Name: Een high-yield streptomyces transcriptie-vertaling toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke producttoepassingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Ontdek een vereenvoudigde workflow voor celvrije transcriptie-translatie in Streptomyces venezuelae. Deze methode maakt heterologe expressie van genen met hoog GC-gehalte mogelijk en biedt een gunstige omgeving voor eiwitproductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de volgende onderzoeksondersteuning erkennen: EPSRC [EP/K038648/1] voor SJM als een PDRA met PSF; Wellcome Trust sponsorde ISSF-fellowship voor SJM met PSF aan het Imperial College London; Royal Society onderzoeksbeurs [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED award [217528/Z/19/Z] voor SJM aan de Universiteit van Kent; en Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. beurs voor KC aan de Universiteit van Kent.

OPMERKING: Zie tabel 1 en tabel 2 voor recepten voor GYM medium en agarplaat en S30A- en S30B-wasbuffers.
1. Voorbereiding van oplossingen en algemene richtsnoeren
<ol><li>Bewaar alle oplossingen, cellen (na de groei) en celextracten na bereiding op ijs, tenzij er een uitzondering wordt vermeld.</li>
	<li>Bewaar voorraden voor 1 M Mg-glutamaat, 4 M K-glutamaat, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/ml polyvinylsulfonzuur bij kamertemperatuur en alle andere voorraden bij -80 °C. Minimaliseer het aantal vries-dooicycli om chemische degradatie te voorkomen.</li>
	<li>Volg voor de bereiding van energieoplossingsvoorraden (zie tabel 3), zoals 3-PGA (vereist pH-aanpassing), de richtlijnen in het E. coli TX-TL-protocol41. OPMERKING: Alle componenten zijn volledig oplosbaar in ddH2O en worden als aliquots bewaard in de -80 °C vriezer.</li>
	<li>Ontdooi individuele voorraden of energieoplossingen (later beschreven) op ijs. Verwarm de voorraad aminozuren op 42 °C met vortexing gedurende ~ 15-30 minuten om alle aminozuren op te lossen.</li>
	<li>Omdat sommige aminozuren (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) neerslaan op ijs, terwijl de rusttijd wordt geminimaliseerd, laat deze oplossing bij kamertemperatuur en gebruik een vortex om op te lossen.</li>
	<li>Voeg de berekende volumes (tabel 3) van voorraadoplossingen en water toe en meng goed met behulp van een vortex.</li>
	<li>Gebruik de energieoplossing als 20-100 μL aliquots per buis of naar wens op ijs en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.</li>
</ol>2. Bereiding van S. venezuelae ATCC 10712 cellen
<ol><li>Dag 1-Media/buffervoorbereiding en overnight pre-kweek<ol>
<li>Bereid 1 l steriel gym vloeibaar medium in een verbijsterde kolf van 2 l, zoals beschreven in tabel 1. Zie de tabel met materialen voor apparatuur/chemische/reagensbronnen.</li>
		<li>Bereid 1 x 50 ml steriel gym vloeibaar medium in een Erlenmeyer van 250 ml, zoals beschreven in tabel 1.</li>
		<li>Bereid 100 ml 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 ml 1 M MgCl2 en 500 ml 4 M NH4Cl-oplossingen om 1 l S30A en 1 l S30B wasbuffers te maken. Zie tabel 2 voor de recepten.</li>
		<li>Bereid de nachtelijke pre-cultuur voor. Verwarm de steriele 50 ml GYM vloeibaar medium gedurende 30 minuten voor in een Erlenmeyer van 250 ml tot 28 °C.</li>
		<li>Ent een enkele kolonie S. venezuelae ATCC 10712 (of verwante stam) uit een GYM-agarplaat in voorgewarmde 50 ml GYM vloeibaar medium en incubeer bij 28 °C, 200 tpm gedurende 16 uur (overnight pre-culture).</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 2-Bereid overdag precultuur en belangrijkste groeicultuur voor.<ol>
<li>Verwarm 50 ml steriel gym vloeibaar medium voor in een Erlenmeyer van 250 ml bij 28 °C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Breng 1 ml overnight pre-culture over in voorverwarmd 50 ml GYM vloeibaar medium en incubeer bij 28 °C, 200 rpm gedurende 8 uur (overdag pre-cultuur).</li>
		<li>Controleer na deze groeiperiode de OD600 in een spectrofotometer met behulp van een 1:10 verdunning met steriel GYM-medium in een plastic cuvette van 1 ml (1 cm padlengte). OPMERKING: De OD600 moet ten minste 3-4 hebben bereikt. Als er een slechte groei is, is het raadzaam om stap 2.2.1-2.2.2 te herhalen.</li>
		<li>Subkweek 0,25 ml voorkweek overdag in 1 l vloeibaar GYM-medium in 2 l verbijsterde kolven.</li>
		<li>Schud een nacht bij 28 °C, 200 tpm gedurende 14 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3-Oogst cellen<ol>
<li>Neem na de vorige incubatietijd (14 uur) de OD600 van de hoofdcultuur op. Verdun de nachtkweek 1:10 met vers GYM medium voor OD600 meting. OPMERKING: De OD600 had in dit stadium 3.0-4.0 moeten bereiken.</li>
		<li>Als OD600<3.0, verhoogt u de schudsnelheid tot 250-300 tpm en groeit u totdat een OD600 van 3.0 is bereikt. Groei niet langer dan 2 uur extra (16 uur in totaal).</li>
		<li>Als OD600>3.0, breng de culturen over naar centrifugatiecontainers en koel snel af op nat ijs gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Bereid in afwachting van de celcultuur op ijs 4 ml verse buffers van 1 M dithiothreitol (DTT), S30A en S30B, zoals beschreven in tabel 1, en houd ze op ijs. Zie de tabel met materialen voor chemische/reagensbron.</li>
		<li>Weeg een lege centrifugebuis van 50 ml voor en koel voor bij -20 °C.</li>
		<li>Voeg 2 ml 1 M DTT toe aan 1 l S30A-buffer op ijs en meng goed. OPMERKING: Voeg DTT alleen toe aan de wasbuffers van de S30A en S30B voordat u ze gebruikt.</li>
		<li>Centrifugeer cellen bij 6.000 × g, 4 °C, 10 min en gooi het supernatant voorzichtig weg in een snelle en enkele beweging. OPMERKING: Als de pellet wordt verstoord, maximaliseer dan de celretentie met het resterende GYM-medium en ga door met het protocol.</li>
		<li>Voeg 500 ml S30A-buffer toe en resuspend de cellen door de centrifugatieflessen krachtig te schudden totdat de celklonten homogeen zijn gedispergeerd.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 6.000 × g, 4 °C, 6 min, en gooi het supernatant voorzichtig weg. OPMERKING: Hoewel de celkorrel op dit punt steviger zal zijn, blijven sommige cellen in suspensie (zie figuur 1). Behandel zoals beschreven in 2.3.7 en behoud zoveel mogelijk cellen.</li>
