Name: Een drievoudig kweekcelsysteem dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Ontdek een drievoudig kweekcelsysteem met endotheelcellen, pericyten en astrocyten dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert. Deze methode ondersteunt preklinisch onderzoek naar geneesmiddelafgifte en nanopartikeltransport.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt toegekend door het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 764958, als onderdeel van het NANOSTEM-project, een Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Deze studie wordt toegekend door de "Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais" (Fellowship aan Clémence Deligne), de "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent" (SFCE), de Association "l'étoile de Martin" en de Association "Cassandra contre la leucémie".

Het protocol werd goedgekeurd door het Franse ministerie van Hoger Onderwijs en Onderzoek (referentie: CODECOH DC2011-1321) en door de lokale onderzoeksbeoordelingscommissie (Béthune Maternity Hospital, Beuvry, Frankrijk). Voor het verkrijgen van de endotheelcellen (EC's) werd schriftelijke en geïnformeerde toestemming van de ouders van de donor verkregen om navelstrengbloed te verzamelen, in overeenstemming met de Franse wetgeving. De pericyten worden geleverd door professor Takashi Kanda (afdeling Neurologie en Klinische Neurowetenschappen, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Japan) die werden geïsoleerd volgens Referentie19. Primaire menselijke hersenschors astrocyten worden gekocht bij een commerciële leverancier (zie Tabel van materialen).
1. Celkweek
<ol><li>Kweken van endotheelcellen OPMERKING: Endotheelcellen (EC's) zijn afgeleid van CD34+ hematopoëtische stamcellen geïsoleerd uit menselijk navelstrengbloed, volgens de methode beschreven door Pedroso et al.20. Het endotheelfenotype van de EC's wordt beschreven in Pedroso et al.20.
	<ol><li>Cultiveer menselijke EC's met behulp van endotheelcelmedium aangevuld met 5% foetaal kalfsserum (FCS), 0,5% gentamicine en 1% endotheelcelgroeisupplement (ECM) (zie materiaaltabel).</li>
		<li>Voor het subkweeken van EC's, twee dagen voor het instellen van het model, bekleedt u één schaal met 10 ml 2% gelatine gedurende 15 minuten bij 37 °C en vervangt u deze vervolgens door 20 ml warme ECU. Ontdooi één injectieflacon met EC's met 1 miljoen cellen (cellen werden handmatig geteld zoals beschreven in stap 2.3.3 vóór het invriezen van de cel) in de voorgecoate celkweekschaal.</li>
		<li>Vernieuw na 3 uur bij 37 °C het medium en onderhoud de cellen tot de uitharding van de tricultuur in een bevochtigde atmosfeer in een incubator bij 37 °C onder 5% CO2 en 21% O2.</li>
	</ol></li>
	<li>Kweken van pericyten OPMERKING: De pericyten worden geïsoleerd uit het menselijk brein volgens het protocol gepubliceerd door Shimizu et al.19, waarvan de isolatieprocedure de methode volgt die is gepubliceerd door Kanda et al.21 met wijzigingen.<ol><li>Cultiveer de pericyten met behulp van Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium aangevuld met 4,5 g / L glucose (DMEM HG), 10% FCS, 1% de penicilline / streptomycine en 1% L-glutamine (zie materiaaltabel).</li>
		<li>Voor pericytensubkweek, vijf dagen voor het instellen van het model, bekleedt u twee gerechten met 8 ml / schaal van 100 μg / ml collageen type I-oplossing in 0,02 N azijnzuur gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) en wast u vervolgens tweemaal met RT DMEM HG. Ontdooi één injectieflacon met pericyten met 1 miljoen cellen in een conische buis met 10 ml warm medium en centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 190 x g bij 20 °C.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 10 ml warm medium en zaad in de voorgecoate celcultuurschalen voorgevuld met 15 ml warm medium / schaal. Het medium wordt na 3 dagen vernieuwd en de cellen worden onderhouden tot de uitharding van de tricultuur in een bevochtigde incubator bij 37 °C onder 5% CO2 en 21% O2.</li>
	</ol></li>
	<li>Kweken van astrocyten<ol><li>Cultiveer de astrocyten met behulp van een astrocytenmedium aangevuld met 20% FCS, 1% astrocytengroeisupplement en 1% penicilline / streptomycine-oplossing (AM) (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Voor het subkweken van de astrocyten, een week voor het instellen van het model, bekleedt u één T75 celkweekkolf met 10 ml 2 μg/cm2 poly-L-lysine (PLL) gedurende 1 uur bij 37 °C en wast u tweemaal met RT steriel water. Ontdooi één injectieflacon met astrocyten met 1 miljoen cellen in 20 ml warm medium en zaad in de voorgecoate T75-celkweekkolf. OPMERKING: De commercieel verkregen celflacons bevestigen de aanwezigheid van ~ 1 miljoen cellen, dus het tellen van cellen werd hier niet uitgevoerd.</li>
		<li>Houd de cellen in een bevochtigde incubator op 37 °C onder 5% CO2 en 21% O2. Het medium wordt na 24 uur vernieuwd en vervolgens om de 2 dagen tot de setting van de tricultuur.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Drievoudige cultuurmodelinstelling
OPMERKING: De assemblage van de drie celtypen wordt op dezelfde dag uitgevoerd. De dag voor het instellen van de tricultuur, voert u de collageen type I-coating uit op de omgekeerde insertfilters (zie Materiaaltabel) en zaait u de astrocyten in de PLL-voorgecoate putten van een 12-well plaat.
<ol><li>Zaaien van astrocyten in de putten<ol><li>Bedek de putten met 500 μL 2 μg/cm2 PLL-oplossing zoals beschreven in stap 1.3.2.</li>
		<li>Was de cellen eenmaal met 10 ml warme fosfaatbufferzoutoplossing - calcium- en magnesiumvrij 1X (1X PBS-CMF) (tabel 1) voordat u gedurende 3 minuten bij 37 °C broedt met 10 ml warme 20% trypsine/EDTA (T/E) oplossing en maak de cellen mechanisch los van de kolf. Breng de suspensie over in een conische buis met 5 ml warme niet-verdunde FCS. OPMERKING: Volgens protocol22 van de provider kan de verzameling astrocyten worden geoptimaliseerd door de kolf gedurende 1 minuut in de incubator te plaatsen en op de kolf te tikken om het losmaken te voltooien. De resterende cellen moeten worden verzameld met 5 ml T/E-neutralisatieoplossing en in de FCS-bevattende conische buis worden geplaatst.</li>
		<li>Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 20 °C bij 190 x g.</li>
		<li>Resuspendeer de celpellet in 5 ml warme AM. Tel de cellen door 20 μL van de celsuspensie te verdunnen in 80 μL 1X PBS-CMF met behulp van een handmatige telkamer onder een microscoop (zie Materiaaltabel). Plaat ongeveer 40.000 cellen/cm2 in elke PLL-voorgecoate put in een volume van 1,5 ml warme AM.</li>
	</ol></li>
	<li>Zaaien van pericyten op de omgekeerde wisselplaatfilters<ol><li>Voeg 250 μL collageen type I-oplossing (100 μg/ml) toe aan de omgekeerde wisselplaatfilters, geplaatst aan de rand van een bedekte schaal van 25 mm hoog (zie materiaaltabel) met behulp van een steriel pincet. Laat de coating 1 uur op RT staan onder steriele omstandigheden. OPMERKING: De gebruikte schaal moet hoog genoeg zijn om het behoud van de steriliteit buiten de afzuigkap te garanderen en contact tussen de oplossingen op het omgekeerde filter en de deksel van de schaal te vermijden.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de collageen type I-oplossing met een glazen pipet die is aangesloten op een afzuigsysteem. Was tweemaal met 250 μL RT DMEM HG en verwijder vervolgens voorzichtig alle oplossing uit de wisselfilters. Laat de gecoate insertfilters onder steriele omstandigheden op RT staan tot het zaaien van de cellen. OPMERKING: Let op: Let er tijdens de coatingprocedure op dat u het filter niet aanraakt om membraanschade te voorkomen. Eenmaal gecoat met collageen type I, kunnen de insertfilters 's nachts bij RT worden bewaard.</li>
		<li>Was op de dag van de tricultuur de pericyten tweemaal met 10 ml warme 1X PBS-CMF en incubeer de cellen met 2 ml warm trypsine. Monitor de werking van het trypsine door de cellen onder de microscoop te observeren. Zodra de cellen beginnen los te komen, verwijdert u het trypsine en voegt u 5 ml warme ECU toe voor mechanische dissociatie.</li>
		<li>Tel de cellen door 20 μL van de celsuspensie te verdunnen in 80 μL 1X PBS-CMF met behulp van een handmatige telkamer onder een microscoop, en zaai 44.500 cellen/cm2 op de voorgecoate omgekeerde insertfilters in een volume van 250 μL. Bewaar de insertfilters in een bevochtigde incubator op 37 °C gedurende 3 h onder 5% CO2 en 21% O2.</li>
		<li>Draai de wisselplaatfilters voorzichtig om met een steriel pincet in een 12-well plaat met 1,5 ml warme ECU/ put. De wisselplaatfilters zijn nu klaar om aan de andere kant te worden gecoat.</li>
	</ol></li>
	<li>Zaaien van endotheelcellen op de insertfilters<ol><li>Bekleed de bovenzijde van de wisselplaatfilters met 500 μL extracellulaire hydrogel op basis van matrix (1/48 v/v) (zie Materiaaltabel). Na 1 uur, in een bevochtigde incubator bij 37 °C onder 5% CO2 en 21% O2, eenmaal wassen met 500 μL RT DMEM HG.</li>
		<li>Was eenmaal met 10 ml warme 1X PBS-CMF en incubeer de cellen met 2 ml warm trypsine. Zodra de cellen beginnen los te komen, verwijdert u het trypsine en voegt u 5 ml warme ECU toe voor mechanische dissociatie.</li>
