Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul

Single-molecule FRET-experimenten met behulp van oppervlaktegebonden sondes zijn in het verleden bijna uitsluitend uitgevoerd op geïmmobiliseerde moleculen. Veel biomoleculen diffunderen echter en kunnen met onze methode worden geanalyseerd. Het combineren van single-molecule FRET met tracking maakt het mogelijk om niet alleen FRET-deficiëntietijdsporen van bewegende probes te analyseren, maar ook om spatiotemporale aspecten zoals het diffusiegedrag te onderzoeken.

Onze methode is compatibel met een verscheidenheid aan verschillende FRET-gebaseerde sondes. Het zou bijvoorbeeld inzichten kunnen bieden over moleculaire krachten, conformatiedynamica en bindingskinetiek in levende celexperimenten. Hoogwaardige single-molecule FRET-experimenten zijn notoir moeilijk uit te voeren.

Voor een betrouwbare kwantificering is het belangrijk om gegevens vast te leggen met een goede signaal-ruisverhouding en single-molecule tracks van voldoende lengte. Om de monstermeting te starten, prikkelt u de fluoroforen donor en accepter voor een geschikte verlichtingstijd terwijl u de camera activeert en wacht u totdat de camera-uitlezing is ingeschakeld. Herhaal de excitatie van de fluoroforen van de donor en accepter als alternatief.

Kies het aantal herhalingen dat groot genoeg is om fotobleaching van ten minste één fluorofoor per sonde binnen het gezichtsveld te garanderen, waardoor stapsgewijze fotobleachinganalyse mogelijk is om signalen van één molecuul van aggregaten te onderscheiden. Geef de verlichtingsvolgorde op om de selectie van donor- en accepter-excitatieframes en frames voor beeldsegmentatie van opgenomen beeldreeksen mogelijk te maken. Analyseer tegelijkertijd de datasets die zijn opgenomen met dezelfde verlichtingsinstellingen.

Wijs hiertoe een id en een patroon toe dat overeenkomt met de respectieve bestandsnamen van de afbeeldingsreeks aan elke gegevensset. Definieer daarnaast specifieke datasets voor speciale doeleinden, zoals opnames van fiduciële markers voor beeldregistratie, excitatielichtprofielen voor vlakke veldcorrectie en optioneel donor-only en accepter-only monsters om correctiefactoren te bepalen. Selecteer vervolgens emissiekanalen en RAW-beelden als beide kanalen zijn opgenomen met één camera.

Gebruik hiervoor de juiste grafische widget om de juiste regio's voor donor- en accepteeremissie te selecteren, lokaliseer vervolgens fiduciale markers in beide emissiekanalen en voer beeldregistratie uit. Gebruik de meegeleverde gebruikersinterface om de juiste parameters te vinden voor het lokalisatiealgoritme voor zowel donor- als accepteeremissiekanalen. Stel vervolgens lokalisatieparameters met één molecuul in voor FRET-sondes bij donorexcitatie in de som van de beelden die zijn verkregen van donor- en acceptoremissies en stel vervolgens lokalisatieparameters in voor sondes bij acceptorexcitatie in het acceptoremissiekanaal.

Lokaliseer de FRET-sondes onafhankelijk van elkaar op donor- en acceptorexcitatie in alle frames. De resultaten worden samengevoegd tot één tabel met het oorspronkelijke framenummer, tweedimensionale coördinaten en een id die verwijst naar het bronafbeeldingsbestand. Om de fluorescentie-intensiteit te volgen en te meten, kiest u geschikte opties voor het Trackpy-algoritme om FRET-sondelokalisaties in trajecten te koppelen.

Vervolgens, met behulp van de analysesoftwarefunctionaliteit, verwerken van hulpbeeldgegevens van beeldreeksen. Extra opgenomen beelden extraheren om segmentatie gemarkeerd door S in de excitatiesequentie te vergemakkelijken. Bepaal ten slotte de donor- en acceptor-excitatielichtprofielen over het gezichtsveld van beelden die zijn opgenomen op een dicht gelabeld monster.