		<li>Herhaal stap 2.3.8-2.3.9.</li>
		<li>Voeg 2 ml 1 M DTT toe aan 1 l S30B-buffer op ijs en meng goed. Voeg 500 ml S30B-buffer toe aan de cellen. Herhaal stap 2.3.9.</li>
		<li>Resuspend de celkorrel in 10 ml S30B-buffer en breng over naar de voorgewogen, voorgekoelde centrifugebuis van 50 ml. Breng indien nodig de resterende cellen over met een extra 5-10 ml S30B-buffer. Vul tot 50 ml met S30B.</li>
		<li>Centrifugeer cellen bij 6.000 × g, 4 °C, 10 min en gooi het supernatant voorzichtig weg.</li>
		<li>Herhaal stap 2.3.13.</li>
		<li>Zuig het resterende S30B-supernatant voorzichtig op met een pipet van 100-200 μL.</li>
		<li>Weeg de natte celkorrel. OPMERKING: Typisch natte cel pelletgewicht voor 1 L overnight GYM-cultuur (OD600 = 3,0) is ~ 4,5 g.</li>
		<li>Voeg voor elke 1 g natte cellen 0,9 ml S30B-buffer toe. Resuspend de cellen met behulp van een Pasteur pipet of vortex.</li>
		<li>Centrifugeer kort (~ 10 s) tot 500 × g om de cellen te bezinken. OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd en cellen kunnen worden ingevroren op vloeibare stikstof of droogijs en worden opgeslagen bij -80 °C. Draag voor de veiligheid geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) bij het hanteren van vloeibare stikstof, inclusief gezichtsschermen en handschoenen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cellysis door ultrasoonapparaat om het ruwe celextract te verkrijgen
OPMERKING: In dit stadium kan de gebruiker ervoor kiezen om de cellen te verstoren door ultrasoonapparaat in fracties van 1 ml (optie 1) of als een grotere celsuspensie (5 ml) in een buis van 50 ml (optie 2). Beide opties zijn hieronder beschreven om reproduceerbaarheid te garanderen, omdat het uiteindelijke volume van de celsuspensie kan veranderen als gevolg van het verlies van cellen tijdens eerdere oogst- en wasstappen. Een nieuwe gebruiker moet eerst optie 2.1 proberen om het protocol tot stand te brengen.
<ol><li>Cell Lysis door sonicatie in 1 ml fracties<ol>
<li>Gebruik een pipetpunt van 1 ml (snijd het uiteinde van de punt af om de boring te vergroten) breng 1 ml van de celsuspensie over in microcentrifugebuizen van 2 ml. OPMERKING: Als de cellen bevroren zijn, ontdooi dan snel de buis van 50 ml met de pellet in lauw water voorafgaand aan de cellyse. Breng de buis over op nat ijs zodra de pellet is begonnen te ontdooien en laat 10 minuten afkoelen.</li>
		<li>Plaats elke microcentrifugebuis in een beker ijswater, met behulp van een plastic buizenrek om de buis vast te houden voor ultrasoonapparaat. OPMERKING: Vanwege de gevoeligheid van het celextract voor oververhitting, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de buizen niet opwarmen om eiwitneerslag en verminderde enzymatische activiteit te voorkomen.</li>
		<li>Gebruik een sonicatorsonde met een punt met een diameter van 3 mm en reinig deze met 70% (v/v) ethanol en dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Laat de sonicatorpunt in de celsuspensie zakken totdat deze ~ 1 cm onder het vloeistofoppervlak ligt.</li>
		<li>Voer de volgende instellingen in de sonicator in: 20 kHz frequentie, 65% amplitude, 10 s puls AAN tijd, 10 s pulsen UIT tijd, 1 min totale ultrasoonapparaat tijd.</li>
		<li>Voer het ultrasoonapparaatprotocol uit. Beweeg de buis omhoog /omlaag en zijwaarts tijdens de eerste twee rustcycli om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden gesoniseerd. Noteer de energie-input. OPMERKING: Draag voor de veiligheid de juiste gehoorbescherming tijdens het ultrasoonapparaat. De viscositeit zal afnemen naarmate cellen worden verstoord en de bleke crème natte celkorrel moet veranderen in een homogene bruine vloeistof. De aanbevolen energie-input is 240 J per ml natte cellen. Als de cellen slechts gedeeltelijk worden gelyseerd, zal de suspensie nog steeds crèmekleurig lijken met viskeuze klonten cellen, vooral aan de zijkanten van de buis.</li>
		<li>Keer de buis 2-3 keer om en herhaal de ultrasoonapparaat voor nog een of twee cycli van 10 s, waarbij vaak wordt gemengd totdat de cellen volledig zijn verstoord.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cell Lysis door sonicating van een 5 ml celsuspensie<ol>
<li>Als de cellen bevroren zijn, ontdooi dan snel de buis van 50 ml met de pellet in lauw water met schudden voordat de cellysis. Breng de buis over op nat ijs zodra de pellet is begonnen te ontdooien en laat 10 minuten afkoelen.</li>
		<li>Draai de buis kort op 500 x g om de cellen te bezinken.</li>
		<li>Plaats de buis van 50 ml in een beker ijswater voor ultrasoonapparaat. OPMERKING: Vanwege de gevoeligheid van het celextract voor oververhitting, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de buizen niet opwarmen om eiwitneerslag en verminderde enzymatische activiteit te voorkomen.</li>
		<li>Gebruik een sonicatorsonde met een punt met een diameter van 6 mm en reinig deze met 70% (v/v) ethanol en ddH2O (zie het visuele schema van de 6 mm sonde in figuur 1). Laat de sonicatorpunt in de celsuspensie (~ 5 ml) zakken totdat deze ~ 1 cm onder het vloeistofoppervlak ligt.</li>
		<li>Voer de volgende instellingen in de sonicator in: 20 kHz frequentie, 65% amplitude, 10 s puls AAN tijd, 10 s pulsen UIT tijd, 1 min totale ultrasoonapparaattijd per ml natte cellen (5 min in totaal).</li>
		<li>Voer het ultrasoonapparaatprotocol uit. Beweeg de buis omhoog /omlaag en zijwaarts tijdens de eerste twee rustcycli om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden gesoniseerd. OPMERKING: Draag voor de veiligheid de juiste gehoorbescherming tijdens het ultrasoonapparaat. De viscositeit zal afnemen naarmate de cellen worden verstoord en de bleke crème natte celkorrel moet veranderen in een homogene bruine vloeistof. Noteer de energie-input. Een optimale energie-input van 240 J per ml natte cellen (~ 1200 J in totaal vanaf 5 minuten ultrasoonapparaat) wordt aanbevolen.</li>
		<li>Als sommige cellen intact blijven, volgt u de aanwijzingen uit stap 3.1.5.</li>
