Name: De extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Leer een geoptimaliseerde methode voor de extractie van leverglycogeen die de structuur behoudt en verlies van kleine deeltjes minimaliseert. Dit protocol met kookstap ondersteunt onderzoek naar diabetes en glycogeenstapelingsziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn de heer Gaosheng Wu en mevrouw Yunwen Zhu dankbaar voor technische assistentie bij FACE en de heer Zhenxia Hu en de heer Dengbin voor technische assistentie bij SEC. MAS wordt ondersteund door een Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees en de LG McCallam Est en George Weaber Trusts. Dit werk werd ondersteund door het Priority Academic Program van Jiangsu Higher Education Institutions, een beurs van de Natural Science Foundation of China C1304013151101138 en het Jiangsu Innovation and Entrepreneurship talentenprogramma 2017. Figuur 1-5 zijn gemaakt met behulp van BioRender.

Muizenlevers die werden gebruikt om deze procedure te optimaliseren21 waren afkomstig van 12 mannelijke BKS-DB/Nju achtergrondmuizen (7,2 weken oud, zie de tabel met materialen). Het gebruik van dieren is goedgekeurd door het Renmin Hospital van de Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC-nummer nr. WDRM 20181113.
1 Dierlijke weefsels
<ol><li>Weeg de lever van de muis af (1-1,8 g hele lever van elke muis).</li>
	<li>Vries de muizenlever snel in vloeibare stikstof in en bewaar deze bij -80 °C.</li>
</ol>2. Bereiding van buffer en reagentia
<ol><li>Bereid glycogeenisolatiebuffer met 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF en 5 mM natriumpyrofosfaat met gedeïoniseerd water en stel de pH in op 8.</li>
	<li>Bereid 30% (m/m) sucrose-oplossing (die het meest optimaal blijkt te zijn voor leverglycogeen21).</li>
	<li>Bereid natriumacetaatbuffer (1 M, pH 4,5), azijnzuurbuffer (0,1 M, pH 3,5), natriumhydroxideoplossing (0,1 M) en natriumcyanoborohydride (1 M).</li>
	<li>Bereid 8-aminopyreen-1,3,6-trisulfonaat (APTS)-oplossing door 5 mg APTS toe te voegen aan 50 μl 15% ijsazijn.</li>
	<li>Bereid een ammoniumnitraatoplossing met 50 mM ammoniumnitraat met 0,02% natriumazide.</li>
</ol>3. Glycogeenextractie (figuur 2)
<ol><li>Breng het ingevroren leverweefsel (~1 g) over in een buisje van 15 ml met 6 ml glycogeenisolatiebuffer.</li>
	<li>Houd het op ijs en homogeniseer het leverweefsel met behulp van een weefselhomogenisator.</li>
	<li>Breng de helft van de suspensie (3 ml) over in een nieuwe buis en kook gedurende 10 minuten (aangetoond dat dit optimaal is voor glycogeenstructuurstudies21). Bewaar de andere helft van de suspensie (3 ml) op ijs om glycogeen te extraheren dat geassocieerde eiwitten bevat die niet gedenatureerd zijn. OPMERKING: Ongekookte monsters moeten altijd op ijs worden bewaard tijdens glycogeenextractiestappen. Als glycogeeneiwitten niet belangrijk zijn voor onderzoek, kan het hele monster de kookstap van 10 minuten ondergaan.</li>
	<li>Verwijder een aliquot van 8 μl uit elk buisje, bewaar de aliquots op ijs en gebruik ze voor de bepaling van het glycogeengehalte (zie rubriek 4).</li>
	<li>Centrifugeer de resterende suspensie bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Breng de supernatanten over in ultracentrifugebuisjes en centrifugeer ze bij 3,6 × 10,5g gedurende 90 minuten bij 4 °C. </li>
	<li>Gooi de resterende supernatanten weg en resuspendeer de pellets in 1,5 ml glycogeenisolatiebuffer.</li>
	<li>Breng de monsters in lagen over 1,5 ml 30% sacharoseoplossing in ultracentrifugebuisjes van 4 ml en centrifugeer ze gedurende 2 uur bij 4 °C bij 3,6 ×10,5 g .</li>
	<li>Gooi de resterende supernatanten weg en resuspendeer de pellets in 200 μL gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Voeg 800 μL absolute ethanol toe aan de suspensies en meng goed om glycogeen23,24 neer te slaan. Bewaar de mengsels gedurende ten minste 1 uur bij -20 °C om neerslag mogelijk te maken.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi de supernatanten weg en resuspendeer de pellets in 200 μL gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Herhaal dit ethanolprecipitatieproces 3x en resuspendeer de uiteindelijke glycogeenpellet in 200 μL gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Verwijder een aliquot van 8 μl uit elk buisje voor de bepaling van het glycogeengehalte (zie rubriek 4).</li>
	<li>Vries de resterende supernatanten in vloeibare stikstof in en vriesdroog (vriesdroog) een nacht. Bewaar de droge glycogeenmonsters in de vriezer bij -20 °C. OPMERKING: De droge glycogeenmonsters moeten stabiel zijn bij -20 °C; Er zijn echter geen gegevens om aan te geven hoe lang ze meegaan zonder structurele veranderingen.</li>
</ol>4. Bepaling van het glycogeengehalte (figuur 3)
