Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot

Dit protocol maakt gebruik van automatisering om eiwitbiochemische preparaten uit te voeren voorafgaand aan massaspectrometrie-experimenten, waardoor een hogere doorvoer en lagere variabiliteit voor proteomische studies mogelijk is. Dit protocol maakt gebruik van een goedkoop, programmeerbaar vloeistofbehandelingssysteem dat betaalbaar is voor meer laboratoria. Wij bieden open source Python scripts die kunnen worden aangepast voor verdere ontwikkeling.

De procedure wordt gedemonstreerd door Milton Amaya, een masterstudent in ons laboratorium. Open om te beginnen de noSP3_Digestion. py script in de teksteditor en geef de experimentspecifieke variabelen op zoals nodig in de sectie ALLEEN AANPASSEN.

Open vervolgens de Opentrons-app en upload het script naar het tabblad Protocol in de Opentrons-app. Plaats vervolgens de vereiste labware en pipetten op de overeenkomstige locatie in het OT2-deck dat is opgegeven in het Python-script. Plaats vervolgens de ammoniumbicarbonaatoplossing in de A1-put van het vier-in-één buizenrek met de 15-milliliter plus 50-milliliter buishouder bovenkant en plaats het eiwitmonster in de A1-put van het vier-in-één buizenrek met een buishouder van twee milliliter.

Plaats handmatig twee milliliter eiwitarmbindende buizen in de putten van het aluminium blok dat bovenop de temperatuurmodule is geplaatst, beginnend bij A1 en verticaal naar beneden. Plaats vervolgens de DTT-oplossing in de A6-put van het vier-in-één buizenrek met een buishoudertop van twee milliliter. Observeer terwijl de robot een geschikt volume van de ammoniumbicarbonaatbuffer overbrengt naar de monsterbuizen in het aluminiumblok.

Controleer vervolgens handmatig of het robotprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, zorg ervoor dat DTT is geladen in A6 van het buizenrek met twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat. Nadat u de locatie van de DTT-buis hebt bevestigd en de buisdop hebt geopend, klikt u op de knop Hervatten in de Opentrons-app om door te gaan. Zorg ervoor dat de robot 10 microliter van de DTT-oplossing overbrengt naar elke monsterput, gevolgd door vijf mengrondes.

Controleer vervolgens of het robotprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, Zorg ervoor dat u doppen op monsterbuizen sluit. Sluit vervolgens handmatig de doppen van de buizen en klik op Hervatten om door te gaan. Wacht tot de temperatuurmodule van de robot het aluminiumblok begint te verwarmen en de temperatuur 55 graden Celsius bereikt, gevolgd door een incubatie van vijf minuten om de monsters tot 55 graden Celsius te laten komen.

De robot houdt deze temperatuur vervolgens 30 minuten vast om eiwitreductie door DTT mogelijk te maken. Bereid tijdens de incubatie de jodoacetamide-oplossing voor en wikkel deze handmatig in met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Na de incubatie, wanneer het programma van de robot is gepauzeerd en het waarschuwingsbericht wordt weergegeven, zorgt u ervoor dat u doppen op monsterbuizen opent, de monsterbuizen losmaakt en op Hervatten klikt om door te gaan.

Controleer vervolgens handmatig of het programma van de robot is gepauzeerd met het waarschuwingsbericht, Zorg ervoor dat jodoacetamide is geladen in B6 van het buizenrek van twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat. Nadat u de racklocatie van de jodoacetamidebuis hebt bevestigd en de buisdop hebt geopend, klikt u op Hervatten en zorgt u ervoor dat de robot 10 microliter van de jodoacetamide-oplossing naar elke monsterbuis overbrengt, gevolgd door vijf mengrondes. Wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, sluit u de doppen op monsterbuizen, dop u de monsterbuizen en bedekt u ze met folie, bedekt u vervolgens het hele aluminiumblok met een schoon stuk folie en klikt u op Hervatten om door te gaan.

Wacht tot de monsters gedurende 30 minuten bij 22 graden Celsius zijn geïncubeerd en zorg ervoor dat de temperatuurmodule van de robot wordt gedeactiveerd na voltooiing van de iodoacetamide-incubatie. Wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en het waarschuwingsbericht wordt weergegeven, zorgt u ervoor dat trypsine is geladen in C6 van het buisrek met twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat, plaatst u trypsine-oplossing in de C6-put van het buisrek met twee milliliter met de buisdop open en klikt u op Hervatten om door te gaan. Wanneer vervolgens het programma van de robot is gepauzeerd en het waarschuwingsbericht wordt weergegeven, opent u doppen op monsterbuizen op de temperatuurmodule, maakt u de monsterbuizen los en klikt u op Hervatten om door te gaan.

Stand-by terwijl de robot 10 microliter trypsine overbrengt naar elke monsterbuis, gevolgd door vijf mengrondes. Na een nachtelijke trypsinevertering draait u de monsters kort met behulp van een benchtop microcentrifuge en plaatst u de monsters op een magnetisch buizenrek. Breng het supernatant na twee minuten voorzichtig met een pipet over in een nieuwe set eiwitarmbindende microcentrifugebuizen en bewaar de monsters in een koelkast.