		<li>Breng de celextracten over in microcentrifugebuizen van 2 ml.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Celextract klaring en afvloeiingsreactie
<ol><li>Centrifugeer de gelyseerde cellen bij 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het celresten te verwijderen. Breng het supernatant over in microcentrifugebuizen van 1,5 ml als aliquots van 1 ml.</li>
	<li>Voer de afvloeireactie uit voor de celextracten. Incubeer de buisjes van 1,5 ml met de celextracten bij 30 °C gedurende 60 minuten op een warmteblok of incubator zonder te schudden.</li>
	<li>Centrifugeer de celextracten bij 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bundel de supernatanten in een centrifugebuis van 15 ml. Meng het bovennatuurlijk door de buis vijf keer om te keren tot het homogeen is en houd het vervolgens op ijs. Keer voorzichtig om om de vorming van luchtbellen te voorkomen.</li>
	<li>Verdun 10 μL van het celextract 100-voudig met S30B-buffer en meet de totale eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test met drie technische herhalingen (zie Supplemental Material S2 voor Bradford-testrichtlijnen).</li>
	<li>Als de eiwitconcentratie 20-25 mg/ml is, brengt u de celextracten als aliquots van 100 μL over in nieuwe buizen van 1,5 ml, flash-freeze in vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C. OPMERKING: Draag voor de veiligheid geschikte PBM bij het hanteren van vloeibare stikstof, inclusief gezichtsschermen en handschoenen.</li>
	<li>Als de eiwitconcentratie <20 mg /ml is, herhaal dan de stappen ter voorbereiding van het ruwe extract om ervoor te zorgen dat celextract van hoge kwaliteit en TX-TL-opbrengsten vergelijkbaar zijn met het eerder gepubliceerde werk5.</li>
</ol>5. Voorbereiding van plasmide DNA sjabloon
<ol><li>Zuiver de pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmide (pUC19 oorsprong) van een vers getransformeerde E. coli plasmide stam (DH10β, JM109) gekweekt in 50 ml LB cultuur (met 100 mg / ml carbenicilline) met behulp van een geschikte plasmide DNA-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Eluteer het plasmide in 2 x 300 μL nucleasevrij water en combineer de fracties.</li>
	<li>Voeg 0,1 volume (66 μL) 3 M natriumacetaat (pH 5,2) toe.</li>
	<li>Voeg 0,7 volumes (462 μL) isopropanol toe.</li>
	<li>Incubeer het DNA bij -20 °C gedurende 30 min.</li>
	<li>Centrifugeer bij 16.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 2 ml 70% (v/v) ethanol toe aan de DNA-pellet.</li>
	<li>Keer de buis 3-4 keer om om de plasmide DNA-pellet opnieuw te suspenderen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 16.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Herhaal stap 5.7-5.9 en verwijder alle zichtbare vloeistof.</li>
	<li>Droog de DNA-pellet aan de lucht gedurende 10-30 minuten of droog gedurende 5 minuten met een vacuümcentrifuge.</li>
	<li>Resuspend de gedroogde pellet met 600 μL nucleasevrij ddH2O.</li>
	<li>Meet de DNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer.</li>
	<li>Bereid 50-100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C. OPMERKING: Een hoge DNA-concentratie in het bereik van 500-1000 ng/μL wordt aanbevolen vanwege de krappe volumebeperkingen van celvrije reacties. Verdun de plasmide DNA-voorraad tot 80 nM; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmide komt overeen met 80 nM. </li>
</ol>6. Bereiding van de Streptomyces Master Mix (SMM) oplossing
<ol><li>Aminozuuroplossing<ol>
<li>Gebruik de aminozuur sampler kit om handmatige fouten te voorkomen en de bereidingstijd te verkorten, volgens de instructies van de fabrikant die online worden verstrekt.</li>
		<li>Verdun de 20x aminozuurvoorraadoplossing met ddH2O tot een eindconcentratie van 6 mM (5 mM L-Leu).</li>
		<li>Verder verdunnen tot 2,4 mM (2 mM L-Leu) in de 2,4x SMM-oplossing (zie tabel 3). OPMERKING: De uiteindelijke concentratie in de TX-TL-reactie is 1 mM 19x aminozuren en 0,83 mM L-Leu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Energieoplossing en additieven<ol>
<li>Bereid de andere componenten in de 2,4x SMM-oplossing volgens het recept beschreven in tabel 3.</li>
		<li>U kunt ook een 2,4x Minimal Energy Solution (MES) bereiden, volgens het recept dat wordt beschreven in tabel 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Het instellen van een standaard S. venezuelae TX-TL reactie
<ol><li>Ontdooi het celextract, SMM (of MES) oplossing en plasmide DNA op ijs. Koel een plaat met 384 putten voor op -20 °C.</li>
	<li>TX-TL-reacties instellen waarbij 25% van het volume plasmide-DNA is, 33,33% celextract en 41,67% SMM-oplossing ; houd ze op ijs om starttijdbias te voorkomen. OPMERKING: Er is een standaard TX-TL-sjabloon beschikbaar (tabel 4) om het benodigde volume reagentia te berekenen op basis van het aantal reacties. Het standaardvolume voor een reactie van 33 μL is als volgt: 11 μL celextract, 13,75 μL SMM en 8,25 μL plasmide-DNA.</li>
	<li>Vortex het mengsel voorzichtig gedurende ~ 5 s bij een lage snelheidsinstelling om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is. Vermijd schuimvorming/bubbelvorming.</li>
	<li>Breng 10 μL aliquots over in drie putten van een 384-putplaat als een technisch drievoud zonder luchtbellen te introduceren. Sluit de plaat af met een transparante afdekking en draai gedurende 5 s met 400 × g .</li>
	<li>Incubeer de reactie bij 28 °C in een incubator (voor eindpuntmetingen) of een plaatlezer zonder te schudden. OPMERKING: Reacties hebben meestal 3-4 uur nodig om de voltooiing te bereiken. Zie Aanvullend materiaal S2 voor richtlijnen voor een plaatlezer en mScarlet-I standaardmetingen.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In dit manuscript is een hoog rendement S. venezuelae TX-TL-protocol beschreven met gedetailleerde stappen die eenvoudig uit te voeren zijn voor zowel ervaren als nieuwe gebruikers van TX-TL-systemen. Verschillende functies van bestaande Streptomyces45- en E. coli TX-TL41-protocollen zijn verwijderd om een minimaal, maar toch hoog rendementsprotocol voor S. venezuelae TX-TL5,26 vast te stellen.<sup class...

