Name: Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer een labelvrije MALDI-TOF massaspectrometrie-methode voor uracil-DNA glycosylase-assay. Deze techniek detecteert direct massaveranderingen van substraat naar AP-product met hoge specificiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) en het NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan, R.O.C. [subsidienummer MOST109-2314-B-002 -186 naar K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 naar S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 naar W.-h.F.]. H.-L.C. is een ontvanger van een doctoraatsbeurs van de National Taiwan University. Financiering voor open access charge: Ministerie van Wetenschap en Technologie, R.O.C.

1. Voorbereiding van substraat/sjabloon
<ol><li>Ontwerp uracil substraat/sjabloon duplex met een gebalanceerd G+C gehalte van ~50 ± 10% en minimale smelttemperatuur van 50 °C voor het duplexgebied. OPMERKING: Eén nucleotideverschil tussen 18 nt substraten en 19 nt sjablonen (tabel 1 en figuur 1) helpt een betere ms-signaalinterpretatie en de juiste gloeiing. De sjabloonstreng dient als aanvullend DNA om A-U- of G-U-mismatches te genereren (tabel 1), maar kan ook worden gebruikt als referentiesignaal in MS-metingen. Het gebruik van HPLC-gezuiverde synthetische oligonucleotiden is bevredigend voor deze studie.</li>
	<li>Los DNA op in 1 mM EDTA en 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C) (TE) in een concentratie van 100 μmol/L als bouillon en bewaar bij -20 °C. Verdun deze voorraad van 20 μL met TE tot een eindvolume van 800 μL (25-voudige verdunning tot 4 μmol/L). Meet de absorptie van de DNA-oplossing in een UV-zichtbare spectrofotometer bij λ = 260 nm om de toegewezen concentratie van de fabrikant te garanderen. Bijvoorbeeld: A260 = 0,204 voor 4 μmol/L U+9 en A260 = 0,192 voor 4 μmol/L T1 (tabel 1).</li>
	<li>Voer MALDI-TOF MS-analyse (secties 4-6) uit voor oligonucleotidekwaliteitscontrole door unieke pieksignalen te inspecteren bij aangewezen m/z-waarden en door te controleren of de signaal-ruisverhouding >100 is (figuur 1B en figuur 1D).</li>
</ol>2. DNA-glycosylasetest
<ol><li>Gebruik een G:U-substraat van T1/U+9 duplex (tabel 1 en figuur 1A) voor de glycosylasereactie, bijvoorbeeld in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg 70 μl H2O, 10 μl 10x UDG-reactiebuffer, 5 μl T1-voorraad en 5 μl U+9-voorraad toe (stap 1.2.). OPMERKING: Kies het juiste type micropipette en volg de instructies van de fabrikant om het vereiste volume te verwerken. Gebruik bijvoorbeeld een pipet van 2 μL om 0,1-2 μL vloeistof af te geven, gebruik een pipet van 10 μL om 2-10 μL vloeistof af te geven en gebruik een pipet van 100 μL om 20-100 μL vloeistof af te geven om de nauwkeurigheid en precisie van de resultaten te garanderen. Het beschreven volume van het reagensmengsel is voor 10 assays; pas het volume aan voor het gewenste aantal reacties. De 1x UDG-reactiebuffer bevat 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol en 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C). Zie de tabel met materialen voor de bron van 10x UDG-reactiebuffer.</li>
	<li>Sluit de buis veilig af; incubeer in een waterbad gedurende 30 minuten bij 65 °C, vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C en ten slotte gedurende 3 minuten op ijs om een goede gloeiing van het substraat / sjabloon duplex te garanderen.</li>
	<li>Voeg in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml 49 μl ijskoude 1x UDG-reactiebuffer en 1 μl UDG (5.000 eenheden /ml; zie de materialentabel), verdunnend tot 0,1 eenheden / μL. Maak seriële verdunningen met 1x UDG-buffer tot de gewenste enzymconcentraties van 0,05, 0,02 of 0,01 eenheden / μL. Houd de verdunde UDG altijd op ijs. OPMERKING: In een reactie van 10 μL kunnen 0,1 eenheden UDG in 3 minuten meer dan 30 pmol uracil uit een T1/U+9 duplex splijten.</li>
	<li>Voeg in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml 9,0 μl substraatmengsel uit stap 2.2 toe en verwarm de buis voor tot 37 °C. Voeg 1,0 μL van de verdunde UDG uit stap 2.3 toe. Gebruik een timer om de reactie te timen en veeg op de buis om de inhoud te mengen. OPMERKING: Voor een eenheidsdefinitietest is de incubatietijd 30 min. Gebruik voor een kinetische test een tijdsverloopanalyse van 0,5, 1, 2, 3, 5 minuten om de initiële snelheid te verkrijgen. Voor een UGI-remmingstest, time de reactie gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen met het reactiemengsel gedurende 3-5 s bij 3.200 × g bij omgevingstemperatuur. Breng de reactie vervolgens onmiddellijk over op 37 °C.</li>
	<li>Beëindiging van de reactie
	<ol>
<li>Bereid oplossingen voor van 0,25 M HCl en 0,23 M Tris basis. Voeg in een reageerbuis van 15 ml 10 ml van een oplossing van 1 mM EDTA en 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C) toe om 1x UDG-reactiebuffer na te bootsen. Verzuren met 1 ml van 0,25 M HCl en controleer met een pH-meter of de pH ~2 ± 0,5 is. Neutraliseer met 1 ml van 0,23 M Tris-basis en controleer met een pH-meter op een uiteindelijke pH van 6,5 ± 0,5. OPMERKING: Het gebruik van pH-teststrips is een snelle en eenvoudige manier om de pH-waarden van het reagensmengsel opnieuw te bevestigen.</li>
		<li>Voeg 1 μL van 0,25 M HCl toe om het 10 μL reactiemengsel te verzuren om het enzym te inactiveren en plaats het gedurende 6 minuten op ijs. Voeg 1 μL van 0,23 M Tris base toe om de DNA-producten te neutraliseren om te voorkomen dat de AP-site breekt door langdurige blootstelling aan zuur. Voeg 13 μL TE toe om het volume van het productmengsel te vergroten voor matrixchipoverdracht en plaats het vervolgens op ijs. OPMERKING: Het AP-product is chemisch instabiel en moet binnen 2 dagen door MALDI-TOF MS worden geanalyseerd. Na langdurige opslag gedurende meer dan een week treedt de accumulatie van een aanzienlijk deel van de strengbreuken op als gevolg van β/δ eliminatiereacties van de AP-producten (figuur 1D-G).</li>
	</ol></li>
	<li>Breng alle 25 μL UDG-reactieproducten over van microcentrifugebuizen naar een 384-well microtiterplaat. OPMERKING: Hoge concentraties kationen, zoals natrium of kalium in buffers, veroorzaken interferentie in de MALDI-TOF MS-analyse en vereisen dus ontzouting. Omdat E. coli UDG-reactiebuffer zeer lage concentraties kationen bevat, is ontzouting niet nodig. Wijzig dit protocol echter om andere DNA-glycosylasereacties te meten die metaalkationen bevatten die ontzouting vereisen zoals eerder beschreven35.</li>
