Drosophila Passief vermijdingsgedrag als een nieuw paradigma om associatief aversief leren te bestuderen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige gedragstest die het mogelijk maakt om nadelig associatief leren en geheugenconsolidatie bij vliegen te bestuderen, inclusief effecten van genomgevingsinteracties. De hier gepresenteerde test is een eenvoudige, reproduceerbare en kosteneffectieve procedure voor het bestuderen van geheugenmechanismen die gemakkelijk kunnen worden geassembleerd met een paar beschikbare benodigdheden. Deze test zou inzicht kunnen geven in basismechanismen die ten grondslag liggen aan leer- en geheugenstoornissen als gevolg van verschillende genetische, farmacologische en voedingsmanipulaties.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Morgan Tedder en Steven Bradley, studenten van mijn laboratorium. Boor om te beginnen een gat van vier millimeter loodrecht op ongeveer vier millimeter van de bodem in een polypropyleen kweekbuis van 14 milliliter. Verwijder het bovenste deel van de kweekbuis om een bodemfragment van 45 millimeter te maken dat als onderste compartiment wordt gebruikt.

Snijd de bovenkant van een pipetpunt van 1000 microliter af om een fragment van 12 millimeter te maken. Steek het fragment in het vier millimeter gat van de kweekbuis als laadperron om de vliegen over te brengen. Snijd een stuk transparante vinylbuis van 15 millimeter en steek het onderste en bovenste compartiment van tegenovergestelde uiteinden in de buis.

Bevestig de montage verticaal met behulp van een tweeledige verstelbare klem. Plaats het bovenste compartiment verticaal bevestigd met schokbuizen. Verbind de schokbuizen met een elektrische stimulator om elektrische schokken te genereren.

Immobiliseer met behulp van een ijskoud blok drie tot vier dagen oude vliegen en breng ze 24 uur voor het experiment over in afzonderlijke flesjes met voedsel. Wijs een code toe aan alle injectieflacons zoals beschreven in het tekstmanuscript. Zuig zachtjes een vlieg in de mondspirator door lucht aan te zuigen.

Deponeer de vlieg door lichtjes in het laadperron te blazen en start onmiddellijk een timer en stopwatch van één minuut. Schakel de stimulator in en geef een elektrische schok wanneer de vlieg de schokbuis binnenkomt. Druk op de stopwatch om de eerste latentie op te nemen.

Als de vlieg de schokbuis opnieuw binnendringt, geef dan extra schokken. Registreer met behulp van een telling of een Arduino-gebaseerde teller het aantal schokken tijdens een proefperiode van één minuut. Breng de vlieg voorzichtig terug in de injectieflacon aan het einde van een proefperiode van één minuut.

Noteer de latentie, het aantal ontvangen schokken en elke opmerkelijke gedragsverandering. Gebruik 70% ethanol om het onderste en schokcompartiment te reinigen. Veeg af met een pluisvrij reinigingsdoekje en droog het met een föhn.

Herhaal de proef met de volgende vlieg. Reinig het onderste compartiment met water en geurloos reinigingsmiddel na het voltooien van het experiment. Veeg met 70% ethanol het onderste en schokcompartiment schoon en droog het 's nachts aan de lucht.

Door het bovenstaande proces na 24 uur te herhalen, voert u een tweede proef uit. Test in een vergelijkbare volgorde de vliegen. Na het uitvoeren van een passieve vermijdingstest bij Drosophila melanogaster mannelijke vliegen, hebben de resultaten aangetoond dat de latentie toeneemt, het aantal schokken afneemt, wat aantoont dat vliegen associatie tussen het bovenste compartiment en een elektrische schok hebben geleerd.

Uit de frequentieverdeling bleek dat de meeste vliegen het bovenste compartiment binnendringen en één tot drie schokken krijgen in de eerste proef. Bij de vierde proef komen de meeste vliegen niet in het bovenste compartiment en ontvangen ze nul schokken. In latere experimenten werd de duur van het onderzoek teruggebracht tot één minuut omdat de frequentieverdeling voor latenties duidelijk aantoonde dat als de vlieg in de eerste proef niet binnen 60 seconden het bovenste compartiment binnenkomt, hij meestal helemaal niet binnenkomt.

De passieve vermijdingstestexperimenten werden herhaald in Drosophila simulans mannelijke en vrouwelijke vliegen. De resultaten hebben aangetoond dat de vliegen effectief waren in het leren van het passieve vermijdingsgedrag, zoals blijkt uit de veranderingen in frequentieverdelingen voor latenties en schokken bij mannelijke en vrouwelijke vliegen. Vergelijking van latenties en aantal schokken tussen man en vrouw bracht geen statistisch significante verschillen aan het licht.

Vrouwelijke vliegen kregen echter iets meer schokken in elke proef. Analyse van verzorgingsaanvallen in proeven twee en drie onthulde dat de totale duur van de verzorging aanzienlijk afneemt bij vrouwelijke vliegen van proef één tot proef drie. Dit suggereert dat vliegen gedragsstress ervaren die parallel loopt met angstachtig gedrag van knaagdieren.

Vergelijking van de effecten van het westerse dieet en vliegoefeningen op passief vermijdingsgedrag tonen aan dat het westerse dieet de latentie vermindert en het aantal schokken verhoogt, wat aangeeft dat het westerse dieet aversief associatief leren bij vliegen schaadt. Omgekeerd verminderde vliegoefeningen het negatieve effect van het westerse dieet. Vergeet bij het proberen van deze procedure niet om vliegen te stressen.

Gestreste vliegen zouden te snel het bovenste compartiment binnendringen of helemaal niet binnenkomen. Alle experimenten moeten worden uitgevoerd onder dezelfde omgevingsomstandigheden en op hetzelfde tijdstip van de dag. Deze techniek geeft onderzoekers een nieuwe eenvoudige test die kan worden gebruikt om intrinsieke mechanismen van leren en geheugenconsolidatie in vliegen te ontleden.