		<li>Tel de cellen door 20 μL van de celsuspensie te verdunnen in 80 μL 1X PBS-CMF met behulp van een handmatige telkamer onder microscoop en zaai de EC's met een dichtheid van 71.500 cellen/cm2 op de voorgecoate wisselplaatfilters in een volume van 500 μL warme ECU.</li>
		<li>Vervang AM door 1,5 ml warme ECU/put en breng vervolgens de gezaaide wisselplaatfilters (EC's + pericyten) over op de putten die de astrocyten bevatten.</li>
		<li>Plaats de tricultuurcelsystemen in een bevochtigde incubator bij 37 °C onder 5% CO2 en 21% O2.</li>
	</ol></li>
	<li>Onderhoud van de drievoudige celcultuur voor de inductie van de BBB-eigenschappen OPMERKING: Voor de inductie van de BBB-eigenschappen in de EC's zijn 6 dagen drievoudige cultuur nodig.<ol><li>Vernieuw het medium om de dag tot dag 6 en verwijder het medium voorzichtig uit het bovenste en onderste compartiment met behulp van een glazen pipet die is verbonden met een afzuigsysteem.</li>
		<li>Vervang snel door warme ECU in een volume van 500 μL in het bovenste compartiment en 1,5 ml in het onderste compartiment en plaats de cellen terug in een bevochtigde incubator bij 37 °C onder 5% CO2 en 21% O2.</li>
	</ol></li>
</ol>3. BBB fenotype validatie
OPMERKING: Na 6 dagen drievoudige kweek, de tijd die nodig is om het BBB-fenotype in de EC's te induceren, is het menselijke BBB-model klaar voor experimenten. De fysieke integriteit van de hersenachtige endotheelcellen (BCC's) wordt gevisualiseerd door immunofluorescentiekleuring van TJ-eiwitten geëvalueerd met behulp van permeabiliteitstest tot BBB-integriteitsmarkers. De BBB-fenotypevalidatie omvat ook de analyse van genen/eiwitten en de functionaliteit van effluxpompen volgens de procedure beschreven in Deligne et al.,23. Pericyten en astrocyten worden gevisualiseerd door respectievelijke kleuringsmarkers volgens de procedure beschreven in Deligne et al. 202023.
<ol><li>Immunofluorescentiekleuring<ol><li>Bevestig de wisselplaatfilters en astrocyten in ijskoude methanol/aceton (50/50 v/v) gedurende 1 min en was tweemaal met RT 1X PBS-CMF.</li>
		<li>Scheid het filter voorzichtig van de insert door het membraan te snijden met behulp van een scalpel. Voer immunocytochemie uit op het membraan en de bodemputten volgens Deligne et al.23. OPMERKING: Gebruik voor de blokkerende stap 250 μL SEA BLOCK-blokkeringsbuffer (zie Materiaaltabel) gedurende 30 minuten bij RT.</li>
	</ol></li>
	<li>BBB integriteitstest<ol><li>Beoordeel de fysieke integriteit van de BCC's door middel van een permeabiliteitstest met behulp van BBB-integriteitsmarkers met verschillende molecuulgewichten, zoals natriumfluoresceïne (NaF) en 20 kDa Dextran (FD20) (zie materiaaltabel). OPMERKING: Het experiment kan worden uitgevoerd volgens de procedure beschreven in Deligne et al.23.</li>
	</ol></li>
	<li>Efflux pomp functionaliteit<ol><li>Beoordeel de functionaliteit van P-glycoproteïne (P-gp) en borstkankerresistentie-eiwit (BCRP) door de intracellulaire accumulatie van Rhodamine 123 (R123) te meten met en zonder Elacridar, een P-gp en BCRP-remmer (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Het experiment kan worden uitgevoerd volgens de procedure beschreven in Deligne et al.23.</li>
	</ol></li>
	<li>Gen- en eiwitexpressies<ol><li>Voer gen- en eiwitmonsters op ijs uit na een snelle wasbeurt met koude Ringer HEPES (RH) (tabel 1) van de cellen. Schraap vóór de EG-monsterneming de pericyten van de omgekeerde wisselplaatfiltersaf 20.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nanogel transport
OPMERKING: Om de passage van polymere nanogels (NGs) van het luminale naar het abluminale compartiment van het tricultuur BLEC-model te schatten, werd 0,1 mg / ml NG-oplossing toegevoegd op dag 6 op het luminale compartiment gedurende 24 uur. Bestudeerde NG's werden fluorescerend gelabeld N-Isopropylacrylamide (NIPAM) -gebaseerde hydrogels met een gemiddelde grootte van 8-10 nm (zie Tabel van materialen).
<ol><li>Weeg het nanogelpoeder en isoleer het in ECU in een concentratie van 1 mg/ml. Soniceer de oplossing gedurende 10 minuten en filter met een PTFE-filter van 0,2 μm. OPMERKING: Bereid een nieuwe NG-oplossing op de dag van het experiment.</li>
	<li>Vervang het medium in het luminale compartiment en voeg 50 μL NGs-oplossing toe in het bovenste compartiment voor een eindconcentratie van 0,1 mg/ml. OPMERKING: Voer een verdunning van 1:10 uit van de oorspronkelijke oplossing.</li>
	<li>Verzamel na 24 uur incubatie aliquots uit luminale (20 μL) en abluminale (200 μL) compartimenten en plaats ze in een zwarte 96-well plaat.</li>
	<li>Kwantificeer de fluorescentie met behulp van een fluorescerende multiplate-lezer (zie Materiaaltabel) met een zwarte 96-well plaat met behulp van de instelling van excitatie/ emissiegolflengten op 477/540 nm. Bereken het percentage kruisingen dat wordt verwezen naar de oorspronkelijke werkoplossing die op dat moment is toegevoegd = 0 h (t0)6,15. OPMERKING: Voeg 200 μL oplossing uit het abluminale compartiment en 20 μL oplossing uit het abluminale compartiment en 20 μL oplossing uit het luminale compartiment en t0-preparaat toe (voeg 180 μL ECU toe om een eindvolume van 200 μL te bereiken). Voeg ook een kalibratiecurve en een blanco op de leesplaat toe. Instrumentele parameters: Detectiemethode - Fluorescentie, Optische Positie - Top, Leestype - Eindpunt, Excitatiegolflengte - 477 nm, Emissiegolflengte - 540 nm, Gevoeligheid - 100, Schud - Dubbel Orbitaal gedurende 5 s.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).</li>
<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+W+%22L.Advanced+science%22">L.Advanced science</a>. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937(2021).</li>
<li>Vashist, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogels+as+potential+drug+nanocarriers+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery.</a> Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).</li>
<li>Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+for+crossing+the+BBB+with+nanoparticles%3A+The+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design.</a> Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).</li>
<li>Bernardo-Castro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+nanoparticles+for+the+different+phases+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke.</a> Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482(2021).</li>
<li>Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+L-proline+based+thermoresponsive+and+pH-switchable+nanogel+as+a+drug+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle.</a> Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).</li>
<li>Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+crosslinked+nanogels%3A+An+NMR+study+of+the+effect+of+monomer+reactivity+on+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure.</a> Polymers. 11 (2), 353(2019).</li>
<li>Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9DSmart%E2%80%9D+polymer+nanogels+as+pharmaceutical+carriers%3A+A+versatile+platform+for+programmed+delivery+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics.</a> ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).</li>
<li>Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+biological+barriers+with+nanogels+to+improve+drug+delivery+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).</li>
<li>Basso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-based+drug+delivery+nanosystems+for+the+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors.</a> Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62(2018).</li>
<li>Harilal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+blood-brain+barrier%3A+A+hard+nut+to+crack+in+the+transportation+of+drug+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules.</a> Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).</li>
<li>Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+polymeric+nanovehicles+for+neural+stem+cell+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation.</a> Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood-brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).</li>
<li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+in+vitro+techniques+for+blood-brain+barrier+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).</li>
<li>Shimizu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+pericytes+modify+the+blood-nerve+barrier+function+and+tight+junctional+molecules+through+the+secretion+of+various+soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).</li>
<li>Pedroso, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival%2C+vascular+differentiation+and+wound+healing+potential+of+stem+cells+co-cultured+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells.</a> PLoS One. 6 (1), 16114(2011).</li>
<li>Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+bovine+endothelial+cells+of+endoneurial+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin.</a> Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).</li>
<li>Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources">https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources</a> (2021).</li>
