Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul
November 23rd, 2021
Dit artikel presenteert een methode voor spatiotemporale analyse van mobiele, single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET)-gebaseerde probes met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie. De nieuw ontwikkelde softwaretoolkit maakt het mogelijk om smFRET-tijdsporen van bewegende sondes te bepalen, inclusief de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities, als functies van de tijd.
Single-molecule FRET-experimenten met behulp van oppervlaktegebonden sondes zijn in het verleden bijna uitsluitend uitgevoerd op geïmmobiliseerde moleculen. Veel biomoleculen diffunderen echter en kunnen met onze methode worden geanalyseerd. Het combineren van single-molecule FRET met tracking maakt het mogelijk om niet alleen FRET-deficiëntietijdsporen van bewegende probes te analyseren, maar ook om spatiotemporale aspecten zoals het diffusiegedrag te onderzoeken.
Onze methode is compatibel met een verscheidenheid aan verschillende FRET-gebaseerde sondes. Het zou bijvoorbeeld inzichten kunnen bieden over moleculaire krachten, conformatiedynamica en bindingskinetiek in levende celexperimenten. Hoogwaardige single-molecule FRET-experimenten zijn notoir moeilijk uit te voeren.
Voor een betrouwbare kwantificering is het belangrijk om gegevens vast te leggen met een goede signaal-ruisverhouding en single-molecule tracks van voldoende lengte. Om de monstermeting te starten, prikkelt u de fluoroforen donor en accepter voor een geschikte verlichtingstijd terwijl u de camera activeert en wacht u totdat de camera-uitlezing is ingeschakeld. Herhaal de excitatie van de fluoroforen van de donor en accepter als alternatief.
Kies het aantal herhalingen dat groot genoeg is om fotobleaching van ten minste één fluorofoor per sonde binnen het gezichtsveld te garanderen, waardoor stapsgewijze fotobleachinganalyse mogelijk is om signalen van één molecuul van aggregaten te onderscheiden. Geef de verlichtingsvolgorde op om de selectie van donor- en accepter-excitatieframes en frames voor beeldsegmentatie van opgenomen beeldreeksen mogelijk te maken. Analyseer tegelijkertijd de datasets die zijn opgenomen met dezelfde verlichtingsinstellingen.
Wijs hiertoe een id en een patroon toe dat overeenkomt met de respectieve bestandsnamen van de afbeeldingsreeks aan elke gegevensset. Definieer daarnaast specifieke datasets voor speciale doeleinden, zoals opnames van fiduciële markers voor beeldregistratie, excitatielichtprofielen voor vlakke veldcorrectie en optioneel donor-only en accepter-only monsters om correctiefactoren te bepalen. Selecteer vervolgens emissiekanalen en RAW-beelden als beide kanalen zijn opgenomen met één camera.
Gebruik hiervoor de juiste grafische widget om de juiste regio's voor donor- en accepteeremissie te selecteren, lokaliseer vervolgens fiduciale markers in beide emissiekanalen en voer beeldregistratie uit. Gebruik de meegeleverde gebruikersinterface om de juiste parameters te vinden voor het lokalisatiealgoritme voor zowel donor- als accepteeremissiekanalen. Stel vervolgens lokalisatieparameters met één molecuul in voor FRET-sondes bij donorexcitatie in de som van de beelden die zijn verkregen van donor- en acceptoremissies en stel vervolgens lokalisatieparameters in voor sondes bij acceptorexcitatie in het acceptoremissiekanaal.
Lokaliseer de FRET-sondes onafhankelijk van elkaar op donor- en acceptorexcitatie in alle frames. De resultaten worden samengevoegd tot één tabel met het oorspronkelijke framenummer, tweedimensionale coördinaten en een id die verwijst naar het bronafbeeldingsbestand. Om de fluorescentie-intensiteit te volgen en te meten, kiest u geschikte opties voor het Trackpy-algoritme om FRET-sondelokalisaties in trajecten te koppelen.
Vervolgens, met behulp van de analysesoftwarefunctionaliteit, verwerken van hulpbeeldgegevens van beeldreeksen. Extra opgenomen beelden extraheren om segmentatie gemarkeerd door S in de excitatiesequentie te vergemakkelijken. Bepaal ten slotte de donor- en acceptor-excitatielichtprofielen over het gezichtsveld van beelden die zijn opgenomen op een dicht gelabeld monster.
Voor de eerste filterstappen moet u signalen met overlappende puntspreidingsfuncties weggooien, omdat het moeilijk is om hun fluorescentie-intensiteiten betrouwbaar te bepalen. In het geval van inhomogene verlichting, accepteer alleen signalen die zich in goed verlichte gebieden binnen het gezichtsveld bevinden om een goede signaal-ruisverhouding te garanderen. Als u intramoleculaire FRET bestudeert, beperk de analyse dan tot die trajecten die aanwezig zijn vanaf het begin van de beeldreeks.