Cell-free transcription-translation (TX-TL) systemen bieden een ideaal prototyping platform voor synthetische biologie om snelle design-build-test-learn cycli te implementeren, het conceptuele engineering framework voor synthetische biologie1. Daarnaast is er een groeiende belangstelling voor TX-TL-systemen voor hoogwaardige recombinante eiwitproductie in een open-reactieomgeving2, bijvoorbeeld om niet-standaard aminozuren op te nemen in antilichaam-geneesmiddelconjugaten3. In het bijzonder vereist TX-TL een celextract, plasmide of lineair DNA en een energieoplossing om eiwitsynthese in batch- of semicontinureacties te katalyseren. Hoewel Escherichia coli TX-TL het dominante celvrije systeem is, hebben een aantal opkomende tx-tl-systemen zonder model de aandacht getrokken voor verschillende toepassingen4,5,6,7,8. De belangrijkste voordelen van TX-TL zijn flexibele schaalbaarheid (nanoliter tot liter schaal)9,10, sterke reproduceerbaarheid en geautomatiseerde workflows8,11,12. Met name de automatisering van TX-TL maakt de versnelde karakterisering van genetische delen en regulerende elementen mogelijk8,12,13.
In termen van reactie-instelling vereist TX-TL zowel primaire als secundaire energiebronnen, evenals aminozuren, cofactoren, additieven en een sjabloon-DNA-sequentie. Nucleotidetrifosfaten (NTP's) leveren de primaire energiebron om initieel mRNA (ATP, GTP, CTP en UTP) en eiwitsynthese (alleen ATP en GTP) aan te sturen. Om de TX-TL-opbrengsten te verhogen, worden NTP's geregenereerd door het katabolisme van een secundaire energiebron, zoals maltose14, maltodextrine15, glucose14, 3-fosfoglyceraat (3-PGA)16, fosfoenolpyruvaat17 en L-glutamaat18. Deze inherente metabole activiteit is verrassend veelzijdig, maar toch slecht bestudeerd, vooral in opkomende TX-TL-systemen. Elke energiebron heeft verschillende eigenschappen en voordelen in termen van ATP-opbrengst, chemische stabiliteit en kosten, wat een belangrijke overweging is voor opgeschaalde TX-TL-reacties. Tot nu toe hebben de huidige protocollen voor E. coli TX-TL bereikt tot 4,0 mg / ml (~ 157 μM) voor het model groen fluorescerend eiwit (GFP), met behulp van een mengsel van 3-PGA (30 mM), maltodextrine (60 mM) en D-ribose (30 mM) als secundaire energiebron19.
Onlangs is er een toenemende interesse in het bestuderen van secundaire metaboliet biosynthetische routes in TX-TL-systemen20,21,22. In het bijzonder zijn Actinobacteriën een belangrijke bron van secundaire metabolieten, waaronder antibiotica en landbouwchemicaliën23,24. Hun genomen zijn verrijkt met zogenaamde biosynthetische genclusters (BGC's), die coderen voor enzymatische routes voor secundaire metabolietbiosynthese. Voor de studie van actinobacteriën genetische delen en biosynthetische routes, zijn onlangs een reeks op Streptomyces gebaseerde TX-TL-systemen ontwikkeld5,6,25,26. Deze gespecialiseerde Streptomyces TX-TL-systemen zijn potentieel gunstig om de volgende redenen: [1] het leveren van een inheemse eiwitvouwingsomgeving voor enzymen uit Streptomyces spp.26; [2] toegang tot een optimale tRNA-pool voor hoge G+C (%) genexpressie; [3] actief primair metabolisme, dat mogelijk kan worden gekaapt voor de levering van biosynthetische precursoren; en [4] levering van enzymen, precursoren of cofactoren uit secundair metabolisme die aanwezig zijn in het inheemse celextract. Daarom is er onlangs een high-yield S.venezuelae TX-TL toolkit opgezet om deze unieke mogelijkheden te benutten5.
Streptomyces venezuelae is een opkomende gastheer voor synthetische biologie met een rijke geschiedenis in industriële biotechnologie5,27,28,29 en als modelsysteem voor het bestuderen van celdeling en genetische regulatie in Actinobacteria30,31,32. De belangrijkste typestam, S. venezuelae ATCC 10712, heeft een relatief groot genoom van 8,22 Mb met 72,5% G+C-gehalte (%) (Toetredingsnummer: CP029197), dat codeert voor 7377 coderende sequenties, 21 rRNA's, 67 tRNA's en 30 biosynthetische genclusters27. In de synthetische biologie is S. venezuelae ATCC 10712 een aantrekkelijk chassis voor de heterologe expressie van biosynthetische routes. In tegenstelling tot de meeste andere Streptomyces-vlekken biedt het verschillende belangrijke voordelen, waaronder een snelle verdubbelingstijd (~ 40 min), een uitgebreid scala aan genetische en experimentele hulpmiddelen5,28, gebrek aan myceliale klontering en sporulatie in vloeibare media28,33. Verschillende studies hebben ook het gebruik van S. venezuelae aangetoond voor heterologe productie van een breed scala aan secundaire metabolieten, waaronder polyketiden, ribosomale en niet-ribosomale peptiden34,35,36,37,38. Deze gecombineerde eigenschappen maken deze stam een aantrekkelijke microbiële gastheer voor synthetische biologie en metabole engineering toepassingen. Hoewel S. venezuelae niet het dominante Streptomyces-model is voor heterologe genexpressie, is het met verdere ontwikkelingen klaar voor breder gebruik binnen de ontdekking van natuurlijke producten.
Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol (figuur 1) voor een hoog rendement S. venezuelae TX-TL-systeem, dat is bijgewerkt van het oorspronkelijke eerder gepubliceerde protocol26. In dit werk zijn de energieoplossing en reactieomstandigheden geoptimaliseerd om de eiwitopbrengst tot 260 μg / ml voor het mScarlet-I reporter-eiwit te verhogen in een batchreactie van 4 uur, 10 μL, met behulp van een standaard plasmide, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Dit plasmide is speciaal ontworpen om verschillende methoden voor het detecteren van eiwitexpressie mogelijk te maken. Het protocol is ook gestroomlijnd, terwijl het energiesysteem is geoptimaliseerd om de complexiteit en kosten van het opzetten van celvrije reacties te verminderen zonder de opbrengst in gevaar te brengen. Samen met het geoptimaliseerde TX-TL-systeem is een bibliotheek van genetische delen ontwikkeld voor het verfijnen van genexpressie en als fluorescerende hulpmiddelen voor het monitoren van TX-TL in realtime, waardoor een veelzijdig platform wordt gecreëerd voor het prototypen van genexpressie en biosynthetische routes van natuurlijke producten van Streptomyces spp. en gerelateerde Actinobacteriën.
In dit werk kan het aanbevolen standaard plasmide (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) worden gebruikt om de S. venezuelae TX-TL-workflow in een nieuw laboratorium vast te stellen en is beschikbaar op AddGene (zie Aanvullende tabel S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I biedt de gebruiker de flexibiliteit om andere openleesframes (ORF's) te bestuderen. De mScarlet-I ORF is codon-geoptimaliseerd voor S. venezuelae genexpressie. De SP44-promotor is een sterke constitutieve promotor die zeer actief is in zowel E. coli als Streptomyces spp.39. Het plasmide heeft twee unieke restrictie-enzymplaatsen (NdeI, BamHI) om het subklonen van nieuwe ORF's in-frame mogelijk te maken met een gezamenlijk C-terminal FLAG-tag en fluoresceïne arsenisch haarspeldbocht (FlAsH) bindmiddeltagsysteem. Als alternatief kunnen beide tags worden verwijderd met de toevoeging van een stopcodon na het subklonen van een nieuw gen. Met deze basevector is de hoogrenderende expressie van een reeks eiwitten aangetoond, namelijk eiwitten uit de biosyntheseroute van oxytetracycline en een niet-gekarakteriseerd niet-ribosomaal peptidesynthetase (NRPS) van Streptomyces rimosus (figuur 2). In termen van mRNA-detectie bevat het pTU1-A-SP44-mScarlet-I standaard plasmide een dBroccoli aptamer (in het 3'-onvertaalde gebied) voor detectie met de 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylideen imidazolinone (DFHBI) probe. Voor meer flexibiliteit is er ook een toolset van EcoFlex40-compatibele MoClo-onderdelen beschikbaar gesteld op AddGene, waaronder een EcoFlex-compatibele Streptomyces shuttle vector (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) en een reeks pTU1-A-SP44 variant plasmiden die superfolder groen fluorescentie-eiwit (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I en β-glucuronidase (GUS) tot expressie brengen. In het bijzonder is het pSF1C-A plasmide afgeleid van pAV-gapdh28 en wordt het genezen van BsaI/BsmBI-locaties voor MoClo-assemblage. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP is gelijk aan pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP van EcoFlex40, maar bevat extra functionaliteit voor conjugatie en chromosomale integratie in Streptomyces spp. met behulp van het phiC31 integrase systeem28.
De eerste fase van het protocol omvat de groei van de S. venezuelae ATCC 10712 of een nauw verwante stam, celoogst in de mid-exponentiële fase, celwasstappen en equilibratie in S30A- en S30B-buffers. Deze fase duurt drie dagen en de tijd voor celgroei kan worden gebruikt om de resterende componenten voor te bereiden zoals hieronder beschreven. De geoogste cellen worden vervolgens gelyseerd door ultrasoonapparaat, verduidelijkt en ondergaan een afvloeiingsreactie. In deze laatste fase van de voorbereiding kunnen de celextracten worden voorbereid voor langdurige opslag bij -80 ° C om het verlies van activiteit te minimaliseren. Voor de assemblage van TX-TL-reacties met behulp van dit protocol wordt een Streptomyces Master Mix (SMM) gepresenteerd, met de optie van een Minimal Energy Solution-formaat (MES) dat vergelijkbare opbrengsten geeft. Verder wordt aanbevolen om een verse kweek van S. venezuelae ATCC 10712 van een -80 °C glycerolbouillon op een GYM-agarplaat te strooien en gedurende ten minste 48-72 uur bij 28 °C te incuberen totdat enkele kolonies zichtbaar zijn. Alleen verse culturen mogen worden gebruikt voor de volgende stappen.

