Modellering van een Enzyme Active Site met behulp van Moleculaire Visualisatie Freeware
December 25th, 2021
Een belangrijke vaardigheid in biomoleculaire modellering is het weergeven en annoteren van actieve plaatsen in eiwitten. Deze techniek wordt gedemonstreerd met behulp van vier populaire gratis programma's voor macromoleculaire visualisatie: iCn3D, Jmol, PyMOL en UCSF ChimeraX.
Het visualiseren van biologische macromoleculen is een kritische vaardigheid voor studenten en professionals in de biologische wetenschappen. In dit protocol laten we zien hoe we de actieve plaats van het enzym glucokinase kunnen modelleren met behulp van vier vrij beschikbare programma's voor moleculaire modellering. Deze tutorial belicht verschillende stappen van het protocol voor elk programma, waaronder het selecteren van gebonden liganden en het gebruik van de liganden om aminozuren en watermoleculen binnen vijf angstroms weer te geven.
De ondersteunende informatie van dit manuscript bevat een speciale video voor elk programma, waarin alle stappen van het protocol met verdere uitleg worden beschreven. De structuur zal PDBID modelleren. 3FGU vertegenwoordigt het katalytische complex van het enzym glucokinase.
De enzym actieve site is gebonden aan twee van zijn substraten, beta-D-glucose, die de identificatie BGC en een magnesiumion, MG, heeft gegeven. Bovendien is dit substraatanaloog, een fosfoaminofosforzuur, adenylaatester, ANP gebonden aan de glucokinase-actieve plaats. Dit niet-hydrolyseerbare analoog van adenosinetrifosfaat, ATP voorkomt dat de fosforyleringsreactie optreedt, die de actieve plaats complexe prekatalyse vangt. De interface van het UCSF ChimeraX-modelleringsprogramma bevat vervolgkeuzemenu's, een werkbalk, de structuurviewer en een opdrachtregel.
We beginnen het protocol met stap 1.4, waarbij residuen binnen vijf angstroms worden geselecteerd om een actieve site te definiëren. Om de liganden te selecteren, drukt u op control shift en klikt u op een atoom of binding in elk van de drie liganden. Druk op de pijl-omhoog totdat alle drie de liganden zijn gemarkeerd met een groene gloed.
Definieer de selectie voor toekomstig gebruik door in het vervolgkeuzemenu te klikken, selecteer define selector, typ liganden voor de selectienaam en klik op OK. Nogmaals, selecteer zone met behulp van het menu Selecteren. Schakel dit in op resten en zorg ervoor dat het bovenste vakje is aangevinkt.
Klik op OK. Merk op dat de delen van de cartoon binnen vijf angstroms van deze liganden worden gemarkeerd. Om de zijketens als stokken weer te geven en de actieve watermoleculen van de site weer te geven, gebruikt u het menu met atoombindingen om ze weer te geven.
Of schakel ze hier in met deze knoppen. Als u de selectie wilt wissen, klikt u ergens in de lege ruimte. Het eindresultaat van dit protocol moet een model zijn met de actieve plaats van het eiwit en de liganden weergegeven als stokken die op een contrasterende manier zijn gekleurd.
Belangrijke polaire bindingsinteracties worden weergegeven met stippellijnen en sommige van de residuen die contacten maken, zijn gelabeld. De iCn3D-interface bevat vervolgkeuzemenu's, de structuurviewer en een opdrachtlogboek. In deze weergave worden de pop-upmenu's voor selectiesets en volgorde en annotaties weergegeven, die worden weergegeven wanneer de gebruiker opdrachten uitvoert waarvoor deze nodig zijn.
We beginnen het protocol bij stap 2.4, waarbij residuen binnen vijf angstroms worden geselecteerd om een actieve locatie te definiëren. Om de liganden te selecteren, gebruikt u het vervolgkeuzemenu selecteren en klikt u op selecteren op 3D, zorg ervoor dat het residu is aangevinkt. Houd de alt-knop op een pc of de optieknop op een Mac ingedrukt en klik op de eerste ligand.
Druk vervolgens op control en klik op de resterende twee ligans om ze aan de selectie toe te voegen. Sla de selectie op met behulp van het vervolgkeuzemenu, klik op selecteren, sla selectie op, voer een naam in en klik op opslaan. Het pop-upmenu Geselecteerde sets wordt nu weergegeven met de drie liganden geselecteerd.
