Isolatie van murine retinale endotheelcellen voor next-generation sequencing

Deze methode van retinale endotheelcelisolatie zal geavanceerde sequencingtechnieken mogelijk maken om nieuwe mechanismen van vasculaire ontwikkeling te onthullen. Het beschreven protocol is geoptimaliseerd voor hoge mate van levensvatbaarheid en zuiverheid, die essentieel zijn voor sequencingtoepassingen van de volgende generatie. De procedure wordt gedemonstreerd door Shelby Cain, een afgestudeerde student van het Hershey Laboratory.

Begin met het verwijderen van ogen van de geëuthanaseerde neonatale muis door de huid en het membraan over het oog weg te snijden met een loodrechte incisie van het ooglid met behulp van een dissectieschaar. Gebruik vervolgens de tang om boven en onder het oog naar beneden te drukken, zodat het oog uit de oogkas beweegt. Knijp voorzichtig onder het oog met de tang en snijd de oogzenuw door die het oog vasthoudt.

Plaats vervolgens beide ogen van de muis in een putje van de 48-well plaat in de vers bereide ijskoude PBS totdat de oogst is voltooid. Om het retinale weefsel van de muis te isoleren, hangt u de ogen in het dissectiekussen in een petrischaal gevuld met 500 microliter ijskoude PBS met behulp van een transferpijppad met een brede punt. Werk onder de dissectiemicroscoop, houd de oogzenuw vast met één fijne tang en gebruik de tweede tang om het gat door de voorste kamer van het oog te prikken waar het hoornvlies en de sclera verbinding maken.

Scheur vervolgens het gat in een cirkel ongeveer 75% van de weg rond het hoornvlies. Terwijl u de oogzenuw met één tang vasthoudt, gebruikt u de tweede tang om de sclera en het glasvochtlichaam voorzichtig van het netvliesweefsel te scheuren. Om lens- en hyaluzolvaten te verwijderen, reikt u met een open tang naar het netvlies totdat u deze bijna aanraakt en sluit u vervolgens de tang om de lens- en hyaluzolvaten uit het netvlies te grijpen en te trekken.

Wanneer alle vaten zijn verwijderd, plaatst u de netvliezen in de twee milliliter microcentrifugebuizen gevuld met 500 microliter van één x ijskoude PBS. Verwijder overtollige PBS uit de twee milliliter microcentrifugebuis met een pipet die ongeveer 100 microliter PBS in de buis achterlaat om het retinale weefsel volledig te bedekken. Voeg vervolgens 500 microliter van de vers bereide verteringsoplossing toe aan de buis.

Gebruik een P1000 pipetta en pipetpunt om vijf keer op en neer te pipetteren in het netvliesweefsel in de spijsverteringsoplossing. Als u klaar bent, incubeer het spijsverteringsmengsel gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius met het pipetteren van het spijsverteringsmengsel elke vijf minuten op en neer, zoals eerder uitgelegd. Na incubatie lost het netvliesweefsel op in een eencellige suspensie waardoor het spijsverteringsmengsel troebel wordt.

Pelleteer vervolgens de cellen door centrifugeren op 375 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie de PBS uit de gewassen celpellet door pipetteer en vervolgens de cellen te immunosuppelen door de pellet in 100 microliter antilichaamkleuringsoplossing per 0,5 maal 10 naar de zesde cellen te resuspenderen. Incubeer de eencellige suspensie met de antilichaamkleuringsoplossing gedurende 30 minuten op ijs in het donker door elke 10 minuten op de buis te tikken om de cellen voorzichtig te mengen.

Voor fluorescentie-geactiveerde celsortering pelleteert u de cellen door centrifugering op 375 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van het supernatant, was en pelleteer de cellen in 500 microliter PBS zoals eerder beschreven. En resuspenseer vervolgens de cellen in 300 microliter fluorescentie-geactiveerde celsortering of FACS-buffer door voorzichtig te mengen met de pipetta.

