Het genereren van zelfassemblerende organoïden voor het menselijk hart afgeleid van pluripotente stamcellen

Dit protocol stelt ons in staat om een complexe 3D-structuur te creëren die sterk lijkt op het zich ontwikkelende menselijke hart op een eenvoudige kosteneffectieve manier, die reproduceerbaar is over cellijnen. Het bestaat uit een enkel protocol met drie stappen van differentiatie, die aanleiding geeft tot alle celtypen van het hart, inclusief kamers en een vasculair netwerk. Deze techniek stelt ons in staat om een breed scala aan menselijke hart- en vaatziekten te modelleren en effectieve farmacologische behandelingen te screenen.

Dankzij de hoge doorvoer van het ontwerp. Deze methode is nuttig voor het onderzoeken van het zich ontwikkelende menselijke hart en ziekten die er vaak mee worden geassocieerd. Een daarvan zijn aangeboren hartafwijkingen.

Dit protocol vereist basis celkweekvaardigheden. We raden aandachtig en delicaat pipetteren aan, evenals een voorzichtige behandeling van de organoïden. Begin met het creëren van embryoïde lichamen of EB's twee dagen voor differentiatie.

Was sub-confluente HPSC's met DBPS gedurende ten minste 10 seconden. Aspirateer dan de DPBS. Voeg een milliliter ACUTA bij kamertemperatuur toe en tik ongeveer vijf keer per minuut gedurende drie tot vijf minuten zachtjes op de plaat om loslating te veroorzaken, terwijl u dit onder de microscoop controleert.

Voeg vervolgens een milliliter PSC-medium en Thias Avin of Thias toe om de reactie te stoppen. Pipetteer de media twee tot drie keer op en neer in de put om een enkele celsuspensie te genereren en de cellen te verzamelen. Breng vervolgens de eencellige suspensie over naar een centrifugebuis en draai gedurende vijf minuten op 300 keer G.Aspirateer het supernatant en besteed de cellen opnieuw in één milliliter PSC-medium en Thias.

Verdun de cellen in DPBS. Tel de cellen met behulp van een celteller of hemocysteometer en verdun de cellen in PSC-medium met Thias tot een concentratie van 100.000 cellen per milliliter. Voeg 100 microliter verdunde cellen suspensie toe aan elke put van een ronde bodem ultra lage bevestiging 96 putplaat.

Centrifugeer de plaat gedurende drie minuten op 100 keer G en incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder na 24 uur voorzichtig 50 microliter medium uit elke put en voeg 200 kernstrooisels van vers PSC-medium toe, warm tot 37 graden Celsius voor een volume van 250 microliter per put. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Verwijder 166 microliter of twee derde van het medium van één kant van elke put en voeg 166 microliter RPMI 1640 toe met insulinevrij B27-supplement, zes micromolaire cheer 990211, 0,875 nanogram per milliliter botmorfogenetisch eiwit vier en 1,5 nanogram per milliliter Activin A.Incubate gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder na 24 uur 166 microliter medium van één kant van elke put en voeg 166 microliter verse RPMI 1640 toe met insulinevrij B27-supplement. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Om de cardiale mesodermspecificatie op dag twee te induceren, verwijdert u 166 microliter medium uit elke put en voegt u 166 microliter RPMI 1640 toe, met insulinevrij B27-supplement en drie micromolaire Wnt-C59 en gaat u door met incubatie gedurende 48 uur. Verwijder op dag vier 166 microliter medium uit elke put en voeg 166 microliter verse RPMI 1640 toe met insulinevrij B27-supplement en incubeer vervolgens nog eens 48 uur. Verwijder op dag zes 166 microliter medium uit elke put en voeg 166 microliter RPMI 1640 toe met B27-supplement.

Gebruik voor deze en alle daaropvolgende mediaveranderingen B27-supplement met insuline, incubateer nog eens 24 uur. Op dag zeven is de celkweek klaar voor pro-epicardiale differentiatie. Verwijder 166 microliter medium uit elke put en voeg 166 microliter verse RPMI 1640 met B27-supplement en drie micromolaire cheer 99021 toe.

Haal vervolgens in incubateer gedurende een uur, verwijder na een uur de plaat uit de incubator, verwijder 166 microliter medium van één kant van elke put en voeg 166 microliter verse RPMI 1640 met B27-supplement toe, ga nog 48 uur door met incubatie. Herhaal dit proces elke 48 uur tot de ophaling. Organoïden zijn klaar voor analyse en experimenten op dag 15 Om de hele organoïden over te brengen, snijdt u de punt van een P200-pipet, vijf tot 10 millimeter van de opening met een diameter van ongeveer twee tot drie millimeter.

Druk op de pipetzuiger en steek de punt verticaal in de ronde bodem goed met de organoid. Neem ongeveer 100 tot 200 microliter medium genoeg in beslag om de organoïden te verzamelen en over te brengen naar de doelbestemming. Voordat differentiatie EBS verschijnt als zwarten bolvormige massa's begint het differentiatieproces op dag nul met een Wnt pathway activatie en groeifactor optelling gedurende precies 24 uur.

Verder resulteert de bewerking van Wnt C59 op dag twee in een vergroting van de organoïde van ongeveer 200 micrometer tot maximaal één millimeter. De organoïden van het menselijk hart begonnen al op dag zes te kloppen en 100% van de organoïden vertoonde zichtbaar kloppen op dag 10. Hoge vergrotingsbeelden van dag zeven organoïde onthulden dat de meeste hand één tot expressie brengende cellen cardiomyocyten van oorsprong waren en hand twee niet-myosietcellen uit tweede Heartfield, voorlopercellen.

RNA-transcripten voor zowel hand één als hand twee werden vanaf dag drie uitgedrukt in RNA-sequencinggegevens. De FHF-markers werden sterk uitgedrukt tijdens dag drie en 11, terwijl de SF-marker na dag 13 sterker tot expressie kwam. Immunofluorescentievlek onthulde de aanwezigheid van verschillende menselijke hartceltype-type afstammingslijnen die deel uitmaken van het menselijk hart.

Zoals myocardiaal en epicardiaal weefsel, endocardiale cellen, endotheelcellen en cardiale fibroblast. De markers die de bovenstaande cellijningen tot expressie brengen, werden ook waargenomen in de RNA SAC-genexpressieprofielen. Live calciumbeeldvorming van individuele cellen in hele organoïden werd gebruikt om de elektrofysiologische functie van de organoïden te meten.

De fluorescentie-intensiteit van Fluo-4 varieerde in de loop van de tijd als gevolg van het verlaten van calcium uit de cel en het onthullen van regelmatige actiepotentialen. Heatmaps die calciumintensiteiten tonen over een gebied met hoge vergroting van de organoïde, tonen een verhoogde intensiteit als gevolg van calciumtransiënten en individuele cellen. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat de EB's en daaropvolgende organoïden niet aan de onderkant van de plaat zijn bevestigd en dat we zullen rondgaan met de verwijdering naast media die aandachtige mediaveranderingen vereisen.

Organoïden kunnen gedurende langere tijd worden gekweekt en worden geïntroduceerd in rijpingstechnieken, of zelfs worden blootgesteld aan externe stimuli, zoals mechanische of elektrische conditionering, en zelfs stressoren zoals toxines. Deze techniek biedt toegang tot stadia van de ontwikkeling van het menselijk foetaal hart die anders ontoegankelijk zijn in onderzoek, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor nieuwe inzichten in hartontwikkeling en ziekte-etiologie.