<li>Deligne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+in+vitro+blood-brain+tumor+barrier+model+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+to+better+understand+the+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37(2020).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), 99733(2014).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+physiology+to+disease+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
<li>Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+Physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+brain+pericytes+in+blood-brain+barrier+formation+and+maintenance%3A+A+transcriptomic+study+of+co-cultured+human+endothelial+cells+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells.</a> Fluids Barriers CNS. 17, 48(2020).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).</li>
<li>Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+reinforces+the+blood-brain+properties+in+a+serum+free+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).</li>
<li>Drolez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+relevant+in+vitro+blood-brain+barrier+model+to+investigate+pro-metastatic+features+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines.</a> PloS One. 11 (3), 0151155(2016).</li>
<li>Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+astrocytes+in+an+in+vitro+stroke+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).</li>
<li>Mysiorek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B1+activation+protects+brain+capillary+endothelial+cells+from+oxygen-glucose+deprivation-induced+hyperpermeability+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier.</a> Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Culot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+protection+as+a+possible+mechanism+for+the+protective+effects+of+NXY-059+in+preclinical+models%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study.</a> Brain Research. 1294, 144-152 (2009).</li>
<li>Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+co-culture+in+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+use+in+cancer+research%3A+Maintaining+an+appropriate+endothelial+monolayer+for+the+assessment+of+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration.</a> Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+Blood-Brain+Barrier+endothelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology.</a> BMC Neuroscience. 12, 40(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Behandeling van hersenziekten blijft een uitdaging gezien de moeilijkheid van de medicijnen om over de BBB te lopen om hun cellulaire en moleculaire doelen in het hersenparenchym te bereiken.
De ontwikkeling van geneesmiddelen voor hersenziekten vertoont momenteel een laag slagingspercentage, omdat de meeste geneesmiddelen met veelbelovende resultaten in preklinische modellen geen enkel voordeel vertoonden bij gebruik in de kliniek. Volgens de "3R-regel", die gericht is op het verminderen van het aantal dieren dat voor experimenten wordt gebruikt, worden in vitro modellen van de BBB ontwikkeld om hersenpathologieën te bestuderen en de hersenpenetratie van geneesmiddelente voorspellen 29. In vitro modellen van BBB zijn voornamelijk ontwikkeld met behulp van dierlijke cellen en zijn geavanceerder geworden om de relevantie van de verkregen resultaten te verbeteren16. Een van de belangrijke vooruitgang in het gebruik van menselijke cellen, die onmiskenbare nieuwe inzichten en meer specificiteit brengt, op cellulair en moleculair niveau, om menselijke ziektemechanismen te bestuderen16. De ontwikkeling van relevante modellen vereist echter dat rekening wordt gehouden met de verbetering van de BBB in vitro modelinstellingen en de kennis die ontstaat, dankzij diermodellen. Daarom moet het rekening houden met de complexiteit van de BBB-architectuur en het belang van de cel-celcommunicatie om de BBB onder fysiologische en pathologische omstandigheden tebestuderen 30.
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode om een volledig humaan BBB in vitro model op te zetten dat de drie belangrijkste celtypen van de BBB omvat, zonder beperking van de toegang tot hersenweefsel. Als een meervoudig celsysteem is de inductie en het onderhoud van BBB-eigenschappen, zonder het kunstmatige gebruik van aanscherpingsverbindingen, maar in plaats daarvan geïnduceerd door cel-celcommunicatie fysiologisch relevanter en in overeenstemming met de in vivo inductie van de BBB-eigenschappen31. Daarom is het respecteren van de chronologie van het protocol van het grootste belang voor het succes van het protocol. Bovendien vertegenwoordigen de incubatietijden tijdens het instellen van de drievoudige cultuur en zodra de drie celtypen zijn samengesteld de belangrijkste kritieke stappen van het protocol.
De BBB-eigenschappen in EC's worden geïnduceerd door de co-cultuur met pericyten, zoals beschreven voor het co-kweekmodel24. Daarom is de cultuur van pericyten aan de achterkant van het insertfilter het meest kritieke punt en vereist het strikt volgen van het protocol met het risico dat het niet genoeg pericyten heeft voor de inductie van de BBB-eigenschappen. Allereerst moet tijdens de coatingprocedure en ook celzaaien aandacht worden besteed aan het niet in contact brengen van de afdekking van de petrischaal met de coating en ook het medium zodra de cellen zijn gezaaid om een goede coating van het filter te garanderen en geen cellen te verliezen (stappen 2.2.1 en 2.2.4). Bovendien is het, zodra de pericyten zijn gezaaid, van essentieel belang om de aangegeven tijd te wachten voor de bevestiging van de pericyten (stap 2.2.4) voordat het inzetfilter voor het coaten en zaaien van EC's aan de andere kant wordt teruggedraaid (stappen 2.2.5 en 2.3). Eenmaal gezaaid, zijn zes dagen nodig om de BBB-eigenschappen te induceren via cel-celcommunicatie (stap 2.4).
Het model is gevalideerd in termen van beperkte permeabiliteit (geassocieerd met de instelling van de tight junctions) aangezien de EC's van het triple culture model permeabiliteitswaarden weergeven voor BBB-integriteitsmarkers vergelijkbaar met het gevalideerde co-kweekmodel en ook gemeten in gevalideerde dier- of menselijke modellen 16,27,32. Bovendien vereist de validatie van een in vitro BBB-model, naast de beperkte permeabiliteit, de responsiviteit op andere celtypen van de NVU en de expressie van functionele receptoren en transporters16. Bovendien is het model reproduceerbaar en produceert het meerdere insertfilters en putten om talloze analyses (gen- en eiwitexpressie, fluorescerende kleuring, toxiciteitstests) op elk celtype afzonderlijk uit te voeren zonder dat een celsorteermethode nodig is.
Het model is ontwikkeld met behulp van een 0,4 μm poriegroottefilter om één celtype aan elke kant van het insertfilter te hebben. Het insertfiltersysteem maakte de studie van cel-celcommunicatie in fysiologische omstandigheden mogelijk door het over te brengen op goed bevattende astrocyten. De aanwezigheid van astrocyten in het systeem vertegenwoordigt een pluswaarde in vergelijking met het initiële co-kweek in vitro model24. Inderdaad, gezien het belang van astrocyten in de fysiologie van de BBB, maakt dit derde celtype verder begrip mogelijk van de cel-celcommunicatie binnen de BBB. Bovendien kan het drievoudige celkweeksysteem ook worden bestudeerd in pathologische omstandigheden zoals beroerte, waarbij de astrocyten een essentiële rol spelen 33,34,35. Bovendien kan het ontwerp van BCC's / pericyten aan beide zijden van het insertfilter gemakkelijk op andere celtypen worden geplaatst om pathologische aandoeningen zoals hersenkanker na te bootsen23.
De poriegrootte van het insertfilter kan beperkingen met zich meebrengen bij sommige experimenten, zoals celtransmigratie over de BBB. De ontwikkeling van het model met een grotere poriegrootte vereist echter de aanpassing van het protocol om de vorming van een fysiologische monolaag van EC's te garanderen en niet meerdere lagen, wat fysiologisch niet relevant is om de BBB36 na te bootsen.
De toepasbaarheid van het model is aangetoond met behulp van het NGs-transportexperiment dat de mogelijkheid biedt om transportexperimenten uit te voeren met behulp van een meercellig systeem. Niettemin moet men zich bewust zijn van de moeilijkheden bij het hebben van een controleverbinding of molecuul voor het transportexperiment, waarbij vergelijkbare eigenschappen worden gedeeld met NG's, omdat elke nanostructuur een unieke reeks eigenschappen vertoont (molecuulgewicht, lading, vorm, fysische eigenschappen, eiwitcoronavorming).
Een beperking van het model is de afwezigheid van schuifspanning, waarvan werd aangetoond dat het de differentiatie van EC's en de expressie van TJ-eiwitten beïnvloedt37. Het ontwikkelen van een vloeibaar systeem dat het capillair van de hersenen nabootst, is echter een uitdaging gezien de complexiteit van het toevoegen van een vloeibaar deel, waarvoor een specifiek apparaat nodig is, in een systeem met meerdere cellen. Bovendien is het specifieke apparaat meestal niet in de handel verkrijgbaar en staat het niet veel replicaties toe, waardoor fluidic-systemen minder geschikt zijn voor gebruik met hoge doorvoer.
Samenvattend reproduceert dit drievoudige kweeksysteem bestaande uit menselijke cellen in vitro de architectuur van de BBB. Het maakt het mogelijk om veel inserts te genereren die kunnen worden gebruikt voor uitgebreide screening van verbindingen.