<ol><li>Voeg 8 μl van de glycogeensupernatanten (zie rubrieken 3.13 en 3.4), 5 μl amyloglucosidase (3269 E/ml) en 100 μl natriumacetaatbuffer (1 M, pH 4,5) toe aan een microcentrifugebuisje en vul het buisje tot de 500 μl-markering met gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Bereid controles voor die gedeïoniseerd water gebruiken in plaats van amyloglucosidase.</li>
	<li>Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 50 °C, terwijl de controles op ijs blijven.</li>
	<li>Centrifugeer bij 6.000 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten en meng 300 μl van elk resulterend supernatans met 1 ml glucosidaseoxidase/peroxidase (GOPOD)-reagens.</li>
	<li>Construeer een kalibratiecurve door 300 μL gedeïoniseerd water met 0, 10, 20, 30, 40 en 50 μg D-glucose te mengen met 1 ml GOPOD-reagens.</li>
	<li>Incubeer de mengsels nog eens 30 minuten bij 50 °C.</li>
	<li>Lees de absorptie (510 nm) van elk monster af met behulp van platen met 96 putjes (150 μL per putje) met behulp van een UV-vis-spectrofotometer.</li>
	<li>Trek de absorptie van controlemonsters (zonder amyloglucosidase) af van de absorptie van experimentele monsters en bereken vervolgens het glycogeengehalte op basis van de D-glucosestandaardcurve.</li>
</ol>5. Bepaling van de ruwe opbrengst, de glycogeenopbrengst en de zuiverheid
<ol><li>Weeg voor de ruwe opbrengst het gevriesdroogde glycogeenmonster en bereken de opbrengst als percentage van het natte leverweefsel. OPMERKING: Deze opbrengst moet worden aangepast om te corrigeren voor de aliquots die in elke stap van het glycogeengehalte worden genomen.</li>
	<li>Bepaal voor de zuiverheid van glycogeen het glycogeengehalte in de uiteindelijke pellets, zoals beschreven in rubriek 4. Bereken de zuiverheid als een percentage van het bepaalde glycogeengehalte ten opzichte van de ruwe opbrengst (zie stap 5.1).</li>
	<li>Bepaal voor de glycogeenopbrengst het glycogeengehalte van de gehomogeniseerde monsters zonder te koken en vóór elke centrifugatie, zoals beschreven in rubriek 4. Bereken de glycogeenopbrengst als percentage van het glycogeengehalte in de uiteindelijke pellets (zie stap 5.2) ten opzichte van het glycogeengehalte dat in het oorspronkelijke homogenaat is bepaald.</li>
</ol>6. Analyse van ketenlengteverdelingen (figuur 4)
<ol><li>Weeg 0,5 mg gevriesdroogd glycogeen af in buisjes van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 90 μL gedeïoniseerd water en 1,5 μL natriumazide (0,04 g/ml) toe aan de buisjes.</li>
	<li>Voeg 5 μL azijnzuurbuffer (0,1 M, pH 3,5) en 2 μL isoamylase-oplossing (180 E/mg) toe aan de buisjes om het glycogeen te onttakken.</li>
	<li>Incubeer de monsters gedurende 3 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 5 μL natriumhydroxideoplossing (0,1 M) toe aan de monsters om de pH te verhogen tot 7,0.</li>
	<li>Vries de monsters in vloeibare stikstof in en vriesdroog (vriesdroog) een nacht.</li>
	<li>Voeg 2 μl APTS-oplossing (5 mg APTS in 50 μl 15% ijsazijn) en 2 μl natriumcyanoborohydride (1 M) toe aan het gevriesdroogde vertakte glycogeen.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 4.000 × g gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Incubeer de monsters bij 60 °C gedurende 3 uur in het donker. NOTITIE: De buis kan worden afgedekt met aluminiumfolie om de inhoud tegen licht te beschermen.</li>
	<li>Voeg 200 μL gedeïoniseerd water toe aan de monsters en draai ze totdat al het neerslag is opgelost.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 4.000 × g .</li>
	<li>Breng aliquots van 50 μl over naar fluorofoorgeassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) microflacons voor analyse. OPMERKING: De gegevens worden weergegeven als de relatieve abundantie van (onttakte) ketens (Nde(X)) voor elke graad van polymerisatie (DP, symbool X).</li>
</ol>7. Analyse van de verdeling van de moleculaire grootte (figuur 5)
<ol><li>Los 0,5 mg gevriesdroogd glycogeen op in 50 mM ammoniumnitraat en 0,02% natriumazide bij 1 mg/ml.</li>
	<li>Incubeer de monsters in een thermomixer bij 80 °C gedurende 3 uur bij 300 rpm.</li>
	<li>Injecteer de monsters in een SEC-systeem met behulp van een voorkolom en 1000 Å en 10.000 Å kolommen bij 80 °C met een debiet van 0,3 ml/min (zie de tabel met materialen). Gebruik een brekingsindexdetector om het relatieve gewicht van moleculen bij elk elutievolume te bepalen.</li>
	<li>Met behulp van pullulan standaarden (PSS) met molaire massa's variërend van 342 tot 1,22 × 106, zet u een SEC universele kalibratiecurve uit om de elutietijd om te rekenen naar Rh (hydrodynamische straal). Druk de gegevens van de differentiële brekingsindex (DRI)-detector uit als een SEC-gewichtsverdeling w (log Rh) als functie van Rh.</li>
</ol>