Voor de eerste filterstappen moet u signalen met overlappende puntspreidingsfuncties weggooien, omdat het moeilijk is om hun fluorescentie-intensiteiten betrouwbaar te bepalen. In het geval van inhomogene verlichting, accepteer alleen signalen die zich in goed verlichte gebieden binnen het gezichtsveld bevinden om een goede signaal-ruisverhouding te garanderen. Als u intramoleculaire FRET bestudeert, beperk de analyse dan tot die trajecten die aanwezig zijn vanaf het begin van de beeldreeks.

Voer vervolgens de vlakke veldcorrectie uit, die de eerder verkregen excitatielichtbronprofielen gebruikt om de positieafhankelijke fluorescentie-intensiteitsvariaties veroorzaakt door inhomogene verlichting om te keren en vervolgens de schijnbare FRET-efficiëntie en de schijnbare stoichiometrie te berekenen. Om stapsgewijze analyse van fotobleaching uit te voeren voor het onderscheid tussen enkele moleculaire sondes en aggregaten, vindt u geschikte parameters voor het veranderingspuntdetectiealgoritme bij donor- en accepterexcitatie onafhankelijk van elkaar. Voer vervolgens het wijzigingspuntdetectiealgoritme uit.

Als u een spoor wilt verwijderen dat dubbelzinnig fotobleekend gedrag vertoont, definieert u intensiteitsdrempels waaronder een fluorofoor als gebleekt wordt beschouwd en selecteert u vervolgens een van de volgende opties. Optie één waarbij de acceptor fluorofoor in één stap bleekt terwijl de donor geen gedeeltelijke bleeking vertoont. Optie twee waarbij de donor in één stap bleekt terwijl er geen gedeeltelijke acceptorbleking is.

Optie drie waarbij een van beide fluoroforen in één stap bleekt, terwijl de andere niet gedeeltelijk bleekt. En optie vier waarbij donor- en acceptorfluooforen eenstapsfotobleaching of helemaal geen fotobleaching vertonen. Bereken vervolgens de correctiefactoren voor donoremissielekkage in het acceptorkanaal, directe acceptorexcitatie, detectie-efficiëntie en excitatie-efficiëntie.

Gebruik vervolgens de correctiefactoren om de FRET-efficiëntie te berekenen op basis van schijnbare efficiëntie en stoichiometrie op basis van schijnbare stoichiometrie. Voor verdere filtering selecteert u alleen gegevenspunten van vóór de eerste bleekgebeurtenis in elk traject. Bovendien, om de analyse te beperken tot sondes met één molecuul, accepteert u alleen trajecten met ten minste 75% van de gegevenspunten binnen de juiste stoichiometriegrenzen.

Voer vervolgens beeldsegmentatie uit via globale of adaptieve drempelmethoden op de juiste hulpbeelden om de analyse te beperken tot verschillende gebieden in het gezichtsveld. Creëer efficiëntie versus stoichiometrie plots om te controleren of signalen van onjuiste stoichiometrie correct zijn geïdentificeerd en verwijderd. Plot vervolgens histogrammen van FRET-efficiënties om een goed vastgesteld overzicht van FRET-efficiëntieverdelingen te bieden en groepeer de histogrammen voor een gemakkelijke vergelijking van resultaten van verschillende experimenten.

Door gebruik te maken van wetenschappelijke Python-bibliotheken is het mogelijk om de gegevens in het notitieblok verder te evalueren, bijvoorbeeld door diffusieanalyses uit te voeren. Visualisatie en tracking van single-molecule FRET-gebeurtenis worden hier getoond. Gefilterde FRET-gebeurtenissen worden weergegeven door efficiëntie versus stoichiometrieplots in een FRET-efficiëntiehistogram.

Verder kunnen mobiliteitsparameters worden onderzocht door een individueel trajectpad uit te zetten in een XY-plot of een gemiddelde vierkante verplaatsingsplot. De output van ons platform stelt ons in staat om overgangen in FRET-efficiëntietijdsporen van mobiele sondes verder te identificeren. Bijvoorbeeld om conformationele veranderingen van de biomoleculen te evalueren.

Met behulp van een FRET-gebaseerde krachtsensor stelde het analyseplatform ons in staat om krachtgebeurtenissen met één molecuul in de immunologische synaps te kwantificeren tijdens vroege T-celsignalering.