De BBB, gelokaliseerd op het niveau van hersencapillaire endotheelcellen (EC's), controleert en reguleert de toegang tot het hersenparenchym, wat cruciaal is voor het handhaven van de homeostase van de hersenen en de functie van neurale cellen 1,2. In het geval van hersenpathologie vormt het gebrek aan toegang tot het hersenparenchym echter een echt obstakel voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën.
De BBB EC's bezitten een complexe reeks eigenschappen, waaronder tight junction (TJ) eiwitten, die de intercellulaire ruimte afdichten, geassocieerd met een systeem van effluxpompen, specifieke transporters en receptoren, die de transcellulaire routeregelen 1,2,3. Bovendien worden al deze eigenschappen geïnduceerd en onderhouden, dankzij communicatie met de pericyten ingebed in het BBB EC-keldermembraan en de astrocyten, waarvan de eindvoeten de hersencapillairen omringen 1,2,3. Daarom is het bestuderen van de BBB in vitro een uitdaging gezien de complexiteit van de architectuur en de communicatie tussen de verschillende celtypen die de neurovasculaire eenheid (NVU)2 vormen. Bovendien zijn de verschillende celtypen cruciaal voor de inductie en het onderhoud van BBB-eigenschappen en hebben ze bijgevolg invloed op de voorspelling van de kruising door de BBB. Verschillende strategieën voor medicijnafgifte aan de hersenen werden al getest met behulp van een groot aantal tactieken om de BBB-beperkte eigenschappen te omzeilen4. Meer recent, met de vooruitgang van nanotechnologieën, worden nieuwe materialen ontwikkeld voor toepassingen als medicijndragers 5,6. Naast hun hogere belasting, verminderde toxiciteit en verhoogde biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen, kunnen deze nieuwe nanomaterialen worden gefunctionaliseerd voor een Trojaanse paard-strategie om de BBB te passeren en specifiek cellen in het parenchym te richten 5,6. Onder de verschillende soorten nanomaterialen die worden geëvalueerd, hebben nanogels veel aandacht getrokken, voornamelijk vanwege hun colloïdale eigenschappen en het vermogen om de chemische structuur aan te passen om stimuli-responsieve eigenschappen te introduceren 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
In vitro modellen zijn nu ontwikkeld voor preklinische studies met behulp van menselijke cellen om de hersenpenetratie van geneesmiddelente voorspellen 16. Er zijn verschillende instellingen van deze modellen beschikbaar, van monolagen van hersen-EC's tot meerdere celsystemen16. Gezien het belang van de NVU-cellen in de BBB-inductie en -onderhoud en de gecoördineerde respons op de pathologische omgeving, moeten BBB-in vitromodellen rekening houden met al deze protagonisten om de relevantie van de voorspelling te verbeteren 2,17.
De huidige methode beschrijft het opzetten van een triple culture in vitro model van de menselijke BBB, dat volledig is ontwikkeld met menselijke cellen om specifieke cellulaire en menselijke moleculaire mechanismen te bestuderen. Om fysiologisch relevant te zijn, bestaat het model uit de drie belangrijkste cellulaire actoren van de BBB (EC's, pericyten en astrocyten) die nodig zijn om de BBB-eigenschappen te induceren en te behouden, zonder het gebruik van aanscherpingsverbindingen en het vertonen van een reeks eigenschappen die nodig zijn om te worden beschouwd als een in vitro BBB-model16,18. Het model is opgezet in een configuratie die het bloed- en hersencompartiment afbakent, geschikt voor preklinische studies van medicijn- en deeltjestransport om hersenpenetratie te voorspellen. Het nut van het model wordt geïllustreerd door het transport van polymere nanogels te meten.

