Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Dit protocol is belangrijk omdat het een manier biedt om extracellulaire blaasjes te isoleren van een verscheidenheid aan bacteriën op een zeer reproduceerbare manier. Het mooie van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om EV's te isoleren uit vrij grote omgevingen van bacterieculturen, wat in vivo studies mogelijk maakt. Hoewel de gegevens die we tonen preklinische toepassingen weerspiegelen, is het te verwachten dat dit protocol kan worden aangepast aan de productie van bacteriële EV's voor therapeutica.

Deze methode kan worden toegepast op elk schaalbaar celkweeksysteem met kleine wijzigingen. Vanwege de schaalbaarheid van het protocol is het belangrijk om filters van de juiste grootte en SEC-kolommen te hebben om de gewenste startvolumes van bacteriële celkweek te verwerken. De procedures worden gedemonstreerd door Sadie Johnson, een assistent-technoloog in het laboratorium van Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, een oncologiemedewerker in het laboratorium van Dr. Justin Lathia, en Akeem Santos, een onderzoekstechnoloog in mijn laboratorium.

Begin met het inenten van enkele kolonies Escherichia coli in 250 tot 1000 milliliter Luria-Bertani, of LB-bouillon, met behulp van een steriele lus. Incubeer vervolgens de cultuur aeroob in een schuddende incubator met 300 rotaties per minuut en 37 graden Celsius. Na 48 uur incubatie, verduidelijk het bacteriële kweekmedium door de celculturen over te brengen naar schone polypropyleencentrifugeflessen van 500 milliliter om gedurende 15 minuten te centrifugeren in een rotor met een grote capaciteit met vaste hoek bij vier graden Celsius en 5.000 keer G.

Breng het supernatant over in schone centrifugeflessen door het gedurende 15 minuten voorzichtig in de centrifuge te gieten op 10.000 keer G. Breng vervolgens het supernatant over naar een 0,2-micron polyethersulfon vacuümaangedreven filterapparaat van de juiste grootte en sluit het filtratieapparaat aan op een vacuümwandtoevoer. Als de filtratiesnelheid aanzienlijk daalt, verplaatst u het ongefilterde materiaal naar een nieuw apparaat.

Het gefilterde medium kan 's nachts bij vier graden Celsius worden bewaard of kan onmiddellijk verder worden verwerkt. Om te controleren op de volledige verwijdering van de levensvatbare cellen, verspreidt u een aliquot van het gefilterde supernatant op geschikte agarplaten en zorgt u ervoor dat er na incubatie geen kolonies zijn onder optimale omstandigheden voor de bacteriestam. Voor het concentreren van het gefilterde medium met een volume van 100 milliliter, laadt u 90 milliliter gefilterd kweekmedium op het reservoir van centrifugale ultrafiltratie-apparaat met een moleculaire gewichtsafsnijding van 100 kilodalton en centrifugeert u het medium in zwenkbakrotor bij vier graden Celsius en 2.000 keer G gedurende intervallen van 15 tot 30 minuten totdat het volume van het bovenste reservoir is geconcentreerd tot minder dan 0,5 milliliter.

Om het reservoir bij te vullen met een eventueel overgebleven gefilterd kweekmedium, verwijdert u de doorstroom in de bodem van het apparaat om het apparaat opnieuw in evenwicht te brengen. Als de viscositeit van het geconcentreerde medium in het reservoir zichtbaar is verhoogd, verdun het medium met PBS en reconcentraeer het door centrifugatie om niet-extracellulaire blaasjes of EV-eiwitten te verminderen die kleiner zijn dan de moleculaire gewichtsafsnijding van 100 kilodalton. Breng vervolgens het geconcentreerde medium over naar een eiwitarme bindingsbuis om 's nachts bij vier graden Celsius op te slaan Voor het concentreren van het gefilterde medium met een volume groter dan 100 milliliter, selecteert u een tangentiële stroomfiltratie van de juiste grootte, of TFF-apparaat, met een moleculaire gewichtsafsnijding van 100 kilodalton.

Na het samenstellen van een filtratiecircuit zoals uitgelegd in het manuscript, pompt u 200 milliliter PBS in een gegradueerd vat om de juiste snelheid te bepalen die overeenkomt met het gewenste debiet. Wanneer de snelheid is ingesteld, circuleert u het gefilterde geconditioneerde medium met ongeveer 200 milliliter per minuut bij kamertemperatuur en verzamelt u de moleculen kleiner dan 100 kilodalton, waarbij u het ultrafiltratiemembraan als afval in een apart vat doorkruist totdat het volume van het geconditioneerde medium is teruggebracht tot 100 tot 200 milliliter. Verdun het gefilterde volume sequentieel tweevoudig met PBS en blijf het medium met de pomp in kleinere vaten circuleren om het volume te concentreren tot 75 tot 100 milliliter en vervolgens tot 25 milliliter en 10 milliliter.