Voeg vervolgens propidiumjodide of PI toe als levensvatbaarheidsmarker aan de monsterbuizen die de FACS-buffer bevatten om een uiteindelijke concentratie van 0,5 microgram per milliliter te krijgen. Gebruik een pipet om de celsuspensies door een klikdop voor celzeef met een filter van 35 micron over te brengen in een reageerbuis van vijf milliliter. Houd na filtratie de FACS-buis op ijs in het donker en breng de buis vervolgens over naar de celsorteerder.

Schakel het FACS-instrument en de computer in en open de FACS-software om het FACS-instrument uit te voeren en te bedienen. Voer routinematige kwaliteitscontroletests uit. Laad de controlevlekmonsters in het FACS-instrument om de assen aan te passen.

Begin met IgG-antilichaam alleen cellen om voorwaartse verstrooiing en zijverstrooiing te genereren en aan te passen. Dan CD31 antilichaam alleen om CD31 te genereren en aan te passen. En dan CD45-antilichaam alleen om CD45 te genereren en aan te passen.

Noteer de gegevens van de controlemonsters. Laad vervolgens de gekleurde monstercellen in het FACS-instrument en voer het monster uit. Loop de cellen op basis van forward scatter of FSC en side scatter of SSC parameters.

Loopcellen van FSCA en FSCH om celdubbelen te identificeren en alleen enkele cellen te verzamelen. Loopcellen door PI en SSCA om levensvatbare cellen te identificeren. Maak een CD31+CD45-gang met bedieningselementen Maak een CD31+CD45-gang met bedieningselementen en loop de cellen van CD31 en CD45.

Steek een opvangbuis met 250 microliter FACS-buffer in het instrument. Begin vervolgens met het sorteren van cellen die CD31 + CD45-zijn in de geïnstalleerde verzamelbuis. Bewaar de verzamelbuizen op ijs voor verdere analyse.

De monsters kunnen worden verwerkt voor sequencingtoepassingen van de volgende generatie. In de studie beïnvloedde het variëren van de verteringstijd de celopbrengst en het levensvatbaarheidspercentage. De verteringstijd van 20 minuten resulteerde in een optimale opbrengst met een laag percentage niet-levensvatbare endotheelcellen.

Latere propidiumjodidekleuring toonde aan dat de geïsoleerde endotheelcellen levensvatbaar bleven gedurende 60 minuten na isolatie. De zuiverheid van de celpopulatie werd beoordeeld door kwantitatieve PCR- of qPCRR-analyse van de expressie van endotheelcelgenen die een sterke verrijking voor endotheelcelgenen in de CD31+CD45-populatie vertonen. RNA zuiveren uit de geïsoleerde endotheelcellen die cDNA omzetten en versterken door bibliotheekvoorbereiding en sequencing De cDNA-bibliotheek resulteerde in meer dan 16.000 genen geïdentificeerd in negen onafhankelijke monsters.

Een daling van transcripten per miljoen reads of TPM werd waargenomen in genen onder deze drempel. De single cell RNA sequencing van de geïsoleerde retinale endotheelcellen door de 10x Genomics pijplijn resulteerde in een mediaan van 1.171 genen per cel, 15.247 totale gedetecteerde genen en een mediaan van 2.255 unieke moleculaire identifier of UMI-tellingen per cel in 917 cellen. De kritieke stappen in dit protocol zijn retinale weefselisolatie en weefselvertering, die nauwkeurig moeten worden uitgevoerd zoals beschreven om de celopbrengst en levensvatbaarheid te optimaliseren.

De geïsoleerde endotheelcellen kunnen worden gebruikt in geavanceerde sequencingtechnieken zoals whole-transcriptome RNA sequencing, single cell RNA sequencing, chromatine immunoprecipitation sequencing en assay voor transposase-accessible chromatine sequencing. Het gebruik van deze geoptimaliseerde methode in combinatie met next-generation sequencingmethoden en computationele benaderingen kan de mechanismen van onderling verbonden signaalroutes die vasculaire ontwikkelingen reguleren verder ophelderen.