<table><tbody><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Astocyte Medium (AM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte Growth Supplement</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1852</td><td>Astrocyte Growth Supplement wordt geleverd in het AM-set.</td></tr><tr><td>Cell culture dish 100 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430293</td><td>100 mm x 20 mm; schaal gebruikt voor het ontdooien van ECs en PCs vóór het tricultuur-setting</td></tr><tr><td>Cell culture dish 150 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430599</td><td>De hoogte van deze schalen (25 mm) staat het zaaien van PCs in de teruggedraaide insert toe voor het instellen van het tricultuur-model.</td></tr><tr><td>Collagen I&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Rat tail&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1051</td><td>Endothelial Cell Growth Supplement wordt geleverd in het ECM-set.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Medium (ECM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G2500</td><td>2% gelatine van varkenshuid in PBS-CMF</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>BiochromA6</td><td>A-2712</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Merck</td><td>1002891000</td><td></td></tr><tr><td>Human Brain Cortex Astrocytes</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1800-SC</td><td></td></tr><tr><td>Malassez cell counting chamber</td><td>vWR</td><td>HECH40453702</td><td>De telling werd handmatig uitgevoerd.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Extracellulair matrix-gebaseerde hydrogel</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0503</td><td>Penicilline/Streptomycine oplossing wordt geleverd in de ECM en AM sets.</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Millipore System</td><td>SCGPT0SRE</td><td>0.22 &micro;m poriëngrootte</td></tr><tr><td>Transwell insert&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>0.4 &micro;m poriën polycarbonaatfilter&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA neutralisatieoplossing</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0113</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA oplossing</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0103</td><td></td></tr><tr><td>Immunoctytochemie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEA BLOCK blokkeringsbuffer</td><td>ThermoScientific</td><td>37527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-Muis secundair antilichaam</td><td>Thermofisher</td><td>A11031</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-Konijn secundair antilichaam</td><td>Thermofisher</td><td>A11036</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5 primaire antilichaam</td><td>InVitrogen</td><td>34-1600</td><td>Verdunning 1:100</td></tr><tr><td>Anti-Desmin primaire antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab6322</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primaire antilichaam</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Platelet-Derived Growth Factor-&beta; primaire antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab51090</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Anti-VE-cadherin primaire antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Zona Occludens-1 primaire antilichaam</td><td>InVitrogen</td><td>61-7300</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant met DAPI</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Genexpressie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,933,250</td><td></td></tr><tr><td>96 multiplate well</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>iSCRIPT</td><td>Biorad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>Sealer sheet&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>Eiwitexpressie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Laemli Sample Buffer</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td>Voeg 50 &micro;L van bMercaptoetanol toe aan 950 &micro;L van Laemmli Buffer en bewaar bij -20&deg;C. Verdun 1:1 met het eiwitmonster voor de assay.</td></tr><tr><td>Anti-Borstkanker Weerstandseiwit primaire antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>Voorbereiding 15 minuten bij RT onder beweging; verdunning 1:1000, O.N. bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5 primaire antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>Voorbereiding 5 minuten bij 95&deg;C; verdunning 1:1000, O.N. bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Glucose Transporter 1 primaire antilichaam</td><td>Millipore</td><td>07-1401</td><td>Voorbereiding 5 minuten bij 95&deg;C; verdunning 1:1000, O.N. bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Muis secundair antilichaam</td><td>Dako</td><td>P0447</td><td>Verdunning 1:5000 in TBS-Tween</td></tr><tr><td>Anti-P-glycoproteïne primaire antilichaam</td><td>Genetex</td><td>GTX23364</td><td>Voorbereiding 15 minuten bij RT onder beweging; verdunning 1:400, 3 uur bij RT</td></tr><tr><td>Anti-Konijn secundair antilichaam</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>Verdunning 1:8000 in TBS-Tween</td></tr><tr><td>Anti-Transferrine Receptor primaire antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab84036</td><td>Voorbereiding 5 minuten bij 95&deg;C; verdunning 1:1000, O.N. bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Zona occludens-1 primaire antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab216880</td><td>Voorbereiding 5 minuten bij 95&deg;C; verdunning 1:

een drievoudig kweekcelsysteem dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

De levering van medicijnen aan de hersenen blijft een uitdaging vanwege de zeer specifieke en beperkende eigenschappen van de bloed-hersenbarrière (BBB), die de toegang tot het hersenparenchym regelt en beperkt. Met de ontwikkeling van nanotechnologieën werden echter grote panels van nieuwe nanomaterialen ontwikkeld om de toediening van geneesmiddelen te verbeteren, wat de noodzaak benadrukte van betrouwbare in vitro microsystemen om hersenpenetratie te voorspellen in het kader van preklinische testen. Hier is een eenvoudige methode om een microfysiologisch systeem op te zetten om de BBB te modelleren met uitsluitend menselijke cellen. In zijn configuratie bestaat het model uit een drievoudige cultuur, waaronder hersenachtige endotheelcellen (BCC's), pericyten en astrocyten, de drie belangrijkste BBB-cellulaire actoren die nodig zijn om de BBB-eigenschappen op een meer fysiologische manier te induceren en te reguleren zonder de vereiste van aanscherpingsverbindingen. Het model ontwikkeld in een 12-wells plaatformaat, klaar na 6 dagen drievoudige cultuur, wordt gekenmerkt door fysische eigenschappen, gen- en eiwitexpressies en gebruikt voor polymere nanogel-transportmeting. Het model kan worden gebruikt voor een uitgebreid scala aan experimenten in gezonde en pathologische omstandigheden en vormt een waardevol hulpmiddel voor preklinische beoordelingen van molecuul- en deeltjestransport, evenals inter- en intracellulaire handel.