Voer vervolgens de vlakke veldcorrectie uit, die de eerder verkregen excitatielichtbronprofielen gebruikt om de positieafhankelijke fluorescentie-intensiteitsvariaties veroorzaakt door inhomogene verlichting om te keren en vervolgens de schijnbare FRET-efficiëntie en de schijnbare stoichiometrie te berekenen. Om stapsgewijze analyse van fotobleaching uit te voeren voor het onderscheid tussen enkele moleculaire sondes en aggregaten, vindt u geschikte parameters voor het veranderingspuntdetectiealgoritme bij donor- en accepterexcitatie onafhankelijk van elkaar. Voer vervolgens het wijzigingspuntdetectiealgoritme uit.
Als u een spoor wilt verwijderen dat dubbelzinnig fotobleekend gedrag vertoont, definieert u intensiteitsdrempels waaronder een fluorofoor als gebleekt wordt beschouwd en selecteert u vervolgens een van de volgende opties. Optie één waarbij de acceptor fluorofoor in één stap bleekt terwijl de donor geen gedeeltelijke bleeking vertoont. Optie twee waarbij de donor in één stap bleekt terwijl er geen gedeeltelijke acceptorbleking is.
Optie drie waarbij een van beide fluoroforen in één stap bleekt, terwijl de andere niet gedeeltelijk bleekt. En optie vier waarbij donor- en acceptorfluooforen eenstapsfotobleaching of helemaal geen fotobleaching vertonen. Bereken vervolgens de correctiefactoren voor donoremissielekkage in het acceptorkanaal, directe acceptorexcitatie, detectie-efficiëntie en excitatie-efficiëntie.
Gebruik vervolgens de correctiefactoren om de FRET-efficiëntie te berekenen op basis van schijnbare efficiëntie en stoichiometrie op basis van schijnbare stoichiometrie. Voor verdere filtering selecteert u alleen gegevenspunten van vóór de eerste bleekgebeurtenis in elk traject. Bovendien, om de analyse te beperken tot sondes met één molecuul, accepteert u alleen trajecten met ten minste 75% van de gegevenspunten binnen de juiste stoichiometriegrenzen.
Voer vervolgens beeldsegmentatie uit via globale of adaptieve drempelmethoden op de juiste hulpbeelden om de analyse te beperken tot verschillende gebieden in het gezichtsveld. Creëer efficiëntie versus stoichiometrie plots om te controleren of signalen van onjuiste stoichiometrie correct zijn geïdentificeerd en verwijderd. Plot vervolgens histogrammen van FRET-efficiënties om een goed vastgesteld overzicht van FRET-efficiëntieverdelingen te bieden en groepeer de histogrammen voor een gemakkelijke vergelijking van resultaten van verschillende experimenten.
Door gebruik te maken van wetenschappelijke Python-bibliotheken is het mogelijk om de gegevens in het notitieblok verder te evalueren, bijvoorbeeld door diffusieanalyses uit te voeren. Visualisatie en tracking van single-molecule FRET-gebeurtenis worden hier getoond. Gefilterde FRET-gebeurtenissen worden weergegeven door efficiëntie versus stoichiometrieplots in een FRET-efficiëntiehistogram.
Verder kunnen mobiliteitsparameters worden onderzocht door een individueel trajectpad uit te zetten in een XY-plot of een gemiddelde vierkante verplaatsingsplot. De output van ons platform stelt ons in staat om overgangen in FRET-efficiëntietijdsporen van mobiele sondes verder te identificeren. Bijvoorbeeld om conformationele veranderingen van de biomoleculen te evalueren.
Met behulp van een FRET-gebaseerde krachtsensor stelde het analyseplatform ons in staat om krachtgebeurtenissen met één molecuul in de immunologische synaps te kwantificeren tijdens vroege T-celsignalering.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor ruimte-tijdelijke analyse van mobiele, single-molecuul Förster resonantie energie transfer (smFRET)-gebaseerde sondes met behulp van widefield fluorescentie microscopie. De methode maakt het mogelijk om smFRET tijdsverlopen van bewegende sondes te bepalen, inclusief FRET-efficiëntie en moleculaire posities als functies van tijd.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Fluorescentie Microscopie
Achtergrond
- Single-molecuul FRET experimenten hebben zich typisch gericht op geïmmobiliseerde moleculen.
- Veel biomoleculen zijn mobiel en kunnen met deze nieuwe methode worden geanalyseerd.
- De combinatie van single-molecuul FRET met tracking maakt de studie van diffusie gedrag mogelijk.
- Deze methode is compatibel met verschillende FRET-gebaseerde sondes.