</ol>3. Breng UDG-reactieproducten over naar een matrixchip
<ol><li>Open de deur van de nanoliterdispenser (zie de tabel met materialen) en laad de 384-well microtiterplaat vanaf stap 2.7 op de plaathouder van het dek.</li>
	<li>Plaats de matrixchiparray in de overeenkomstige verkennerplaatpositie. Plaats de geladen scoutingplaat op het verwerkingsdek van de nanoliterdispenser en sluit de deur.</li>
	<li>Raak de run-knop op het overdrachtsscherm aan en wacht tot het instrument begint met het doseren van monsters van de 384-well microtiterplaat naar de matrixchip.</li>
	<li>Gebruik de tabbladoptie Vision om het beeld van de chip en de doseervolumes voor elke plek tijdens het doseren weer te geven. Zorg ervoor dat het gevlekte volume op de chip in het bereik van 5-10 nL ligt.</li>
</ol>4. Stel de testparameters in op de massaspectrometer
<ol><li>Gebruik het toepassingsprogramma (zie de tabel met materialen) om een .xlsx bestand met de voorspelde signaal m/z-waarde voor te bereiden voor het importeren. OPMERKING: De instellingen in FILE I.xlsx (tabel 2) zijn voorbeeldinstellingen voor de UDG-assay van G:U-substraat in sectie 2.</li>
	<li>Gebruik het toepassingsprogramma om een nieuwe UDG-test te maken en te definiëren door met de rechtermuisknop op de optie Import Assay Group in Designer Format te klikken en het .xlsx bestand te selecteren in de vervolgkeuzelijst (bijvoorbeeld FILE I.xlsx uit stap 4.1).</li>
	<li>Klik met de rechtermuisknop op de knop Klant:Project:Plaat en klik bovenaan de vervolgkeuzelijst om een nieuwe testplaat vast te stellen. Typ in het dialoogvenster een bestandsnaam (bijvoorbeeld CTT20210620 voor de labcode en testdatum) en selecteer in de vervolgkeuzelijst plaattype het type plaat met 384 bronnen en druk op OK. Zoek naar een lege plaat aan de rechterkant van het scherm.</li>
	<li>Klik op de optie Assay ; selecteer de test (bijvoorbeeld FILE I.xlsx) in de vervolgkeuzelijst.</li>
	<li>Als u de geselecteerde test (bijvoorbeeld FILE I.xlsx) wilt toewijzen aan elke positie van de monstervlek op de plaat, verplaatst u de cursor naar elke positie van de lege plaat, klikt u om het putje te markeren en klikt u met de rechtermuisknop om Plex toevoegen te selecteren.</li>
	<li>Gebruik een desktop- of laptopcomputer om een werklijst op te stellen in .xlsx indeling zonder koptekst (bijvoorbeeld 0620.xlsx van tabel 3) voor alle voorbeelden op de chip uit stap 2.7. Klik op de knop Nieuw voorbeeldproject toevoegen ; selecteer het bestand (bijvoorbeeld 0620.xlsx) in de vervolgkeuzelijst om de werklijst te importeren.</li>
	<li>Zoek naar alle testvoorbeeldcodes in de werklijst (bijvoorbeeld van 0620.xlsx) aan de linkerkant van het scherm. Klik op de voorbeeldcode in de werklijst en klik met de rechtermuisknop op de overeenkomstige positie van de plaat om de tests aan elke positie te koppelen.</li>
</ol>5. Werking van de massaspectrometer
<ol><li>Gebruik het toepassingsprogramma om de massaspectrometer (zie de tabel met materialen) te koppelen aan de monsterchip (uit sectie 3) die moet worden geanalyseerd.</li>
	<li>Klik op de standaardinstelling. Typ in het dialoogvenster een bestandsnaam uit stap 4.3 (bijvoorbeeld CTT20210620); in de experimentnaam, typ de chip-id in de chipcode en sla de instellingen op.</li>
	<li>Start het besturingsprogramma van de massaspectrometer (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Druk op de in/uit-knop van de massaspectrometer en laat het dek uitschuiven. Haal de chiphouder eruit en steek de monsterchip uit stap 3.4 in de chiphouder. Plaats de geladen spaanhouder op het verlengde dek en druk op de in/uit-knop om de samplechip in het instrument te laten komen.</li>
	<li>Dubbelklik op het pictogram Aanschaffen van het toepassingsprogramma. Klik in het venster Acquire op het tabblad Auto Run om het instrument te starten en massaspectra te verkrijgen van de monsters op de chip.</li>
</ol>6. Massaspectra bekijken en de gegevens analyseren
<ol><li>Voer het data-analyseprogramma uit (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Blader door de databasestructuur en selecteer de chip-id uit stap 5.2. Klik om een doelput op de chip te markeren en klik op het spectrumpictogram om het massaspectrum weer te geven.</li>
	<li>Klik met de rechtermuisknop om Aanpassingsdialoogvenster te kiezen om een specifiek spectrumbereik bij te snijden in een nieuw venster. Klik op de X-as om de boven- en ondergrens van m/z in te voeren en druk op OK om het opgegeven bereikspectrum weer te geven, inclusief de signalen van belang. OPMERKING: De hoeveelheid DNA is evenredig met de piekintensiteit bij elke m/z-waarde-eenheid.</li>
	<li>Meet de piekhoogte van de m/z-waarden van de signalen die overeenkomen met U-substraat, AP-product en sjabloon. Klik op de piek en bekijk de piekhoogte in de linkerbovenhoek van het scherm. OPMERKING: Een spectrum van 1.600 breedte / 1.200 eenheden is een redelijke afmeting voor inspectie op een computerscherm en voor het bijhouden van gegevens.</li>
	<li>Als u het spectrum wilt opslaan voor archivering, klikt u met de rechtermuisknop op Exporteren en selecteert u JPEG-bestandstype in de vervolgkeuzelijst. Klik op Bestemming en Bladerschijf om het opslagapparaat in de vervolgkeuzelijst te selecteren (bijv. Flash disc E:). Typ de bestandsnaam (bijvoorbeeld 0620_1-2.jpg) en klik op Exporteren.</li>
	<li>Druk indien nodig een geëxporteerd JPEG-bestand af en meet de piekhoogte handmatig met een liniaal.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dit artikel biedt een gedetailleerde procedure voor het gebruik van een UDG MALDI-TOF MS-testmethode om AP-bevattende DNA-producten direct te detecteren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat uracil-bevattende substraten labelvrij, schaalbaar, gemakkelijk om mee te werken zijn en meer flexibiliteit bieden in substraatontwerp.
De door de leverancier aanbevolen fenol/chloroform-extractie van UDG maakt inactivatie van het enzym mogelijk om afbraak van product-DNA te voorkomen. Het ...