Setting van het menselijke triple culture BBB model Het protocol dat vereist is voor het instellen van het humane BBB in vitro model wordt beschreven in figuur 1 en omvat opeenvolgende stappen waarvan de volgorde strikt moet worden nageleefd. Eerst worden de drie celtypen afzonderlijk gekweekt in celkweekschalen (figuur 1A) voordat ze worden geassembleerd in een insertfiltersysteem. De drievoudige kweeksetting begint met het zaaien van het eerste celtype, astrocyten, in de voorgecoate bodemput. De volgende dag worden pericyten en EC's gezaaid op respectievelijk de voorgecoate abluminale en luminale oppervlakken van het insertfilter. Het wisselplaatfilter wordt vervolgens over de astrocyten overgebracht. Het model wordt gedurende 6 dagen in cultuur gehouden, de tijd die nodig is om de BBB-eigenschappen in EC's te induceren, met een vernieuwing van het medium om de andere dag volgens het gepatenteerde co-kweekmodel24. De EC's worden vervolgens hernoemd tot BCC's (figuur 1B).
Karakterisering van het menselijke BBB-model Het drievoudige celkweekmodel is gekarakteriseerd voor de aanwezigheid van een reeks BBB-specifieke eigenschappen. Allereerst bevestigden immunocytochemische gegevens de expressie van conventionele markers zoals van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β (PDGFR-β)25,26 en desmine voor pericyten en gliaal fibrillairzuur eiwit (GFAP)26 voor astrocyten (figuur 2A). Vandaar dat, na de 6 dagen van cultuur met de pericyten en astrocyten, de monolaag van BCC's, gevisualiseerd met de hechtende junctiekleuring van VE-Cadherine, een continue lokalisatie van TJ-eiwitten, Claudin-5 en ZO-1, aan de celgrenzen vertoont (figuur 2A). De opstelling van de TJ's is gecorreleerd met lage paracellulaire permeabiliteitscoëfficiënten gemeten met behulp van BBB-integriteitsmarkers met een laag molecuulgewicht, d.w.z. NaF (376 Da)16,27 en hoog molecuulgewicht, d.w.z. FD20 (20 kDa)27, zoals weergegeven in figuur 2B. De gemeten waarden zijn vergelijkbaar met gevalideerde BBB in vitro modellen met behulp van de exacte bron van ECs 23,24,28. Al met al benadrukken deze resultaten de lage paracellulaire permeabiliteit van de triple culture BLEC monolayer, die kenmerkend is voor de in vivo BBB. Bovendien vertoonde R123 intracellulaire accumulatie in BCC's een significante toename van de aanwezigheid van de effluxpompremmer Elacridar23,24 in vergelijking met de controleconditie met zijn afwezigheid (figuur 2C). Dit duidt op de aanwezigheid van actieve effluxpompmoleculen, namelijk P-gp en BCRP, in de BCC's.
Om de BCC's verder te karakteriseren, werden genexpressie en eiwitniveau van de belangrijkste BBB-kenmerken bestudeerd (figuur 3). De gegevens verkregen met het triple culture model werden vergeleken met het gevalideerde en gepatenteerde co-kweekmodel bestaande uit EC's en pericyten24 die als controlemodel werden gebruikt. De astrocyten vertegenwoordigen het derde celtype dat in het oorspronkelijke co-kweekmodel in het drievoudige kweekmodel is toegevoegd. Vandaar dat de genexpressieanalyse (figuur 3A) van triple culture BLECs, vergeleken met co-kweek BLECs, het behoud van expressie van belangrijke BBB-kenmerken zoals TJ-eiwitten (claudine-5 en zonula occludens-1) en effluxpompen (P-gp en BCRP) en de upregulatie van de meeste bestudeerde BBB-transporters (glucosetransporter 1) en receptoren (transferrinereceptor) toonde. Eiwitkwantificeringsgegevens (figuur 3B) bleken in overeenstemming te zijn met de transcriptionele resultaten. Over het algemeen ondersteunen deze gegevens de positieve inductie van BBB-eigenschappen in de blec-laag met drievoudige cultuur, vergelijkbaar met het gevalideerde cocultuurmodel. Al met al vertoont het drievoudige kweekmodel de vereiste fysieke en metabolische eigenschappen voor een in vitro microfysiologisch systeem om de BBB te modelleren.
Toepasbaarheid op strategieën voor medicijnafgifte - meting van nanogeltransport Om de mogelijkheid te beoordelen om het triple culture-model te gebruiken om nieuwe hersenafgiftestrategieën te bestuderen, werd het transport van fluorescerend getagde NIPAM-gebaseerde neutrale NGs geëvalueerd 6,15. Op tijdstip 0 werden NG's in het luminale compartiment geplaatst met een concentratie van 0,1 mg/ml (figuur 4A). Na 24 uur incubatie werd 5,82% van de NG's gevonden in het abluminale compartiment (figuur 4B), wat bewijst dat ze in staat zijn om de BCC's te passeren.
De resultaten tonen de geschiktheid van het model aan om de permeabiliteit van kleine en grotere verbindingen te meten, zoals beschreven met de integriteitsmarkers, en het transport van nanomaterialen zoals polymere NGs te evalueren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig01.jpg"> Figuur 1: Weergave van kritische stappen voor de instelling van het triple culture in vitro model van de menselijke BBB. (A) Fasecontrastbeelden van de drie celcomponenten van het BBB-model: endotheelcellen (EC), pericyten (PC) en astrocyten (AC). Schaalbalk = 250 μm. (B) Schematische en illustratieve tijdlijn voor de instelling van het triple culture human BBB in vitro model. Het gemarkeerde vak vertegenwoordigt de coatingprocedure voor het omgekeerde wisselplaatfilter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig02.jpg"> Figuur 2: Beoordeling van de eigenschappen van het triple culture BBB-model. (A) Representatieve immunostaining beelden van de onderscheidende markers voor BLECs (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 en VE-Cadherin: Ve-Cadh), pericyten (Platelet-Derived Growth Factor Receptor-β: PDGFR-β en desmin), en astrocyten (Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP). Schaalbalk = 10 μm. (B) Paracellulaire permeabiliteit van BBC's tot fluorescerende BBB-integriteitsmarkers, natriumfluonesceïne (NaF, 376 Da, Pe: 0,61 ± 0,062) en FITC-Dextran (FD20, 20 kDa, Pe: 0,04 ± 0,005). N = 3; n = 9. De gemiddelde ± SEM. (C) P-gp en BCRP-functionaliteit in EC's werd beoordeeld door intracellulaire R123 te kwantificeren met (124,2% ± 3,39%) en zonder (100% ± 8,79%) Elacridar. N = 4; n = 12. Gemiddelde ± SEM. p = 0,017 met behulp van een ongepaarde t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig03.jpg"> Figuur 3: Evaluatie van BLEC-genexpressie en eiwitniveau van onderscheidende markers in het triple culture model in vergelijking met het co-kweek BBB model. (A) Genexpressie van tight junction eiwitten (Claudin-5: CLD5, en Zona Occludens-1: ZO1), transporters (Glucose Transporter-1: GLUT1, P-glycoproteïne: PGP, en Breast Cancer Resistance Protein: BCRP), en grote molecuul-receptoren (Transferrin Receptor: TRFR), genormaliseerd door de expressie van RPLP0. N = 3; n = 9. (B) Eiwitniveau van tight junction-eiwitten (CLD5 en ZO1), transporters (GLUT1, PGP en BCRP) en grote molecuulreceptoren (TRFR), genormaliseerd door de expressie van β-actine. N = 3; n = 9. Gemiddelde ± SEM. Voor (A) en (B) komen waarden>1 overeen met hogere genexpressie- of eiwitniveaus in het drievoudige kweekmodel. De rode lijn komt overeen met een waarde van 1 waarbij het expressieniveau (genen of eiwitten) van de twee modellen equivalent is. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig04.jpg"> Figuur 4: Het meten van nanogeltransport in het triple culture model. (A) Schematische weergave van de nanogel transport assay. (B) Percentage nanogeltransport na 24 uur incubatie in het triple culture model (5,82% ± 0,09%). N = 2; n = 6. Gemiddelde ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2" rowspan="2">Naam van de buffer</td>
			<td colspan="3">Compositie</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Notitie</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Molecuulgewicht</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Fosfaat buffer zoutoplossing, calcium magnesium vrij</td>
			<td rowspan="5">PBS-CMF</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8 g/l</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="5">Voeg alle verbinding toe aan steriel water en wacht op volledige oplosbaarheid. De pH van de verkregen oplossing moet tussen 7,3 en 7,4 liggen. Filtreer de oplossing met een membraan van 0,22 μm en bewaar de steriele oplossing bij 4 °C.</td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>0,2 g/l</td>
			<td>74.55</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4</td>
			<td>0,2 g/l</td>
			<td>136.09</td>
		</tr><tr><td>NaHPO4-12 H2O</td>
			<td>2,87 g/l</td>
			<td>358.14</td>
		</tr><tr><td>Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="8">Beltoon HEPES</td>
			<td rowspan="8">RH</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8,8 g/l</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="8">Voeg alle verbinding toe aan steriel water en wacht op volledige solublisatie. Stel de pH in op 7,4 (startoplossing pH rond 6,8). Filtreer de oplossing met een membraan van 0,22 μm en bewaar de steriele oplossing bij 4 °C.</td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>0,387 g/l</td>
			<td>74.55</td>
		</tr><tr><td>CaCl2 Zoekertjes</td>
			<td>0,244 g/l</td>
			<td>110.99</td>
		</tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td>
			<td>0,0406 g/l</td>
			<td>203.3</td>
		</tr><tr><td>NaHCO3</td>
			<td>0,504 g/l</td>
			<td>84.1</td>
		</tr><tr><td>Hepes</td>
			<td>1,19 g/l</td>
			<td>238.3</td>
		</tr><tr><td>Glucose</td>
			<td>0,504 g/l</td>
			<td>180.16</td>
		</tr><tr><td>Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Samenstelling van de verschillende buffers die in het protocol worden gebruikt.

