Verzameling, uitbreiding en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcelmodellen voor kwantificering van Cilia Beat Frequency

We beschrijven de verzameling luchtwegstamcellen uit neusslijmvlies. Deze cellen worden in het lab uitgebreid en gedifferentieerd tot een pseudostratified epitheel. Dit is in vitro expansie en differentiatie, wat vergelijkbaar is met onze luchtwegen in vivo, wat betekent dat er gespecialiseerde cellen, zoals trilhaarcellen, aanwezig zijn die kunnen worden gebruikt voor het kwantificeren van de trilhaarslagfrequentie.

Om een consistente en reproduceerbare kwantificering van de trilhaarslagfrequentie tussen verschillende individuen en in reactie op verschillende geneesmiddelen mogelijk te maken, standaardiseren we kweekomstandigheden en beeldacquisitie. Cilia beat frequentiemetingen worden gebruikt als klinische hulpmiddelen bij ziekten zoals primaire ciliaire dyskinesie. We hopen dit vast te stellen als een klinische marker voor cystische fibrose.

Katelin Allan en Laura Fawcett, promovendi uit mijn lab, en Dr.Sharon Wong, een postdoc uit mijn laboratorium, demonstreren de procedure. Begin met de deelnemer te vragen om door zijn mond te ademen. Neem vervolgens een cytologieborstel in de dominante hand en laat het vijfde cijfer op de kin van de deelnemer rusten om de hand te verankeren, steek de cytologieborstel in de neusholte van de deelnemer in een hoek van 45 graden ten opzichte van het gezicht van de deelnemer en passeer deze door de neusvleesus.

Nadat u de borstel rechtop hebt gedraaid, zodat deze loodrecht op het gezicht van de deelnemer staat, beweegt u de borstel voorzichtig maar stevig tegen de zijwand van de neus onder het inferieure terbinaat totdat deze zich in het midden tot achterste deel van het inferieure turbinaat bevindt. Draai het penseel maximaal drie keer 360 graden. Verwijder het vervolgens voorzichtig en keer de inbrengmanoeuvre om, zodat de cellen niet loskomen van de borstel.

Plaats de borstel in de voorbereide opvangbuis met nasale celverzamelmedia en plaats de opvangbuis op ijs. Na voorzichtige vortexing om cellen van de borstel los te maken, brengt u de opvangbuis op ijs terug naar de bioveiligheidskast. Breng met behulp van een serologische pipet de media over van de verzamelbuis naar een nieuwe buis en laat de cytologieborstels achter.

Centrifugeer vervolgens het monster. Na centrifugatie resuspenseert u de celpellet in één milliliter voorwaardelijk herprogrammerend celmedium. Vervolgens passeer je met een serologische pipet van vijf milliliter de cellen door een celzeef die in een cirkelvormige beweging bovenop een buis van 50 milliliter is geplaatst.

Om een suspensie met één cel te verkrijgen, verzamelt u de suspensie van de onderkant van de buis en passeert u deze meerdere keren door de zeef. Gooi vervolgens de celzeef weg. Om de luchtwegepitheelcellen op de voorbereide permeabele steuninzetstukken te zaaien, mengt u de cellen goed zonder bubbels te creëren, zodat ze homogeen en in suspensie zijn.

Voeg vervolgens 150 microliter van de celsuspensie toe aan de apicale kant van de voorbereide permeabele steuninzetstukken. Om de luchtwegepitheelcellen op de lucht-vloeistofinterface te differentiëren, kweekt u ze in differentiatie of ALI-media gedurende twee dagen. Adem vervolgens de media op en voeg 750 microliter ALI-media alleen toe aan het basale compartiment om een lucht-vloeistofinterface te creëren.

Om de luchtwegepitheelcellen in ECM-koepels te zaaien, resuspensie gedissocieerde luchtwegepitheelcellen met het juiste volume van 90% ECM. Houd vervolgens de pipet verticaal in een hoek van 90 graden zo dicht mogelijk bij de bodem van de put en dispenseer 50 microliter van de ECM-celsuspensie naar het midden van de put. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten totdat de ECU stolt.

Terwijl de ECU stolt, verwarmt u de Airway Organoid Seeding Media, of AOSM, tot kamertemperatuur om te voorkomen dat deze bij toevoeging opnieuw liquificatie en desintegratie van de ECM-koepel veroorzaakt. Voeg na de incubatie 500 microliter verwarmde AOSM toe aan elke put door de wand van de put af te geven. Pipetteer media niet rechtstreeks op de ECM-koepel.