Hoewel uracil een normale base is in RNA, is het een veel voorkomende en zeer mutagene laesie in genomisch DNA. Uracil kan ontstaan door spontane/enzymatische hydrolytische deaminering van een deoxycytidine. In elke levende cel vindt deze deaminering 100-500 keer per dag plaats onder fysiologische omstandigheden1,2. Als deze veranderingen niet worden gerepareerd, kan er een verandering in de samenstelling van de DNA-sequentie optreden, waardoor mutatie ontstaat. Omdat uracil in DNA de voorkeur geeft aan paring met dATP tijdens replicatie, als cytosine deaminateert naar uracil, in twee replicatiegebeurtenissen, zal er een nieuwe G: C naar A: T overgangsmutatie zijn in de helft van het nageslacht DNA3.
Onder de cellulaire strategieën om de genetische stabiliteit te behouden, is base excision repair (BER) een essentieel mechanisme dat beschadigde basen, zoals uracil, in DNA4 herstelt. BER is een zeer evolutionair geconserveerd proces. Er zijn twee algemene BER-routes: de korte-patch pathway die leidt naar een reparatiekanaal van een enkel nucleotide en de long-patch pathway die een repair tract van ten minste twee nucleotiden produceert5. BER is een gecoördineerd mechanisme dat in verschillende stappen plaatsvindt. De eerste stap in BER is de enzymatische hydrolyse van de beschadigde nucleotidebasis door een schadespecifiek DNA-glycosylase om een apurine / apyrimidinische (AP) tussenliggende plaats te genereren6. Dit wordt gevolgd door de splitsing van de suiker-fosfaat ruggengraat op de AP-site door een endonuclease, opschoning van de DNA-uiteinden door een lyase, gap-vulling door een DNA-polymerase en het afdichten van de laatste nick door een ligase5.
Uracil-DNA glycosylase (UDG) hydrolyseert het uracil uit uracil-bevattend DNA voor BER in Escherichia coli. Conventionele UDG-testen met behulp van radioactief gelabeld DNA met verschillende scheidingstechnieken6,7,8,9,10,11,12,13 zijn meestal tijdrovend, arbeidsintensief, met dure etiketteringsreagentia, gecompliceerde procedures en vereisen intensieve training en oefening om de risico's van blootstelling aan radioactieve materialen te verminderen. Fluorometrische oligonucleotide assays zijn ontwikkeld als vervanging voor radio-isotoop labeling14, naast moleculaire bakens en Förster resonantie energieoverdracht technologie15,16,17,18,19,20. Voor alle bovengenoemde methoden is echter specifieke etikettering vereist. Onlangs zijn labelvrije biosensoren getest21,22,23 en colorimetrische methoden op basis van de vorming van een G-quadruplex24,25,26. Meerdere A: U-paren of speciaal ontworpen sequenties in de sondes bemoeilijken echter de definitie van enzymeenheden.
MALDI-TOF MS is een technologie die van groot nut kan zijn bij DNA-analyse. Ontwikkelde toepassingen omvatten single-nucleotide polymorfisme genotypering27,28, gemodificeerde nucleotideanalyse29 en DNA-reparatie intermediaire identificatie30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS moet gemakkelijk worden gebruikt voor DNA-glycosylaseanalyse om AP-site-bevattende DNA-producten te detecteren. AP-sites in DNA zijn echter gevoelig voor strengbreuk onder veel experimentele omstandigheden33. Een UDG-test wordt hier gepresenteerd met behulp van MALDI-TOF MS om de productie van AP-locaties rechtstreeks te meten zonder significant strengbreukgeluid. Deze labelvrije methode is gemakkelijk om mee te werken en heeft een hoog potentieel voor de farmaceutische toepassing van DNA-glycosylaseremmerscreening.