Open vervolgens de SP3_peptide_cleanup. py Python-script in een teksteditor en geef de experimentvariabelen indien nodig op in de sectie ALLEEN AANPASSEN. Upload vervolgens het script naar het tabblad Protocol in de Opentrons-app.

Plaats de vereiste labware en pipetten op de overeenkomstige locatie in het OT2-deck dat is opgegeven in het Python-script en zorg ervoor dat de magnetische module is ingeschakeld en verbonden met de robot. Plaats een nieuwe, twee milliliter, 96-well diepe putplaat op de bovenkant van de magnetische module. Plaats vervolgens de verteerde monsters in het buizenrek van twee milliliter, beginnend bij A1 en verticaal naar beneden.

Zorg er vervolgens voor dat de robot 55 microliter van de verteerde monsters overbrengt naar de putten in de diepe putplaten op de magnetische module. Controleer of het robotprotocol is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, Zorg ervoor dat voorbereide kralen zijn geladen in A6 van het buizenrek met twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat. Draai vervolgens de SP3-kralen kort in een mini-benchtopcentrifuge en plaats ze in de A6-put van het buizenrek van twee milliliter met de dop open.

Controleer of het robotsprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, Zorg ervoor dat 80% ethanol is geladen in A4 van het 15-milliliter plus 50-milliliter buizenrek in sleuf vijf voorafgaand aan het hervatten van het protocol. Plaats vervolgens een 80% ethanoloplossing in de A4-put in het buizenrek en klik op Hervatten om door te gaan. Observeer terwijl de robot de pipetteersnelheid verandert in langzaam, zuigt het supernatant uit elke put en doseert het in de afvalbuis.

Wacht tot de robot de pipetteersnelheid weer op de standaardsnelheid zet en de magnetische module uitschakelt. Wanneer het robotprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, opent u de dop op de ammoniumbicarbonaatbuis, opent u de dop van de ammoniumbicarbonaatoplossing en klikt u vervolgens op Hervatten om door te gaan. Stand-by terwijl de robot de magnetische module uitschakelt, 250 microliter van de ammoniumbicarbonaatbuffer naar elke put overbrengt en onmiddellijk 10 keer mengt.

Observeer vervolgens terwijl de robot de pipetteersnelheid verandert in langzaam en het supernatant van elke put naar de afvalbuis overbrengt. Wacht tot de robot 100 microliter van de ammoniumbicarbonaatbuffer naar elke put overbrengt en onmiddellijk 10 keer mengt. Controleer of het robotsprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, Zorg ervoor dat nieuwe verzamelbuizen in het aluminiumblok van twee milliliter zijn geplaatst voordat het protocol wordt hervat.

Plaats vervolgens een nieuwe set microcentrifugebuizen met een laag eiwitgehalte in het aluminiumblok onmiddellijk na de laatste monsterbuis die aanvankelijk in het blok zat en klik op Hervatten om door te gaan. Stand-by terwijl de robot elk monster in de ammoniumbicarbonaatbuffer overbrengt naar de nieuwe buizen van twee milliliter. Wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, zorgt u ervoor dat trypsine is geladen in C6 van het buizenrek met twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat, plaatst u de trypsine-oplossing in de C6-put van het buisrek met twee milliliter met de buisdop open en klikt u op Hervatten om door te gaan.

Zodra het programma is voltooid, wikkelt u de monsterbuisdoppen met paraffinefilm, brengt u alle monsters over naar een temperatuurgecontroleerde mixer en incubeert u gedurende 16 tot 20 uur bij 37 graden Celsius met 1.000 RPM schudden. Met het BSA-monster werd een medium van 728 peptidespectrummatches en 65 peptiden geïdentificeerd, met respectievelijk 5,2% en 3,2% variatiecoëfficiënten. Met een complex hartmonster werd een medium van 9, 526 peptidespectrummatches, 7, 558 peptiden en 1.336 eiwitten geïdentificeerd in 10 runs met respectievelijk 7,6% 5,9% en 3,6% variatiecoëfficiënten.

Om de variabiliteit in peptidekwantificering te bepalen, werden de variatiecoëfficiënten van de geëxtraheerde ionchromatogramintensiteiten berekend voor 10 peptiden die zich in kaart brengen met een uniek eiwit. Wanneer de variabiliteit van menselijke versus robot experimentele resultaten bij het meten van eiwitconcentratie verder werd vergeleken met de BCA-test, was de gemiddelde variatiecoëfficiënt van de robot BCA-assay lager dan de menselijke handmatige BCA-assay. Dit protocol verkort de bench-tijd voor het verwerken van elk monster.

Het maakt de weg vrij voor ons om proteomics-verschillen te onderzoeken in een panel van cellijnen tussen meerdere medicamenteuze behandelingen.