Doel van Studie
- Om FRET-deficiëntie tijdsverlopen van bewegende sondes te analyseren.
- Om ruimte-tijdelijke aspecten van moleculaire dynamica te onderzoeken.
- Om inzichten te verschaffen in moleculaire krachten, conformationele dynamica en bindingskinetica in levende cel experimenten.
Gebruikte Methoden
- Excitatie van donor en acceptor fluoroforen terwijl de camera wordt geactiveerd.
- Gegevensopname met een focus op signaal-ruisverhouding en tracklengte.
- Beeldregistratie en lokalisatie van FRET sondes in alle frames.
- Analyse van fluorescentie-intensiteit en toepassing van correctiefactoren voor nauwkeurige FRET-efficiëntie berekeningen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle tracking en meting van mobiele single-molecuul FRET sondes.
- Bepaling van FRET-efficiëntie en stoichiometrie uit opgenomen gegevens.
- Identificatie en verwijdering van onjuiste stoichiometrie signalen.
- Inzichten in moleculaire interacties en dynamica door ruimte-tijdelijke analyse.
Conclusies
- De methode verbetert de mogelijkheid om mobiele biomoleculen te analyseren met behulp van smFRET.
- Het biedt een robuust raamwerk voor het bestuderen van moleculaire dynamica in levende cellen.
- De ontwikkelde software toolkit is veelzijdig en toepasbaar op verschillende FRET sondes.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables spatiotemporal analysis of mobile single-molecule FRET probes, addressing a key limitation in traditional smFRET that relies on immobilized molecules. By capturing both FRET efficiency and molecular mobility in plasma membranes or supported lipid bilayers, it provides mechanistic insights into biomolecular dynamics relevant to target validation and lead identification. The automated, open-source software suite supports reproducible data generation for downstream biophysical characterization and assay development in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating conformational dynamics with functional outcomes in mobile biomolecular systems.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of ligand-induced conformational changes in near-native membrane environments.
- Predictive Value: Enhances confidence in target mechanism by distinguishing specific binding from nonspecific interactions via spatiotemporal FRET trajectories.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative FRET efficiency and stoichiometry data suitable for high-content screening of compound libraries against mobile targets.
- Reproducibility: Automated localization, tracking, and correction factor application ensure consistent data quality across experiments and users.
- Scalability: Compatible with widefield microscopy and open-source tools, enabling deployment across multiple laboratory settings without proprietary instrumentation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated utility in probing immunological synapse dynamics during early T-cell signaling, linking molecular mechanisms to cellular function.
- Translational Continuity: Facilitates progression from in vitro biomolecular characterization to live-cell context, supporting predictive modeling of drug-target engagement.
- Mechanistic De-risking: Allows detection of transient intermediates and conformational transitions that may inform structure-based design and resistance mechanism prediction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for membrane-associated proteins and dynamic complexes where mobility informs function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking observed FRET changes to specific biomolecular states or interactions in physiologically relevant settings.
- Screening: Enables assay development for targets requiring native-like mobility, such as GPCRs or receptor tyrosine kinases, where immobilization may alter function.
- Analytics: Outputs FRET efficiency time traces, diffusion coefficients, and transition frequencies that inform quantitative structure-activity relationship modeling.
- Translational Research: Connects molecular-scale dynamics to cellular phenotypes, exemplified by force sensor applications in immune synapse formation.
- Enterprise Reuse: Open-source nature and modular design allow adaptation across projects targeting diverse biomolecular systems without revalidation of core algorithms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving heterogeneity in biomolecular populations through single-molecule, spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Standardizes smFRET analysis via automated pipelines, minimizing user-dependent variability in trace validation and quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into target engagement kinetics and conformational selectivity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on mechanistic consistency across biochemical and biophysical assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy, fluorescence correlation concepts, and Python-based data analysis environments.
- Needs widefield fluorescence microscopy with dual-color excitation capability, EMCCD or sCMOS camera, and stable laser illumination for ALEX smFRET.
- Demands standardization of illumination sequences, correction factor determination, and trajectory filtering criteria across users and sites.
- Adaptation to different membrane models (e.g., supported bilayers vs. live cells) may require optimization of probe labeling density and background suppression.
- Practical limitations include photobleaching constraints on trajectory length and the need for high signal-to-noise to resolve short-lived FRET states.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:05
Measurement of Samples
1:38
Localization, Tracking, and Fluorescence Intensity Analysis of Single Molecules
4:03
Analysis and Filtering of Single-molecule Data
6:41
Plotting of Results and Further Analysis
7:17
Results: Spatiotemporal Analysis of Mobile, smFRET-based Probes Using Widefield Fluorescence Microscopy
7:45
Conclusion