<table><tbody><tr><td>2.5 L UltraYield Flask</td><td>Thomson</td><td>931136-B</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA (>93%)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>384 Well Black/Clear Bottom Plate</td><td>ThermoFisher</td><td>10692202</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride (98%)</td><td>Fluorochem</td><td>44722</td><td></td></tr><tr><td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (contact supplier for purity)</td><td>Melford</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose (contact supplier for purity)</td><td>Melford</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI (&ge;98% - HPLC)</td><td>Sigma</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DTT (contact supplier for purity)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-363644</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-6-phosphate (>98%)</td><td>Sigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Free Acid (contact supplier for purity)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%)</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (98%)</td><td>Fluorochem</td><td>494356</td><td></td></tr><tr><td>Malt extract</td><td>Sigma</td><td>70167-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-6000</td><td>Sigma</td><td>807491</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO</td><td>ThermoFisher</td><td>88260</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl sulfate) potassium salt</td><td>Sigma</td><td>271969</td><td></td></tr><tr><td>Potassium glutamate (>99%)</td><td>Sigma</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>RTS amino acid sampler</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (99%)</td><td>Fluorochem</td><td>94554</td><td></td></tr><tr><td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)</td><td>Sigma</td><td>505471</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Melford</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platereader</td><td>BMG</td><td>Omega</td><td></td></tr></tbody></table>