<ol><li>Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHills%2C+DM+%22Life%3A+the+science+of+biology.+12th+edn%22">Life: the science of biology. 12th edn</a>. Freeeman, W. H. , (2020).</li>
<li>Calder, P. C., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+of+high+molecular+weight+from+mammalian+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle.</a> Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).</li>
<li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes+-+The+organelles+of+glycogen+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li>
<li>Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafine+structure+of+glycogen+macromolecules+in+mammalian-tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).</li>
<li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologie+du+glycogene+-+etude+au+microscope+electronique+de+colorations+negatives+du+glycogene+particulaire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li>
<li>Besford, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li>
<li>Lumsden, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+structure+of+glycogen+in+some+cyclophyllidean+and+trypanorhynch+cestodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes.</a> Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).</li>
<li>Deng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+diabetic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in diabetic liver.</a> Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).</li>
<li>Deng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers%2C+exemplified+by+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular-size+dependence+of+glycogen+enzymatic+degradation+rate+and+its+importance+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Polymer+Journal%22%5BJournal%5D)">The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes.</a> European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+structure+in+type+1+diabetic+mice%3A+towards+understanding+the+origin+of+diabetic+glycogen+molecular+fragility%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+control+of+glycogen+metabolism+in+knockout+mice+lacking+the+muscle-specific+protein+phosphatase+PP1G%2FR-GL%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).</li>
<li>Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inhomogeneity+of+glycogen+as+a+function+of+molecular+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight.</a> Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).</li>
<li>Nahorski, S. R., Rogers, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymic+fluorometric+micro+method+for+determination+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen.</a> Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structural+features+of+glycogen+in+the+kidneys+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats.</a> Carbohydrate Polymers. 229, 115526(2020).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in Escherichia coli.</a> Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Ryu, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structural+analyses+of+purified+glycogen+particles+from+rat+liver%2C+human+skeletal+muscle+and+commercial+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).</li>
<li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-degradative+method+to+purify+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">A new non-degradative method to purify glycogen.</a> Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).</li>
<li>Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+liver+glycogen+extraction+when+considering+molecular+fine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure.</a> Carbohydrate Polymers. 261, 117887(2020).</li>
<li>Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+fine+structure+to+identify+optimal+methods+of+extracting+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Starch+-+Starke%22%5BJournal%5D)">Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch.</a> Starch - Starke. 72, 1900214(2020).</li>
<li>Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+classical+assay+method+for+liver+glycogen+fractions%3A+ASG+is+the+main+and+metabolic+active+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).</li>
<li>Kerly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solubility+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The solubility of glycogen.</a> The Biochemical Journal. 24, 67-76 (1930).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+size-exclusion+chromatography+for+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Improving size-exclusion chromatography for glycogen.</a> Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+glycogen+chain+length+correlates+with+insolubility+in+mouse+models+of+polyglucosan-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases.</a> Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).</li>
<li>Orrell, S. A., Bueding, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+products+obtained+by+various+procedures+used+for+the+extraction+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen.</a> Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+glycogen+alpha-particle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into glycogen alpha-particle formation.</a> Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de structuur van glycogeen belangrijk is voor zijn eigenschappen; De molecuulgrootte beïnvloedt bijvoorbeeld de afbraaksnelheid van glycogeen10 en de ketenlengteverdeling beïnvloedt de oplosbaarheid26. Om deze relaties goed te begrijpen, is het belangrijk om glycogeen te extraheren met een procedure die zoveel mogelijk een representatief en onbeschadigd monster isoleert. Traditionele extractiemethoden maakten gebruik van hete alkalische...

