Een micropatterning-test voor het meten van celchiraliteit

De micropatterning bastcel chiraliteitstest is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van meercellige chirale morfogenese bij de ontwikkeling van ziekten. Het is ook belangrijk voor celonderzoek. Dit macropattern-systeem is eenvoudig te fabriceren en te gebruiken, kan zeer betrouwbare en herhaalbare resultaten produceren en is ook compatibel met geautomatiseerde high-throughput verwerking voor grote steekproefgrootte.

Begin met het snijden van de titanium vergulde dia in kleine vierkante stukjes van ongeveer 12 bij 12 millimeter. Schuif met behulp van een glassnijder over het oppervlak om een gedeukte baan achter te laten, houd vervolgens de glasplaat aan beide zijden vast en buig bij de deuk om in kleine kwartalen te breken. Om de dia schoon te maken, weekt u deze met de gouden kant omhoog in 100% ethanol in een petrischaaltje op een orbitale shaker gedurende ten minste 10 minuten.

Na het aanzuigen van de ethanol droog je de glijbaan door te blazen met een stikstofstroom. Reinig de polydimethylsiloxaan- of PDMS-stempels met een sopje voordat u de stempel droogt met stikstofgas. Los 5,74 milligram octadecanethiol of C18 op in 10 milliliter 100% ethanol om twee millimolaire C18-oplossing te maken en reinig vervolgens de PDMS-stempels met 100% ethanol.

Week de PDMS-stempel met het patroonoppervlak naar beneden gericht in C18-oplossing gedurende 10 seconden en droog het vervolgens voorzichtig af met stikstofgas gedurende 60 seconden. Eenmaal gedroogd, leg de stempel 60 seconden naar beneden op de gouden glijbaan voordat u deze verwijdert. Om een goede stempeling te garanderen, tikt u het pincet voorzichtig op de stempel om de patronen op de juiste manier over te brengen.

Bereid vervolgens de vochtigheidskamers voor door een milliliter 70% ethanol in een omgekeerd petrischaaldeksel te pipetteren. En leg met het pincet een stuk parafilm neer om het oppervlak te bedekken, zodat er geen bubbels achterblijven. Verwijder indien nodig de overtollige ethanol.

Voeg 40 microliter druppels EG3-oplossing toe voor elke kwart glasschuif op de parafilm in de vochtigheidskamer, zodat er voldoende ruimte tussen de druppels overblijft om rekening te houden met de afstand van de gouden dia's. Gebruik een pincet om de C18-bedrukte gouden dia naar beneden op de druppel te plaatsen, zodat er geen bubbels onder de dia blijven. Duw de glijders voorzichtig tegen elkaar zonder ze op te tillen om verdamping te minimaliseren.

Nadat u de petrischaal goed hebt afgesloten met parafilm, laat u deze ten minste drie uur op kamertemperatuur staan. Laat in een bioveiligheidskast de gouden glijbaan drie keer naar boven in 70% ethanol weken en afspoelen om EG3 te verwijderen en laat vervolgens 10 minuten in ethanol staan voor sterilisatie. Voeg na het opzuigen van de ethanol steriel PBS toe.

Bereid een andere vochtigheidskamer voor met PBS in plaats van ethanol zoals aangetoond. Voeg vervolgens 50 microliter druppels fibronectine-oplossing toe voor elke kwartschuif op de parafilm, waardoor er wat ruimte tussen de druppels overblijft. Plaats vervolgens de schuif naar beneden op de druppel zoals eerder gedemonstreerd en laat de petrischaal 30 minuten in de bioveiligheidskast staan.

Nadat u de vergulde dia driemaal hebt gespoeld, plaatst u de dia naar boven in PBS. Voordat u de cellen zaait, verwarmt u de media en trypsine in een waterbad getemperd op 37 graden Celsius. Voor een betere celaanhechting weekt u de patroonschuif in een 12-well plaat met kweekmedia en verwarmt u deze bij 37 graden Celsius in de incubator.