een high-yield streptomyces transcriptie-vertaling toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke producttoepassingen

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. zijn een belangrijke bron van klinische antibiotica en industriële chemicaliën. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is een snelgroeiende soort en een natuurlijke producent van chlooramfenicol, jadomycine en pikromycine, waardoor het een aantrekkelijke kandidaat is als een chassis voor synthetische biologie van de volgende generatie. Daarom zijn genetische hulpmiddelen die de ontwikkeling van S. venezuelae ATCC 10712 versnellen, evenals andere Streptomyces spp. modellen, zeer wenselijk voor natuurlijke producttechnologie en ontdekking. Hiertoe wordt in dit protocol een speciaal S. venezuelae ATCC 10712 celvrij systeem geleverd om hoogrenderende heterologe expressie van hoge G+C (%) genen mogelijk te maken. Dit protocol is geschikt voor kleinschalige (10-100 μL) batchreacties in 96-well of 384-well plaatformaat, terwijl reacties potentieel schaalbaar zijn. Het celvrije systeem is robuust en kan hoge opbrengsten bereiken (~ 5-10 μ M) voor een reeks recombinante eiwitten in een minimale opstelling. Dit werk omvat ook een brede plasmide-toolset voor real-time meting van mRNA- en eiwitsynthese, evenals in-gel fluorescentiekleuring van gelabelde eiwitten. Dit protocol kan ook worden geïntegreerd met high-throughput genexpressiekarakteriseringsworkflows of de studie van enzymroutes van hoge G + C (%) genen die aanwezig zijn in actinomycetengenomen.

