Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen
1 juli 2022
Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en genereren van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van de muis. Procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen zijn goedgekeurd door de Instelling Animal Ethics Committee van Nanjing Medical University.One.Inleiding. Met de toename van tumorimmuniteitsonderzoek neemt de vraag naar DC-cellen geleidelijk toe.
DC's zijn echter zeldzaam in alle weefsels. De traditionele methode om voornamelijk de differentiatie van beenmerg in DC's te induceren, is ingewikkeld en kostbaar. Twee. Isolatie van beenmerg en voorbereiding van BM-cellen We offeren muizen op en fixeren ons op de operatietafel van de muis.
Snijd de huid van de linker blootgestelde spieren en dijbeenslagader. Snijd de dijbeenslagader niet direct door. Anders zal het zware bloedingen veroorzaken en het gezichtsveld besmetten.
Snijd alle spieren rond het dijbeen. Strek langzaam de onderste ledematen van de muis naar buiten tot verzakking van de heupkop en kan worden waargenomen. Scheid de onderste ledematen van het lichaam.
Snijd het achterbeen af om een vrij en compleet dijbeen te verkrijgen. Verwijder de spieren met behulp van gaas. Scheur de spieren niet direct.
Het dijbeen van muizen is fragiel. Plaats het dijbeen twee tot vijf minuten in 75% alcohol. Drie. Injectiecultuur van BMDC Spoel de resterende alcohol af met PBS.
Klem het middelste en onderste deel van het dijbeen vast met een hemostatische tang en klem het onderste uiteinde van het dijbeen vast met een andere hemostatische tang. De hemostatische tang wordt letterlijk op het dijbeen aangebracht en het dijbeen wordt gebroken van de epifysaire lijn. Gebruik één ml spuit om de beenmergholte van de epifysaire lijn te doorboren.
Gebruik volledig medium twee delen spoel de beenmergholte totdat het bot wit wordt. Verzamel spoelvloeistoffen. Aanvulling van het volledige medium met GM CSF /IL-4 tot 24ml, en zaad in een 6-well plaat met 4ml per put. Vier.Resultaten.
Vervang na twee dagen alle mediums die GM-CSF/IL-4 bevatten. De helft verving het volledige medium met GM-CSF/IL-4, op de vierde en zesde en achtste dag. Het aantal cellen bereikte een piek op de zevende dag en nam vervolgens geleidelijk af.
DC-cellen vormden een groot aantal synapsen die een typische volwassen DC-celmorfologie vertoonden. Flow submetrische analyses tonen aan dat de verhouding van CD11c opgelegd wat 71% op de zesde dag, brede ratio toename tot 96,1% op de 10e dag. De expressie van CD11c, CD80 en MSC2 nam geleidelijk toe met toenemende teelttijd. Vijf.Conclusie.
Kortom, we hebben een economisch en efficiënt protocol opgesteld voor het isoleren en genereren van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen, dat slechts 10 minuten nodig heeft om beenmergcellen te scheiden. Een groot aantal zeer zuivere DC's werd geoogst na zes tot zeven dagen cultuur met 10ng per ml, GM-CSF en IL-4.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een economische en efficiënte methode voor het isoleren en genereren van hoogzuivere dendritische cellen uit het beenmerg van muizen. Het protocol omvat een kweek van 7 dagen met GM-CSF/IL-4.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Dendritische cellen (DCs) zijn essentieel voor onderzoek naar tumorimmuniteit.
- DCs komen zelden voor in weefsels, wat hun isolatie bemoeilijkt.
- Traditionele methoden voor DC-differentiatie zijn complex en kostbaar.
- Deze studie heeft tot doel het proces van het genereren van DCs uit beenmerg te vereenvoudigen.
Doel van de studie
- Om een kostenefficiënte methode te ontwikkelen voor het isoleren van DC's.
- Om de efficiëntie van de generatie van DC's uit muizenbeenmerg te verbeteren.