Zodra de cellen zijn trypsine, neutraliseert u de cellen met FBS-bevattende media, pellett u de cellen gedurende drie minuten op 100 maal G en resuspendeert u de celkorrel in verse media. Tel de cellen en verdun de celsuspensie om de concentratie van 200.000 cellen per milliliter te bereiken. Voeg 0,5 milliliter van de celsuspensie toe aan elke put met één gouden dia.

Schud de plaat een paar keer voorzichtig voor uniforme celzaaiing voordat u gedurende 15 minuten broedt voor celaanhechting. Controleer na 15 minuten de celaanhechting onder een microscoop en incubeer indien nodig nog een tijdje. Zodra de cellen zijn bevestigd, zuigt u de media met niet-aangebonden cellen uit elke put en voegt u een milliliter verse kweekmedia toe.

Kweek de cellen in de couveuse gedurende 24 uur en controleer de samenvloeiing om te bepalen of chiraliteit zich heeft gevormd. Wanneer de vereiste samenvloeiing is bereikt, fixeert u de cellen door de kweekmedia te verwijderen. Voeg na eenmaal spoelen met PBS 4% paraformaldehyde-oplossing toe aan de dia en incubeer 15 minuten op kamertemperatuur voordat u drie keer opnieuw spoelt met PBS.

Om de beelden te verkrijgen, gebruikt u een fasecontrastmicroscoop met camerafunctionaliteit en legt u elke ring op de dia vast met een hoge resolutie. Voor chiraliteitskarakterisering downloadt u de MATLAB-codebestanden, voegt u de codemap en submappen toe aan het MATLAB-pad en opent u de ROI_selection. m bestand.

Wijzig in regel vier de map in de gewenste gegevensmap. Wijzig de afbeeldingsgrootte in regel 14 waarbij de eerste twee figuren de binnenste cirkelgrootte van de ring vertegenwoordigen, terwijl de andere twee de buitenste vertegenwoordigen. Om het interessegebied of de ROI in de fasecontrastafbeeldingen te bepalen, voert u de MATLAB-code ROI_selection uit.

m door op de knop Uitvoeren te klikken. Sleep het selectievierkant handmatig om in de ring te passen en dubbelklik vervolgens op de afbeelding om de selectie te bevestigen. Nadat u roi hebt geselecteerd uit alle afbeeldingen in de map, wordt een matbestand gegenereerd om de ROI-informatie voor elke afbeelding op te slaan.

Open vervolgens de analysis_batch. m bestand en verander de map van de map zoals eerder gedemonstreerd. Klik op de knop Uitvoeren om de code analysis_batch uit te voeren.

m om de chiraliteit van meerdere cellulaire ringpatronen te bepalen. Een datatoexcel. txt-bestand wordt gegenereerd met cirkelvormige statistieken voor elke ring, evenals de aantallen niet-chirale en tegen de klok in ringen met de klok mee.

De huidige bevindingen tonen het nut van de ontwikkelde ringpatroon chiraliteitstest experimenteel aan, evenals de gevoeligheid van deze test voor veranderingen in het cytoskelet. In de huidige studie werd gevonden dat door het verstoren van de actinepolymerisatie met 50 nanomolaire latrunculine A-behandeling, de muismyoblast C2C12-cellen een verandering vertoonden van tegen de klok in of CCW chirale bias in met de klok mee of CW.In toevoeging, de menselijke navelstreng vasculaire endotheelcellen of hUVEC's die werden behandeld met 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetaat of TPA om het eiwitkinase C te activeren, vertoonden een dosisafhankelijke verschuiving van celchiraliteit van CW naar CCW. Na celzaaien naar de patronen kunnen chemicaliën of geneesmiddelen worden aangevuld met het medium om de respons te bestuderen, en het transwell-systeem kan worden opgenomen om celcocultuur te bestuderen.

Deze test biedt een efficiënt hulpmiddel voor het onderzoeken van meercellige chiraliteit onder verschillende experimentele omgevingen en biedt belangrijke inzichten in de rol van celchiraliteit in verschillende biologische verschijnselen en processen.