Dit protocol beschrijft een methode om een menselijk bloed-hersenbarrière (BBB) in vitro model vast te stellen. De endotheelcellen en pericyten worden aan elke kant van een insertfilter (bloedcompartiment) gezaaid en astrocyten worden in de onderste put (hersencompartiment) gezaaid. Het gekarakteriseerde model werd gebruikt voor nanodeeltjestransportexperimenten.

Een drievoudig kweekcelsysteem dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Medicijnafgifte aan de hersenen bleef een uitdaging. De ontwikkeling van grote panelen van nieuwe nanomaterialen om de levering aan de hersenen te verbeteren, benadrukt de noodzaak van een echt in vitro microsysteem om hersenpenetratie te voorspellen in het kader van preklinische testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om de vrije pijn cellulaire actuals van de bloed-hersenbarrière in hetzelfde systeem te ijsberen, waardoor celcelcommunicatie mogelijk is die nodig is voor de inductie van het fenotype van de bloed-hersenbarrière.Bovendien kunnen alle celtypen afzonderlijk worden geïsoleerd voor verdere moleculaire analyse. Het model kan worden gebruikt voor een uitgebreid scala aan experimenten in gezonde en pathologische omstandigheden en vormt een waardevol hulpmiddel voor preklinische beoordelingen van molecuul- en deeltjestransporten, evenals inter- en intracellulaire handel. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Clemence Deligne en Dr.Eleonora Rizzi.Begin met het coderen van de putjes met 500 microliter van twee microgram per vierkante centimeter Poly-L-Lysine-oplossing. Incubeer 's nachts of minimaal een uur bij 37 graden Celsius en verwijder de Poly-L-Lysine-oplossing voorzichtig met een glazen pipet aangesloten op een aspiratsysteem. Spoel vervolgens twee keer met steriel water.Om de astrocyten te verzamelen, wast u de astrocyten eerst een keer met 10 milliliter warme 1X PBS CMF. Incubeer ze gedurende drie minuten met 10 milliliter warme 20% Trypsine EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Maak de cellen mechanisch los van de kolf en breng de suspensie over in een conische buis die vijf milliliter warm niet-verdund FCS bevat.Centrifugeer de suspensie op 190 maal G gedurende vijf minuten bij 20 graden Celsius. Suspensie de celpellet opnieuw in vijf milliliter warm astrocytenmedium en verdun vervolgens 20 microliter van de celsuspensie met 80 microliter 1X PBS CMF. Tel de cellen met behulp van een handmatige telkamer onder een microscoop.Plaat ongeveer 40.000 cellen per vierkante centimeter in elke Poly-L-Lysine goed gecodeerd in een volume van 1,5 milliliter warm astrocytenmedium. Plaats de omgekeerde insertfilters aan de rand van een bedekte schaal van 25 millimeter hoog en voeg 250 microliter collageen type één oplossing toe aan de insertfilters. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur.Verwijder vervolgens voorzichtig de collageen type één-oplossing met een glazen pipet die is aangesloten op een aspiratatiesysteem. Was tweemaal met 250 microliter DMEM hoge glucose bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig alle oplossing uit de insteekfilters. Was de pericyten twee keer met 10 milliliter warm 1X PBS CMF en incubeer de cellen met twee milliliter warm Trypsine.Observeer de cellen onder de microscoop om de werking van het Trypsine te volgen. Wanneer de cellen beginnen los te komen, verwijdert u het Trypsine, voegt u vijf milliliter warm endotheelcelbasaal medium of ECM toe aan de cellen en start u mechanische dissociatie. Verdun 20 microliter van de celsuspensie met 80 microliter 1X PBS CMF en tel de cellen met behulp van een handmatige telkamer onder een microscoop zoals eerder getoond.Zaad 44, 500 cellen per vierkante centimeter op de voorgecodeerde omgekeerde insertfilters in een volume van 250 microliter. Bewaar de wisselplaatfilters in een bevochtigde incubator op 37 graden Celsius gedurende drie uur onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Gebruik een steriel pincet om de wisselplaatfilters voorzichtig om te zetten in een plaat met 12 putten met 1,5 milliliter warme ECU per put.De wisselplaatfilters zijn nu klaar om aan de andere kant te worden gecoat. Bedek de bovenzijde en de inzetfilters met 500 microliter extracellulaire hydrogel op basis van matrix. Plaats de wisselplaatfilters in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof gedurende een uur.Was ze eenmaal met 500 microliter DMEM hoge glucose bij kamertemperatuur. Was de endotheelcelcultuur eenmaal met 10 milliliter warme 1X PBS CMF en incubeer de cellen met twee milliliter warm Trypsine. Verwijder de Trypsine wanneer de cellen beginnen los te komen, voeg vervolgens vijf milliliter warme ECU toe en start de mechanische dissociatie.Verdun 20 microliter van de celsuspensie met 80 microliter 1X PBS CMF en tel de cellen met behulp van een handmatige telkamer. Zaai de endotheelcellen met een dichtheid van 71.500 cellen per vierkante centimeter op de voorgecodeerde insertfilters in een volume van 500 microliter warme ECU. Vervang het astrocytenmedium door 1,5 milliliter warme ECU per put.Breng vervolgens de gezaaide insertfilters over naar de putten met de astrocyten. Plaats de tricultuurcelsystemen in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Verwijder het medium voorzichtig uit het bovenste en onderste compartiment met behulp van een glazen pipet die is verbonden met een aspiratiesysteem.Vervang het medium door warme ECU in een volume van 500 microliter in het bovenste compartiment en 1,5 milliliter in het onderste compartiment. Vernieuw het medium om de dag tot dag zes door dezelfde procedure te herhalen. Zet de cellen uiteindelijk terug in de bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof.Immunocytochemische gegevens bevestigden de expressie van conventionele markers zoals van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor bèta en Desmine voor pericyten, en gliaal fibrillair zuur eiwit voor astrocyten. Vandaar dat, na zes dagen van cultuur met de pericyten en astrocyten, de monolaag van hersenachtige endotheelcellen of BCC's gevisualiseerd met de adherente junctiekleuring van Ve-Cadherine een continue lokalisatie van TJ-eiwitten CLD5 en Z-01 aan de celgrenzen vertoont. Paracellulaire permeabiliteit van BLECS tot fluorescerende BBB-integriteitsmarkers, natriumfluoresceïne en FITC-dextran wordt hier weergegeven.R123 intracellulaire accumulatie in BCC's vertoonde een significante toename van de aanwezigheid van de effluxpompremmer Elacridar in vergelijking met de controleconditie met zijn afwezigheid. Dit duidt op de aanwezigheid van actieve efflux pompmoleculen namelijk P glycoproteïne en borstkanker resistentie eiwit of BCRP in de BLEC's. Genexpressie van tight junction-eiwitten, transporters en grote molecuulreceptoren genormaliseerd door de expressie van RPLP0 worden hier weergegeven.Hier komen de waarden groter dan één overeen met een hogere genexpressie in het triple culture model. De rode lijn komt overeen met een waarde van één waarbij het expressieniveau van de twee modellen equivalent is. De representatieve afbeelding toont het eiwitniveau van tight junction-eiwitten, transporters, in grote molecuulreceptoren genormaliseerd door de expressie van bèta-actine.Het transport van fluorescerend gelabelde NIPAM-gebaseerde neutrale polymere nanogels werd geëvalueerd. Op tijdstip nul werden polymere nanogels in het luminale compartiment geplaatst met een concentratie van 0,1 milligram per milliliter. Na 24 uur incubatie werd 5,82% van de polymere nanogels gevonden in het abluminale compartiment, wat bewijst dat ze in staat zijn om de BCC's te passeren.De juiste coating en zaaiing van de pericyten op het omgekeerde filter is cruciaal. Belangrijk is het behoud van de steriliteit en integriteit van de structuren om besmetting van het celkweeksysteem te voorkomen.

a-triple-culture-cell-system-modeling-the-human-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates the co-culturing of human brain pericyte, astrocyte, and endothelial cells. Each cell layer is formed separately and then cultured together, creating a three-layered system that mimics the cellular arrangement of the blood-brain...

Developing a Triple Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

De epitheliale cellen van de choroïdale plexus (CP) vormen de bloed-hersenwaterbarrière (BCSFB). Een in vitro model van de BCSFB gebruikt humane choroïdale plexuspapilloom (HIBCPP) cellen. Dit artikel beschrijft het kweken en basolaterale infectie van HIBCPP cellen met behulp van een cellencultuur filterinzetsysteem.

Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

We presenteren een fluorescentie test om aan te tonen dat Lucifer Yellow (LY) een robuuste marker is om de schijnbare paracellulaire permeabiliteit van hCMEC/D3 celmonolagen te bepalen, een in vitro model van de menselijke bloed-hersen barrière. We gebruikten deze assay om de kinetiek van een confluente monolaag-formatie in gekweekte hcmec/D3-cellen te bepalen.

Lucifer geel-een robuuste Paracellulaire permeabiliteit marker in een Celmodel van de menselijke bloed-hersen barrière

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van de instelling van een in gnudles BBB (bloed-hersenbarrière)-Minibrain polyester poreuze membraan cultuur invoegen systeem teneinde het vervoer van biomoleculen of infectieuze agentia via een menselijke BBB en hun fysiologische effect op de naburige hersencellen.

Een Model Interface menselijke Blood-Brain barrière kruisingen door ziekteverwekkers of geneesmiddelen en hun interacties met de hersenen bestuderen

De menselijke bloed-hersenbarrière voorkomt selectief penetratie van hydrofiele moleculen en ziekteverwekkers in de hersenen. Verschillende pathologieën, waaronder meningitis en postoperatief delirium, worden geassocieerd met een verhoogde doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière. Hier beschrijven we een endothelial celkweekmodel om de barrièredoorlaatbaarheid te testen door microbiële traversal.

Analyseren van de permeability van de bloed-hersenbarrière door microbiële traversal door middel van microvasculaire endotheliale cellen

Hier beschrijven we de methode voor het vaststellen van een drievoudig celkweekmodel van de bloed-hersenbarrière op basis van primaire microvasculaire endotheelcellen, astrocyten en pericyten van de menselijke hersenen. Dit meercellige model is geschikt voor studies van neurovasculaire eenheidsdisfunctie tijdens ischemische beroerte in vitro of voor de screening van kandidaat-geneesmiddelen.

Een drievoudig primair celkweekmodel van de menselijke bloed-hersenbarrière voor het bestuderen van ischemische beroerte in vitro

Dit rapport biedt protocollen voor assemblage, celkweek en assays op het μSiM-platform voor de constructie van bloed-hersenbarrièremodellen.

Gebruik van het MicroSiM (μSiM) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière

Ontdek een drievoudig kweekcelsysteem met endotheelcellen, pericyten en astrocyten dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert. Deze methode ondersteunt preklinisch onderzoek naar geneesmiddelafgifte en nanopartikeltransport.

Een drievoudig kweekcelsysteem dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert

Meer video's verkennen