB-SEM kan worden gebruikt om cellen te verdunnen op gebieden die anders te dik zijn voor gegevensverzameling.