<table><tbody><tr><td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td><td>J.T baker</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Geautoclaveerd gedeïoniseerd water</td><td>MILLIPORE</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T Baker</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>AQUAGLOVE</td><td></td><td>Protocol 1,2,3</td></tr><tr><td>Zoutzuur (HCl)</td><td>SIGMA</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>Pipettippunten met lage retentie(0,5-10 &micro;L)</td><td>extra gene</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Pipettippunten met lage retentie(1.250 &micro;L)</td><td>national scientific supply co, Inc.</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Pipettippunten met lage retentie(200 &micro;L)</td><td>national scientific supply co, Inc.</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>&nbsp;Agena Bioscience, CA</td><td></td><td>Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>AAT Bioquest, Inc.</td><td>RS1000</td><td>Protocol 3</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Kubota</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Clubio</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuis (1,5 mL)</td><td>National scientific supply co, Inc.</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjesrek</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Micropipet (P1000)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Micropipet (P2)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Micropipet (P10)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Micropipet (P100)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Micropipet (P200)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Micropipet (SL2)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Oligonucleotiden</td><td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td><td></td><td>Protocol 1,2</td></tr><tr><td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td><td>AAT Bioquest, Inc.</td><td></td><td>Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>WAKO</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>SpectroCHIP array</td><td>&nbsp;Agena Bioscience, CA</td><td>#01509</td><td>Protocol 3, 5</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>Typer 4.0 software</td><td>&nbsp;Agena Bioscience, CA</td><td>#10145</td><td>Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td></tr><tr><td>UDG Reactiebuffer (10x)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B0280S</td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0281S</td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>Uracil-DNA Glycosylase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0280L</td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>UV-VISBLE spectrofotometer UV-1601</td><td>SHIMADZU</td><td></td><td>Protocol 1</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr></tbody></table>