- Om onderzoek naar tumorimmuniteit te ondersteunen door het leveren van hoogzuivere DC's.
Gebruikte methoden
- Isolatie van beenmerg uit muizen.
- Kweek van beenmergcellen met GM-CSF/IL-4.
- Beoordeling van celzuiverheid en levensvatbaarheid.
- Goedkeuring van de Institutionele Commissie voor Dierenethiek.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogzuivere uit het beenmerg afgeleide DC's.
- Aangetoonde efficiëntie van het nieuwe protocol.
- Potentieel voor bredere toepassing in onderzoek naar tumorimmuniteit.
- Vermindering van tijd en kosten in vergelijking met traditionele methoden.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is een levensvatbaar alternatief voor de generatie van DC.
- Deze aanpak kan verder onderzoek in de immunologie faciliteren.
- Toekomstige studies kunnen toepassingen in diverse therapeutische contexten verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol pakt de bottleneck in de aanvoer van dendritische cellen voor immunologie- en tumorimmuniteitsonderzoek aan door een economische methode met een hoog rendement te bieden voor het isoleren van uit het beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen. Het maakt de schaalbare generatie van fenotypisch gekenmerkte DC's mogelijk met een verminderd verbruik van reagentia en minder handmatige tijd, wat vroege-fase target-validatie en mechanistische studies in immunotherapie-pipelines ondersteunt. De aanpak verbetert het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door een reproduceerbaar, ziekte-relevant systeem te leveren voor het evalueren van immuunmodulatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de functie van dendritische cellen bij antigeenpresentatie en T-celactivatiepaden.
- Operationele waarde: Vermindert de kosten en complexiteit van DC-generatie door gebruik van gestandaardiseerde GM-CSF/IL-4-differentiatie.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via fenotypische karakterisering van de expressie van CD11c, CD80 en MHC II over tijd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert dendritische celpopulaties met een hoge zuiverheid (80%-95% CD11c+) die geschikt zijn voor gestandaardiseerde immuunassays.
- Operationele waarde: Levert tot 2,7 x 107 cellen per muis op, waardoor high-throughput screeningformaten mogelijk worden.
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een consistent biologisch systeem voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de rijping van dendritische cellen en de immuunfunctie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een ziekterelevant systeem voor het modelleren van dendritische celresponsen in contexten van tumorimmuniteit.
- Operationele waarde: Ondersteunt de preklinische evaluatie van immunomodulerende middelen met gedefinieerde cellulaire inputs.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door het fenotype van dendritische cellen te koppelen aan functionele uitkomsten in co-cultuursystemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, en biedt een hernieuwbare bron van dendritische cellen voor assays die gericht zijn op immunologie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van immuunpaden die afhankelijk zijn van dendritische cellen en target engagement.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve cellulaire outputs voor het beoordelen van immunomodulerende activiteit.
- Analytics: Maakt flowcytometrie-gebaseerde meting van CD11c, CD80 en MHC II mogelijk als read-outs voor rijping.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro generatie van dendritische cellen met preklinische modellen van immuunactivatie en tolerantie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd, schaalbaar protocol voor de productie van dendritische cellen over verschillende immunologieprojecten heen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door fenotypisch gedefinieerde dendritische cellen als input.
- Operationele waarde: Vermindert tijd en kosten via een oogst van beenmerg van 10 minuten en een lage cytokine-dosering (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare modellen van dendritische cellen te leveren voor screening van immunotherapie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk met behulp van gestandaardiseerde immuuneffectorcellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het isoleren van muisbeenmerg en aseptische celkweektechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot 6-wells platen, hemolytische pincetten en flowcytometrie voor fenotypische validatie.
- Necessiteert standaardisatie van de cytokoneconcentratie en het schema voor mediumverversing tussen gebruikers.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij vertaling naar andere muisstammen of genetische achtergronden.
- Beperkt door het kweekvenster van 7–10 dagen en de daarmee gepaard gaande afname van de cellevensvatbaarheid na het hoogtepunt.