Glycogeen is een complex, hypervertakt polymeer van glucose dat voorkomt in dieren, schimmels enbacteriën1. Bij zoogdieren functioneert leverglycogeen als een bloedglucosebuffer, waardoor de homeostase behouden blijft, terwijl spierglycogeen fungeert als een kortetermijnglucosereservoir om direct energie te leveren2. De structuur van glycogeen wordt vaak beschreven door drie niveaus (weergegeven in figuur 1): 1. Lineaire ketens worden gevormd door glucosemonomeren via (1→4)-α glycosidische bindingen, waarbij vertakkingspunten zijn verbonden via (1→6)-α glycosidische bindingen; 2. sterk vertakte β deeltjes (~20 nm in diameter) die, vooral in weefsels zoals skeletspieren, fungeren als onafhankelijke glycogeenmoleculen 3,4; 3. grotere α glycogeendeeltjes (tot 300 nm in diameter) die bestaan uit kleinere β glycogeeneenheden, die worden aangetroffen in de lever5, hart6 en in sommige niet-zoogdiersoorten7. Lever- α deeltjes van diabetische muizen zijn moleculair kwetsbaar, met de neiging om af te breken tot β-deeltjes wanneer ze worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO), terwijl α deeltjes van niet-diabetische controles over het algemeen onveranderd blijven. Een hypothese is dat deze kwetsbaarheid de slechte bloedglucosebalans bij diabetes kan verergeren, waarbij de fragiele α deeltjes mogelijk resulteren in hogere proporties van het sneller afgebroken β deeltje 8,9,10,11.
Traditionele glycogeenextractiemethoden maken gebruik van de relatief zware omstandigheden waarbij het leverweefsel wordt blootgesteld aan hete alkalische oplossing12 of zure oplossingen zoals trichloorazijnzuur (TCA)13 of perchloorzuur (PCA)14. Hoewel deze methoden effectief zijn in het scheiden van het glycogeen van andere componenten van het leverweefsel, degraderen ze onvermijdelijk de glycogeenstructuur tot op zekere hoogte15,16. Hoewel deze methoden geschikt zijn voor het kwantitatief meten van het glycogeengehalte, zijn ze vanwege deze structurele schade niet ideaal voor studies die gericht zijn op het verkrijgen van structurele informatie over het glycogeen. Sinds de ontwikkeling van deze methoden is een mildere extractieprocedure ontwikkeld die gebruik maakt van koude Tris-buffer (waarvan is aangetoond dat het de afbraak van glucosidase remt) met ultracentrifugatie met sucrosedichtheidsgradiënt 17,18,19. Met een pH-waarde van ~8 wordt het glycogeen bij deze methode niet onderworpen aan de zure of alkalische hydrolyse die in eerdere procedures werd gezien.
Sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie van gehomogeniseerd leverweefsel kan glycogeendeeltjes scheiden van het grootste deel van het celmateriaal. Indien nodig kan aanvullende zuivering worden uitgevoerd door middel van preparatieve grootte-uitsluitingschromatografie, wat resulteert in het verzamelen van gezuiverd glycogeen met aangehechte glycogeen-associërende eiwitten20. Hoewel deze methode, met mildere omstandigheden, meer kans heeft om de structuur van glycogeen te behouden, is het moeilijk om te voorkomen dat een deel van het glycogeen verloren gaat in het supernatant, vooral kleinere glycogeendeeltjes die minder dichtzijn15. Een andere mogelijke oorzaak van glycogeenverlies is dat de mildere omstandigheden enige enzymatische afbraak mogelijk maken, wat resulteert in lagere glycogeenopbrengsten in vergelijking met zwaardere extractiemethoden. Recent onderzoek meldde optimalisatie van de lever-glycogeenextractiemethode om de structuur van glycogeen te behouden21. Hier werden verschillende sucroseconcentraties (30%, 50%, 72,5%) getest om te bepalen of lagere sucroseconcentraties het verlies van kleinere glycogeendeeltjes minimaliseerden. De grondgedachte was dat de lagere dichtheid het mogelijk zou maken dat kleinere, minder dichte deeltjes de sucroselaag zouden binnendringen en zich in de pellet zouden verzamelen met de rest van het glycogeen.
In deze studie werden de extractiemethoden met en zonder een kookstap van 10 minuten vergeleken om te testen of glycogeenafbraakenzymen konden worden gedenatureerd, wat resulteerde in de extractie van meer glycogeen dat ook vrij was van gedeeltelijke afbraak. Verdelingen van de hele moleculaire grootte en de lengteverdelingen van de glycogeenketen werden gebruikt om de structuur van het geëxtraheerde glycogeen te bepalen, vergelijkbaar met een eerder gepubliceerde optimalisatie van zetmeelextractie22. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met differentiële brekingsindex (DRI)-detectie werd gebruikt om de grootteverdelingen van glycogeen te verkrijgen, die het totale molecuulgewicht beschrijven als functie van de molecuulgrootte. Fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) werd gebruikt om de ketenlengteverdelingen te analyseren, die het relatieve aantal glucosideketens van elke gegeven grootte (of mate van polymerisatie) beschrijven. Dit artikel beschrijft de methodologie voor het extraheren van glycogeen uit leverweefsels op basis van de vorige optimalisatiestudie21. De gegevens suggereren dat de methode die het meest geschikt is om de glycogeenstructuur te behouden, een sucroseconcentratie van 30% is met een kookstap van 10 minuten.