uracil-dna glycosylase assay door matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is een belangrijk onderdeel in de base excisie reparatie route voor de correctie van uracil gevormd door hydrolytische deaminering van cytosine. Het is dus cruciaal voor het behoud van de genoomintegriteit. Een zeer specifieke, niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode werd ontwikkeld om UDG-activiteit te meten. Een synthetische DNA-duplex met een site-specific uracil werd gesplitst door UDG en vervolgens onderworpen aan Matrix-assisted Laser Desorption / Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analyse. Er werd een protocol opgesteld om het apurine/apyrimidinische site (AP) product in DNA te bewaren zonder strengbreuk. De verandering in de m/z-waarde van het substraat naar het product werd gebruikt om uracilhydrolyse door UDG te evalueren. Een G:U-substraat werd gebruikt voor UDG-kinetische analyse die de Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s en Kcat = 9,31 s-1 opleverde. Toepassing van deze methode op een uracilglycosylaseremmer (UGI)-test leverde een IC50-waarde van 7,6 pM op. De UDG-specificiteit met behulp van uracil op verschillende posities binnen enkelstrengs en dubbelstrengs DNA-substraten toonde verschillende splitsingsefficiënties. Deze eenvoudige, snelle en veelzijdige MALDI-TOF MS-methode zou dus een uitstekende referentiemethode kunnen zijn voor verschillende monofunctionele DNA-glycosylasen. Het heeft ook het potentieel als een hulpmiddel voor DNA-glycosylaseremmer screening.

Sjablonen en substraten Met synthetische oligonucleotiden met U in het midden (U+9) in combinatie met een G-sjabloon als voorbeeld (figuur 1A), kan een blanco controle van equimolaire hoeveelheden sjabloon- en uracilbevattend substraat worden gebruikt voor kwaliteitscontrole van synthetische oligonucleotidezuiverheid (figuur 1B; de signalen komen overeen met de aangewezen m /z en de lage achtergrondruis). Voor de MS-data-analyse zijn de piekh...

Een niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode om uracil-DNA glycosylase activiteit te testen werd ontwikkeld met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie voor directe apurine / apyrimidinische site-bevattende productanalyse. De test bleek vrij eenvoudig, specifiek, snel en gemakkelijk te gebruiken voor DNA-glycosylasemeting.