Dit gedetailleerde protocol wordt als voorbeeld gegeven om de gebruiker te helpen bij het opzetten van een Streptomyces TX-TL-systeem op basis van de S. venezuelae ATCC 10712-modelstam (figuur 1). De gebruiker kan proberen andere Streptomyces-stammen te bestuderen; de groei-/oogststadia van andere soorten met langere verdubbelingstijden of duidelijke groeivoorkeuren moeten echter op maat worden geoptimaliseerd om piekresultaten te bereiken. Voor het representatieve...

Dit protocol beschrijft een verbeterde methode voor het synthetiseren van hoge opbrengsten van recombinante eiwitten uit een Streptomyces venezuelae celvrije transcriptie-translatie (TX-TL) systeem.

Een high-yield streptomyces transcriptie-vertaling toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke producttoepassingen

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Ons protocol biedt een vereenvoudigde workflow voor Streptomyces venezuelae celvrije transcriptie-vertaling. Ons systeem maakt gebruik van de metabole enzymen en routes van dit niet-modelorganisme. De belangrijkste voordelen zijn de heterologe expressie van genen met een hoog GC-gehalte, het verstrekken van een gunstige eiwitdoorstuuromgeving en een open systeem voor het finetunen van biosynthetische routes.Onze methode zal nieuwe mogelijkheden bieden voor het bestuderen van Streptomyces en gerelateerde hoge GC-bacteriën. Het maakt het mogelijk om enzymen en genexpressie in deze bacteriën te bestuderen. Deze techniek is ontwikkeld voor eenvoudige implementatie door nieuwe gebruikers.De enige stap die voorafgaande ervaring of vertrouwdheid vereist, is ultrasoonapparaat om zeer actieve ruwe extracten te produceren. Om te beginnen met het oogsten van de voorgekweekte cellen op de derde dag, verdunt u de nachtcultuur in de verhouding van één op 10 met een vers GYN-medium voor de optische dichtheid of OD-meting bij 600 nanometer. Als de OD van de cultuur op 600 nanometer minder dan 0,3 is, verhoog dan de schudsnelheid tot 250 tot 300 rotaties per minuut en groei totdat een OD 0,3 bereikt.Groei niet langer dan twee uur extra. Als de OD groter is dan 0,3, breng de culturen dan over in centrifugatiecontainers en koel snel af op nat ijs gedurende 30 minuten. Terwijl u wacht tot de celcultuur is afgekoeld, bereidt u vier milliliter verse één molaire dithiothreitol, S30A en S30B buffers voor en houdt u ze op ijs.Na het wegen van een lege centrifugebuis van 50 milliliter, koelt u deze voor bij min 20 graden Celsius. Voeg twee milliliter van één molaire dithiothreitol toe aan een liter S30A-buffer op ijs en meng goed. Centrifugeer de cellen op 6.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Nadat u het supernatant in een snelle beweging hebt weggegooid, voegt u 250 milliliter S30A-buffer toe en resuspendeert u de cellen door de centrifugatieflessen krachtig te schudden totdat de celklonten homogeen zijn gedispergeerd. Centrifugeer de cellen vervolgens opnieuw gedurende zes minuten. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en herhaal de toevoeging van de S30A-buffer, gevolgd door centrifugering zoals aangetoond.Voeg vervolgens twee milliliter van één kies DTT toe aan een liter S30B-buffer op ijs en meng goed. Voeg 250 milliliter S30B-buffer toe aan de cellen en herhaal de centrifugatie. Resuspend de celkorrel in 10 milliliter S30B-buffer en breng de celsuspensie over naar de voorgewogen voorgekoelde centrifugebuis van 50 milliliter.Breng indien nodig de restcellen over met nog eens vijf tot 10 milliliter S30B-buffer en vul de buis tot 50 milliliter volume met S30B. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en herhaal de centrifugering bij eerdere instellingen zoals gedemonstreerd.Na het weggooien van het supernatant, aspiraleer je het resterende S30B-supernatant met een pipet van 100 tot 200 microliter en weeg je de natte celkorrel. Voeg voor elke gram natte cellen 0,9 milliliter S30B-buffer toe. Resuspend de cellen met behulp van een Pasteur pipet of vortex.Centrifugeer kort gedurende ongeveer 10 seconden tot 500 G om de cellen te bezinken. Laat de sonicatorpunt in de celsuspensie zakken totdat de punt zich ongeveer een centimeter onder het vloeistofoppervlak bevindt. Voer verschillende parameters in de sonicatorinstellingen in.Stel de frequentie in op 20 kilohertz, amplitude op 65% puls aan en uit tijd tot 10 seconden en totale ultrasoonapparaattijd op één minuut. Begin met ultrasoonapparaat en beweeg de buis omhoog of omlaag en zijwaarts tijdens de eerste twee rustcycli om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden gesoniseerd. Als de cellen niet volledig zijn gelyseerd, keert u de buis twee tot drie keer om en herhaalt u de ultrasoonapparaat voor nog een of twee cycli van 10 seconden met frequent mengen totdat de cellen volledig zijn verstoord.Centrifugeer de geloot cellen om het celafval te verwijderen en breng het supernatant vervolgens over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter als aliquot van één milliliter. Voor de afvloeiingsreactie van de celextracten, incubeer de cel met het celextract bij 30 graden Celsius gedurende 60 minuten op een warmteblok of in de incubator zonder een shaker. Ontdooi voor de transcriptie-translatiereactie het celextract SMM of MES-oplossing en plasmide-DNA op ijs.Pre-chill een 384-well plaat bij min 20 graden Celsius. Stel de transcriptie-translatiereactie in op het ijs, waarbij 25% van het volume plasmide-DNA is, 33,33% celextract en 41,67% SMM-oplossing. Vortex het mengsel voorzichtig gedurende ongeveer vijf seconden op een lage snelheidsinstelling om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is en vermijd schuimvorming of bubbelvorming.Breng drie aliquots van 10 microliter over in drie putten van een 384-putplaat als een technisch drievoud zonder luchtbellen te introduceren. Nadat u de plaat met een transparante afdekking hebt afgedicht, draait u de plaat gedurende vijf seconden op 400 maal G en incubeert u de reactie bij 28 graden Celsius in een incubator of een plaatlezer zonder te schudden. Streptomyces venezuelae celvrije transcriptie-translatie werd geoptimaliseerd voor high yield expressie van fluorescerende eiwitten uit het pTU1-A-SP44 standaard plasmide, evenals biosynthetische enzymen gedetecteerd door gel elektroforese.De expressie van het pTU1-A-SP44-mScarlet-I standaard plasmide werd gemeten met behulp van verschillende methoden. De real-time fluorescentiemetingen van mRNA met behulp van het dBroccoli RNA aptamer, onrijp mScarlet-I eiwit met behulp van het FlAsH tag systeem en volwassen mScarlet-I eiwit werden uitgevoerd. De in-gel fluorescentiekleuring van mScarlet-I met behulp van FlAsH-tag werd uitgevoerd naast de Coomassie Blue-kleuring van het totale celvrije eiwit.Na deze procedure kunnen activiteitstests worden uitgevoerd om enzymen en routes te bestuderen die uitdagend zijn met behulp van standaardmethoden. Het strekt zich ook uit tot opgeschaalde biosynthese en genexpressie met hoge doorvoer. We ontwikkelen deze techniek om metabole enzymen van bacteriën met een hoog GC-gehalte te bestuderen.We hebben het potentieel van ons systeem aangetoond om opgeschaalde biosynthese in celvrije reacties te bestuderen.