<table><tbody><tr><td>8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonaat (APTS)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9341</td><td>0,1 M oplossing</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>695092</td><td>0,1 M, pH 3,5 oplossing</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity SEC systeem</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>Grootte-exclusiechromatografie (SEC)</td></tr><tr><td>BKS-DB/Nju achtergrondmuizen</td><td>Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose Assay Kit (GOPOD-formaat)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td></td></tr><tr><td>Etheen-dinitrilotetraazijnzuur (EDTA)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>IKA</td><td>T 25</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>2104</td><td>0,1 M oplossing</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>2104</td><td>0,1 M oplossing</td></tr><tr><td>P/ACE MDQ plus systeem</td><td>Ab Sciex, US</td><td></td><td>Fluorofoor-geassisteerde koolhydraat-elektroforese (FACE)</td></tr><tr><td>Brekingsindexdetector</td><td>Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)</td><td></td><td>Grootte-exclusiechromatografie (SEC)</td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>241245</td><td>1 M, pH 4,5 oplossing</td></tr><tr><td>Natriumazide</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydride</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>156159</td><td>1 M oplossing</td></tr><tr><td>Natriumfluoride</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>43617</td><td>0,1 M oplossing</td></tr><tr><td>Natriumnitraat</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>NISTRM8569</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrofosfaat</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>V90016</td><td></td></tr><tr><td>SUPREMA pre-kolom, 1.000 en 10.000 kolommen</td><td>Polymer Standards Services, Mainz, Duitsland</td><td></td><td>Grootte-exclusiechromatografie (SEC)</td></tr><tr><td>Trizma</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T 1503</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuizen</td><td>Beckman</td><td></td><td>4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm</td></tr></tbody></table>

de extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Leverglycogeen is een hypervertakt glucosepolymeer dat betrokken is bij het op peil houden van de bloedsuikerspiegel bij dieren. De eigenschappen van glycogeen worden beïnvloed door de structuur. Daarom is een geschikte extractiemethode die representatieve glycogeenmonsters isoleert, cruciaal voor de studie van dit macromolecuul. In vergelijking met andere extractiemethoden kan een methode die gebruik maakt van een centrifugatiestap met sucrosedichtheidsgradiënt moleculaire schade minimaliseren. Op basis van deze methode wordt in een recente publicatie beschreven hoe de dichtheid van de sucrose-oplossing die tijdens het centrifugeren werd gebruikt, werd gevarieerd (30%, 50%, 72,5%) om de meest geschikte concentratie te vinden om glycogeendeeltjes van een grote verscheidenheid aan groottes te extraheren, waardoor het verlies van kleinere deeltjes werd beperkt. Er werd een kookstap van 10 minuten geïntroduceerd om het vermogen te testen om glycogeenafbrekende enzymen te denatureren, waardoor glycogeen behouden blijft. De laagste sucroseconcentratie (30%) en de toevoeging van de kookstap bleken de meest representatieve glycogeenmonsters te extraheren.

Hoewel de hierboven beschreven procedure voor de meest optimale methode is (30% sucrose met toevoeging van een kookstap van 10 minuten), worden hier gegevens verstrekt voor glycogeen dat wordt geëxtraheerd via drie sucroseconcentraties (30%, 50%, 72,5%), met en zonder kookstap, zoals eerder beschreven21. Volgens het protocol worden de zuiverheid, de ruwe opbrengst en de glycogeenopbrengst van droog glycogeen dat onder verschillende omstandigheden wordt geëxtraheerd, gegeven in tabel 1</str...

Voor de extractie van leverglycogeen werd een optimale sucroseconcentratie bepaald met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. De toevoeging van een kookstap van 10 minuten om glycogeenafbrekende enzymen te remmen, bleek gunstig.

De extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Dit protocol maakt het mogelijk om de glycogeenmoleculen van de lever te extraheren op een manier die hun structuur behoudt en de hoeveelheid kleine glycogeendeeltjes die verloren gaan, beperkt. Met eerder onderzoek dat aantoont dat diabetes de glycogeenstructuur verandert, zou deze methode kunnen helpen bij het bestuderen van diabetes en de verschillende glycogeenopslagziekte. Om glycogeen uit de lever te halen, begint u met het overbrengen van één gram bevroren leverweefsel naar een buis van 15 milliliter met zes milliliter glycogeenisolatiebuffer.Terwijl u het op ijs bewaart, homogeniseert u het leverweefsel met behulp van een weefselhomogenisator. Als je klaar bent, breng je de helft of drie milliliter van de celsuspensie over in een nieuwe buis, gevolgd door 10 minuten koken. Bewaar de andere helft van de suspensie op ijs om glycogeenbevattende geassocieerde eiwitten te extraheren die niet gedenatureerd zijn.Voor de bepaling van het glycogeengehalte verwijdert u een aliquot van acht microliter uit elk buisje en houdt u het buisje op ijs. Nadat de resterende suspensie gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius bij 6.000 G is gedraaid, brengt u het supernatans over in ultracentrifugebuisjes om ze gedurende 90 minuten bij 3,6 maal 10 tot de vijfde G en vier graden Celsius te centrifugeren. Nadat u de resterende supernatanten hebt weggegooid, resuspendeert u de pellets in 1,5 milliliter glycogeenisolatiebuffer.Leg de monsters vervolgens over 1,5 milliliter 30% sucrose-oplossing in vier milliliter ultracentrifugebuisjes, gevolgd door centrifugeren zoals eerder beschreven gedurende twee uur. Nadat u de supernatanten hebt weggegooid, resuspendeert u de pellets in 200 microliter gedeïoniseerd water. Om glycogeen uit de celsuspensie neer te slaan, voegt u 800 microliter absolute ethanol toe aan de celsuspensies en mengt u goed.Bewaar de mengsels vervolgens minimaal een uur bij min 20 graden Celsius om neerslag mogelijk te maken. Zodra er neerslag is opgetreden, centrifugeert u de monsters bij 6.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en resuspendeert u de glycogeenpellet in 200 microliter gedeïoniseerd water om het ethanolneerslagproces driemaal te herhalen. Verwijder uit de uiteindelijke celsuspensie een aliquot van acht microliter uit elk buisje voor de bepaling van het glycogeengehalte.Vries vervolgens de resterende supernatanten in vloeibare stikstof in en vries ze een nacht droog. Bewaar de gedroogde glycogeenmonsters de volgende dag in de vriezer bij min 20 graden Celsius. De studie analyseerde de zuiverheid, de ruwe opbrengst en de glycogeenopbrengst van het gedroogde glycogeenmonster dat onder verschillende omstandigheden werd geëxtraheerd.Er waren geen significante verschillen in ruwe opbrengst en glycogeenopbrengst tussen de groepen die onder de verschillende omstandigheden werden geëxtraheerd. Daarentegen werd de glycogeenzuiverheid aanzienlijk beïnvloed door de sucroseconcentraties en de toevoeging van een kookstap. Glycogeen met de hoogste zuiverheid werd geëxtraheerd met behulp van de 30% sucroseconcentratie en een kookstap van 10 minuten.Glycogeen werd geëxtraheerd uit het leverhomogenaat met 30%50% of 72,5% sucrose, gekookt of ongekookt, om de effecten van de verschillende omstandigheden op de grootte van de moleculen in het uiteindelijke extract te beoordelen. Ketenlengteanalyse werd uitgevoerd op zes levers voor zowel gekookt als ongekookt, met behulp van 30%50%en 72,5%sucroseconcentraties. Het gehalte aan de glycogeenmoleculen of bètadeeltjes met een hydrodynamische straal, RV, lager dan 30 nanometer werd berekend.De gekookte monsters hadden lagere gemiddelde RV-waarden en een hoger deeltjesgehalte dan de ongekookte monsters. Ook resulteerden lagere sucroseconcentraties in lagere RV-waarden en hogere bètadeeltjesgehalten. De introductie van een kookstap leidde ook tot lagere RV max of de maxima-waarden, terwijl de sacharoseconcentratie geen significant effect had.Zorg ervoor dat het weefsel volledig gehomogeniseerd is en dat er geen stukjes weefsel meer over zijn. Deze techniek maakt dus de weg vrij voor ons om te onderzoeken welke paden de kleinere bètadeeltjes met elkaar verbinden om de grotere alfadeeltjes te vormen.