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

DNA-reparatiemechanismen zijn erg belangrijk voor het behoud van de genoomintegriteit in alle levende organismen. Uracil-DNA glycosylase is een cruciaal DNA-reparatie-eiwit in de basisweefselherstelroute. Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie kunnen we AP-producten direct detecteren voor enzymactiviteitstests.Conventionele glycosylase-assay vereist substraatarbeid. Deze methode is labelvrij en detecteert direct de massaverandering van een uracilsubstraat naar AP-product. Andere voordelen zijn hoge specificiteit, veelzijdigheid, schaalbaarheid, snelheid en eenvoudig uit te voeren.We hebben E.coli uracil-DNA glycosylase als voorbeeld gebruikt. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor andere DNA-glycosylase-assays. Goed opgeleid laboratoriumpersoneel met nauwkeurige pipetteer- en verdunningsvaardigheden zijn essentieel.Vers bereide reagentia en zoutbuffers met een laag zoutgehalte moeten worden gebruikt voor betere signalen en minder achtergrondgeluid. De procedure wordt gedemonstreerd door Hui-Lan Chang, een promovendus uit mijn laboratorium. Voeg voor een DNA-glycosylasetest met behulp van guanine-uracilbasisdragend substraat van T1 U +9 duplex 70 microliter water, 1

uracil-dna-glycosylase-assay-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De urease de methode van monstervoorbereiding voor GC / MS analyse van intermediaire metabolieten wordt gepresenteerd door de uitvinder ervan. De methode maakt een stap-follow-up van de pasgeboren screening op aangeboren afwijkingen door tandem massaspectrometrie door het kwantificeren van koolhydraten, organische en aminozuren allemaal in een enkel proces.

Een stap Metabolomica: Koolhydraten, organische-en aminozuren gekwantificeerd in een uniforme procedure

Een moleculaire bundel gekoppeld aan afstembare vacuüm ultraviolet foto-ionisatie massaspectrometer in een synchrotron is een handige tool om de elektronische structuur van geïsoleerde gasfase moleculen en clusters te verkennen. Proton overdracht mechanismen in DNA-base dimeren werden toegelicht aan deze techniek.

Moleculaire Beam massaspectrometrie met afstelbare Vacuum Ultraviolet (VUV) Synchrotron Radiation

Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor de solide fase synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA gemodificeerd op de C2'- O- positie. UV-vis en cirkelvormige dichroïstische fotometrische analyses worden gebruikt om structurele aspecten te kwantificeren en karakteriseren, dwz enkelstrengen of dubbelstrengen.

Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme

Hier presenteren we een protocol voor een efficiënte Macrostap zuivering van de actieve niet-gelabelde mens tien-elf translocatie-2 (TET2) 5-methylcytosine-dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie- en haar kwantitatieve analyse met behulp van een vloeibare chromatografie-tandem-massa spectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde aanpak.

Efficiënte reiniging en LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling voor tien-elf translocatie-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

Hier presenteren we een protocol voor DNAzyme-afhankelijke splijting van RNA. Dit maakt een snelle en site-afhankelijke analyse van RNA 2 '-O-Methylation mogelijk. Deze aanpak kan worden gebruikt voor de voorlopige of belangrijke beoordeling van de activiteit van snoRNA.

DNAzyme-afhankelijke analyse van rRNA 2 '-O-methylatie

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

Hier beschrijven we twee modificaties van de DNA-vezeltest om enkelstrengs DNA-hiaten te onderzoeken bij het repliceren van DNA na laesie-inductie. De S1-vezeltest maakt de detectie van post-replicatieve hiaten mogelijk met behulp van het ssDNA-specifieke S1-endonuclease, terwijl de gap-filling assay visualisatie en kwantificering van gap repair mogelijk maakt.

Detectie van post-replicatieve hiaten accumulatie en reparatie in menselijke cellen met behulp van de DNA-vezeltest

MALDI-TOF werd gebruikt om fragmenten te karakteriseren die werden verkregen uit de reactiviteit tussen geoxideerd RNA en het exoribonuclease Xrn-1. Dit protocol beschrijft een methodiek die toepasbaar is op andere processen waarbij RNA en/of DNA betrokken is.

Identificatie van RNA-fragmenten als gevolg van enzymatische degradatie met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de afgifte van O-glycanen uit mucines en de daaropvolgende ontzouting, permethylering en analyse met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie.

Profilering van gepermethyleerde mucine O-glycanen met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie

Leer een labelvrije MALDI-TOF massaspectrometrie-methode voor uracil-DNA glycosylase-assay. Deze techniek detecteert direct massaveranderingen van substraat naar AP-product met hoge specificiteit.

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Meer video's verkennen