Til de voedingsslang uit het monsterreservoir en pomp om het filter te zuiveren om de maximale hoeveelheid van het monster terug te winnen. Verplaats het geconcentreerde monster naar een centrifugaal ultrafiltratieapparaat van 15 milliliter met een moleculaire gewichtsafsnijding van 100 kilodalton en centrifugeer in een zwenkbakrotor bij vier graden Celsius en 2.000 maal G gedurende intervallen van 15 tot 30 minuten totdat het volume van het medium in het bovenste reservoir minder dan twee milliliter is. Breng het geconcentreerde medium over in een eiwitarme bindbuis om 's nachts bij vier graden Celsius te bewaren.

Voer voor de isolatie van de EV's grootte-uitsluitingschromatografie of SEC uit met behulp van een kleine kolom met een bedvolume van 10 milliliter voor minder dan 100 milliliter uitgangsmateriaal en een grotere kolom met een bedvolume van 47 milliliter voor meer dan 100 milliliter uitgangsmateriaal. Breng gedurende enkele uren voor het experiment de SEC-kolom en PBS op kamertemperatuur, gevolgd door de kolom in een verticale positie te stabiliseren met behulp van een standaard laboratoriumstandaard en houder. Voordat u verbinding maakt met de SEC-kolom, hydrateert u het monsterreservoir door vijf milliliter PBS door de frit in een afvalcontainer te laten stromen.

Schroef vervolgens de inlaatdop van de kolom los om twee milliliter PBS aan het monsterreservoir toe te voegen en sluit het reservoir voorzichtig aan op de kolom terwijl de PBS door de friet naar buiten druipt. Voeg voor de evenwicht van de kolom 47 milliliter PBS toe aan het monsterreservoir, gevolgd door de onderkant van de SEC-kolom los te maken. Laat vervolgens alle geladen monsterbuffer door de kolom stromen en verwijder de doorstroom.

Nadat u twee milliliter van het monster op het monsterreservoir hebt geladen, laat u het monster volledig in de kolom komen en verzamelt u de doorstroom. Voeg onmiddellijk PBS toe aan het monsterreservoir met een volume van 14,25 milliliter minus het monstervolume om de oplossing door de kolom te laten stromen, terwijl de hoeveelheid die gelijk is aan het kolomleegvolume wordt weggegooid. Plaats vervolgens een microbuis met een lage binding van twee milliliter direct onder de SEC-kolom om de eerste doorstroom of fractie één te verzamelen nadat twee milliliter PBS door de kolom is gelopen.

Blijf twee milliliter PBS aan het monsterreservoir toevoegen om elke volgende fractie te verzamelen. Bewaar de verzamelde fracties bij vier graden Celsius voor korte termijn opslag of min 80 graden Celsius voor langdurige opslag. Voor steriliteitstests van de verzamelde fracties van EV's ent u drie milliliter van het kweekmedium met 100 microliter van de fracties die in assays moeten worden gebruikt.

Kweek vervolgens het medium onder optimale omstandigheden terwijl u troebelheid gedurende ten minste drie dagen observeert. Als alternatief kunnen de fractiemonsters worden aangebracht op agarplaten die het medium bevatten dat wordt gebruikt om de producerende bacteriën te laten groeien en vervolgens controleren op kolonievorming. Sla vervolgens de EV's op door 25 tot 50% van de individuele of gepoolde fracties over te brengen naar eiwitarme bindingsbuizen bij min 80 graden Celsius om vries-dooicycli te voorkomen.

De representatieve analyse toont de elutie van Escherichia coli MP1 EV's in de vroege chromatografiefracties. De fracties één tot zes bevatten de meeste EV's, met een gemiddelde diameter lager dan 100 nanometer. Tegelijkertijd bevatten de daaropvolgende fracties EV-vrije eiwitten en zeer weinig EV's.

De EV-verrijking en -grootte werden bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopie, met name in fracties twee tot zes. Er werd waargenomen dat EV-verrijkte fracties twee tot zeven een hoge nanoluciferase-activiteit hadden, maar slechts een zeer laag fluorescerend signaal van niet-EV-geassocieerde mCherry in vergelijking met dat van de latere fracties. De immunogold-etikettering bevestigde de EV-associatie van nanoluciferase in fracties twee tot vijf.

De toepasbaarheid van het protocol op de andere bacteriesoorten werd beoordeeld door EV's te isoleren van de culturen van diverse anaerobe bacteriën. Er werd waargenomen dat de vroege chromatografiefracties één tot vier werden verrijkt voor EV's, met een diameter kleiner dan 100 nanometer. De complexe hersen-hartinfusie, of BHI, bevatte de EV-deeltjes op minder dan 25% van de totale EV-opbrengst.

Het is belangrijk om TFF-apparaten te gebruiken die het startvolume van de bacteriële celcultuur kunnen verwerken. Deze techniek stelt ons in staat om voldoende EV's te genereren om biologische vragen te stellen over hun functie in complexe diermodellen.