the-extraction-liver-glycogen-molecules-for-glycogen-structure

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we describe a qualitative spectrophotometric assay to determine the extent of branching in a glycogen sample with an uncharacterized structure. Comparing the absorbance maxima of the uncharacterized sample with that of polysaccharides with known branched structures indicates the presence of branching in the uncharacterized sample.

Glycogen Branching Assay to Measure the Degree of Glycogen Branching

In this video, we demonstrate the sample preparation of human skeletal muscle tissue and its staining for transmission electron microscopy to visualize and quantify subcellular glycogen distribution.

Transmission Electron Microscopy to Quantify Glycogen Distribution in Human Skeletal Muscles

We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische methode voor titratie van glycogeen in vitro. Deze techniek gebruikt de Abcam Glycogen testkit en is gebaseerd op opeenvolgende hydrolyse van glycogeen tot glucose en glucose titratie van fluorescentie.

Biochemische Titratie van glycogeen<em&gt; In vitro</em

Periodienzuur-Schiff-kleuring is een techniek die het polysacharidegehalte van weefsels visualiseert. Dit artikel demonstreert het protocol voor periodienzuur-Schiff-kleuring dat is aangepast voor gebruik op mononucleaire cellen uit perifeer bloed, gezuiverd uit menselijk veneus bloed. Dergelijke monsters zijn verrijkt met lymfocyten en andere witte bloedcellen van het immuunsysteem.

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Hier presenteren we een betrouwbare en gemakkelijke analyse om het glycogeengehalte in cyanobacteriële cellen te meten. De procedure omvat precipitatie, selecteerbare depolymerisatie en de detectie van glucose residuen. Deze methode is geschikt voor zowel wildtype als genetisch gemanipuleerde stammen en kan de metabolische techniek van cyanobacteriën vergemakkelijken.

Bepaling van het glycogeengehalte in cyanobacteriën

Technieken om de activiteit van belangrijke enzymen van glycogeenmetabolisme te meten, worden gepresenteerd, met behulp van een eenvoudige spectrofotometer die in het zichtbare bereik werkt.

Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Een aangepaste postfixatieprocedure verhoogt het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol dat beschrijft hoe het weefsel moet worden behandeld, de beeldvorming moet worden uitgevoerd en stereologische methoden moeten worden gebruikt om onbevooroordeelde en kwantitatieve gegevens te verkrijgen over vezeltypespecifieke subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspieren.

Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie

In het huidige protocol wordt de Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) techniek gebruikt om de ketenlengteverdeling (CLD) en de gemiddelde ketenlengte (ACL) van glycogeen te bepalen.

Bepaling van de glucaanketenlengteverdeling van glycogeen met behulp van de fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) -methode

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen om rigoureuze en reproduceerbare metingen van zowel glycogeen- als N-gekoppelde glycanen mogelijk te maken met behulp van massaspectrometriebeeldvorming.

Ruimtelijke moleculaire beeldvorming van het glyaom met behulp van massaspectrometrie

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

Leer een geoptimaliseerde methode voor de extractie van leverglycogeen die de structuur behoudt en verlies van kleine deeltjes minimaliseert. Dit protocol met kookstap ondersteunt onderzoek naar diabetes en glycogeenstapelingsziekten.

De extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur

Meer video's verkennen