Verander de media om de twee dagen gedurende vier tot zeven dagen. Om de media te aspirateren, kantelt u de plaat in een hoek van 45 graden en aspirateert u vanaf de onderrand van de put weg van de ECM-koepel. Start na vier tot zeven dagen organoïde differentiatie door 500 microliter verwarmde Airway Organoid Differentiation Media, of AODM, aan elke put toe te voegen en verander de media om de twee dagen gedurende zeven dagen.

Plaats de kweekplaat met de luchtwegepitheelcelmodellen in de microscoopplaatinzet en sluit de microscoopomgevingskamer. Laat het monster gedurende 30 minuten in evenwicht zijn in de voorverwarmde, 37 graden Celsius, 5% met koolstofdioxide gevulde microscoopkamer. Richt je bij het microscoop-oculair op het celmodel.

Klik vervolgens met behulp van de acquisitiesoftware op L100 om het lichtpad naar de poort te schakelen waar de camera is gemonteerd. Klik op de groene knop Afspelen om het gezichtsveld van de microscoop via de software te visualiseren. Controleer of de trilharen scherp zijn en pas indien nodig aan.

Als u time-lapse-afbeeldingen uit het menu wilt halen, klikt u op Acquire en vervolgens op Fast TimeLapse. Selecteer in het pop-upvenster een opslaglocatie en bestandsnaam, verkrijg 1.000 frames. Om een voorbeeld van de trilharen in het gezichtsveld van de microscoop te bekijken, klikt u op Toepassen, gevolgd door de groene knop Afspelen.

Pas indien nodig de Z-scherpstelling aan. Klik vervolgens op Nu uitvoeren om de Fast TimeLapse vast te leggen. Na het installeren van de benodigde software en toolboxen, kopieert u de juiste aangepaste analysescripts en de map ondersteuningsscripts naar het lokale station van de computer.

Klik vervolgens in de computersoftware op het tabblad Start, gevolgd door Pad instellen. Klik in het pop-upvenster op Toevoegen met submappen. Selecteer onder het MATLAB-zoekpad de weergegeven map.

Klik vervolgens op Opslaan en sluiten. Controleer of de analysescripts zijn gekoppeld aan de computersoftware door te controleren of ze in het linkerdeelvenster worden weergegeven. Breng vervolgens de voorbeeld raw-afbeeldingsbestanden over die zijn verkregen naar het lokale station van de computer.

Klik vervolgens op de BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m analyse scriptbestand in de computersoftware. Om het script uit te voeren, klikt u op het tabblad Editor, gevolgd door de groene knop Afspelen.

Selecteer in het promptvenster dat verschijnt de RAW-afbeeldingsbestanden die u wilt analyseren. Voer de belichtingstijd voor acquisitietijd per frame in. Klik vervolgens op OK. Voer de GetFirstAmplitude uit.

m script op de map die de AveSpectrum bestanden bevat. Wacht tot het script de FirstAmplitudeStacked uitvoert. xlsx-bestand, dat de hoogste amplitudefrequentie bevat en binnen het fysiologische bereik van luchtwegepitheel cilia beating ligt.

Kopieer de frequentiewaarden van de FirstAmplitudeStacked. xlsx-bestand en plot ze met behulp van wetenschappelijke analysesoftware. De resultaten van de trilhaarslagfrequentie gemeten in luchtwegepitheelcel ALI-modellen afgeleid van drie deelnemers met cystische fibrose en drie gezonde controledeelnemers worden gepresenteerd.

Op dag 14 van cultuurdifferentiatie waren kloppende trilharen aanwezig. Vanaf dag 14, dag 21 van de cultuurdifferentiatie, werd geen statistisch significante toename van de trilhaarslagfrequentie waargenomen tussen cohorten. Op dag 21 van de cultuurdifferentiatie was de gemiddelde trilhaarslagfrequentie voor gezonde controledeelnemers significant hoger dan die van deelnemers met cystische fibrose.

Verder, toen de trilhaarslagfrequentie werd afgebeeld in dezelfde celmodellen na het verwijderen van slijm, was er een statistisch significante toename van de trilhaarslagfrequentie wanneer slijm werd verwijderd in ALI-modellen van zowel gezonde personen als mensen met cystische fibrose. De beeldvormende omgeving moet strikt worden gereguleerd, omdat de trilhaarfunctie uiterst gevoelig is voor veranderingen in omgevingsfactoren. Dit platform heeft het potentieel om te worden opgericht voor patiëntspecifieke geneesmiddelenscreening om geneesmiddelen te kunnen identificeren die de CFTR-functie moduleren.