a-high-yield-streptomyces-transcription-translation-toolkit-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De heterologe biosynthese van erythromycine A...

De Logic, experimentele stappen, en het potentieel van heterologe Natuurlijk Product Biosynthese Met de Complex antibioticum erytromycine A geproduceerd door middel van<em&gt; E. coli</em

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol van (A) de identificatie van een natuurlijk product met antibiotische werking, (B) de zuivering van de verbinding, (C), het eerste model van zijn biosynthese, (D) genome sequencing / -mining en de ( E) verificatie van de biosynthetische gencluster.

Van een natuurlijk product om Zijn Biosynthetisch Gene Cluster: Een demonstratie met behulp van Polyketomycin Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Deze studie beschrijft methoden voor de T7-gemedieerde co-expressie van meerdere genen uit een enkel plasmide in Escherichia coli met behulp van het pMGX plasmide systeem.

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Dit manuscript beschrijft een algemene aanpak voor op maat gemaakte ontwerp van microbiële teelt media. Deze optie is ingeschakeld door een iteratieve werkstroom combineren Kriging gebaseerde experimentele design en microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, die wordt ondersteund door lab robotica om betrouwbaarheid en snelheid in vloeistof behandeling van media voorbereiding.

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Hier presenteren we gemakkelijk te gebruiken protocollen voor het produceren en zuiveren van diterpenoid metabolieten door de combinatorische expressie van biosynthetische enzymen in Escherichia coli of Nicotiana benthamiana, gevolgd door chromatografische product Zuivering. De resulterende metabolieten zijn geschikt voor verschillende studies, waaronder moleculaire structuur karakterisering, enzym functionele studies, en bioactiviteitentesten.

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Een massaspectrometrie-geleide genoom mijnbouw protocol is hier vastgesteld en beschreven. Het is gebaseerd op genoomsequentie-informatie en LC-MS/MS-analyse en heeft tot doel de identificatie van moleculen uit complexe microbiële en plantenextracten te vergemakkelijken.

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining als een instrument om nieuwe natuurlijke producten te ontdekken

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bereiding en bufferkalibratie van celextracten uit exonuclease V knock-out stammen van Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD en ΔrecB). Dit is een snelle, eenvoudige en directe benadering voor expressie in celvrije eiwitsynthesesystemen met behulp van lineaire DNA-sjablonen.

Celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire DNA-sjablonen

Ontdek een vereenvoudigde workflow voor celvrije transcriptie-translatie in Streptomyces venezuelae. Deze methode maakt heterologe expressie van genen met hoog GC-gehalte mogelijk en biedt een gunstige omgeving voor eiwitproductie.

Een high-yield streptomyces transcriptie-vertaling toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke producttoepassingen

Meer video's verkennen