Selecteer nu de residuen binnen vijf angstroms van de liganden. Gebruik het vervolgkeuzemenu selecteer op afstand. In het pop-upmenu dat verschijnt, wijzigt u de speer van het tweede item met een straal in vijf angstroms door in het blok te typen, klik op display.
En sluit vervolgens het venster door op de X in de rechterbovenhoek te klikken. Sla de vijf angstrom actieve site op door op het vervolgkeuzemenu te klikken, selecteer selectie opslaan en gebruik het toetsenbord om een naam in te voeren. Klik vervolgens op Opslaan.
Maak nu een nieuwe selectie die de twee sets combineert. Deze kunnen worden gecombineerd in het pop-upmenu met geselecteerde sets. Klik op een pc met de besturing op de twee sets of klik op een Mac-opdracht.
Klik nogmaals op het vervolgkeuzemenu, selecteer selectie opslaan en typ een nieuwe naam en klik vervolgens op Opslaan. Om interacties zoals waterstofbruggen weer te geven, gebruikt u het analysemenu en selecteert u interacties. We zullen hier alleen geïnteresseerd zijn in waterstofbruggen en zoutbruggen.
Dus we zullen de rest van deze uitvinken. We selecteren drie liganden. En voor de tweede set, de resten binnen vijf angstroms.
Klik op 3D-weergave-interacties en sluit het venster. Dit toont enkele van de residuen die op elkaar inwerken, maar het toont niet de volledige vijf angstrom actieve site. Om dat weer te geven, wordt het menu select sets opnieuw gebruikt.
Klik op vijf angstrom vol en klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu op stijl zijkettingen, sticks. Om CPK-kleuren toe te passen, klikt u op het vervolgkeuzemenu kleur en klikt u op atoom. Het eindresultaat van het protocol zou een model moeten zijn dat er zo uitziet met de actieve plaats van het eiwit en het ligand weergegeven als stokjes die op een contrasterende manier zijn gekleurd.
Belangrijke bindingsinteracties worden weergegeven met stippellijnen en alle residuen binnen een van de selecties die tijdens het protocol zijn gemaakt, worden gelabeld. De Jmol-interface bevat vervolgkeuzemenu's, een werkbalk, de structuurviewer, een pop-upmenu en de Jmol-console met de opdrachtregel. We beginnen het Jmol-protocol bij stap 3.4, waarbij residuen binnen vijf angstroms worden geselecteerd om een actieve plaats te definiëren.
De Jmol-console is de beste manier om de resten binnen vijf angstroms te selecteren. Typ dit commando om residuen binnen vijf angstroms van de drie liganden te selecteren. Er worden 193 atomen geselecteerd, maar deze vertegenwoordigen niet de volledige aminozuurresiduen.
Om deze te selecteren, gebruikt u de getypte opdracht, selecteert u within(group, selected) en drukt u op enter. Er worden extra selectiehalo's weergegeven. Om deze resten als sticks weer te geven, klikt u met de rechtermuisknop om het pop-upmenu te openen, plaatst u de muisaanwijzer op stijl, schema en klikt u vervolgens op sticks.
Merk op dat er hier nog steeds enkele lege halo's zijn. Dit zijn de watermoleculen in de actieve plaats. Om alleen de watermoleculen te selecteren, kunnen we dit commando opnieuw uitvoeren en vervolgens wijzigen.
Klik in de console en gebruik vervolgens de pijltoetsen omhoog om die opdracht te vinden en klik op Enter om deze opnieuw uit te voeren. Om de watermoleculen als atomen weer te geven, willen we de selectie van het ligand en het eiwit verwijderen. We typen twee commando's om dat te doen.
Onze ligans worden beschouwd als heterogroepen, maar water wordt ook als één beschouwd. Dus binnen dit commando moeten we definiëren dat we het water niet verwijderen. Druk op enter en nu worden alleen de watermoleculen geselecteerd.
Klik op het vervolgkeuzemenu, beweeg de muisaanwijzer over atoom en klik op 20% van de straal van Van der Waals. Het groene magnesiumion wordt nog steeds weergegeven als stokjes. Vaker worden ionen weergegeven als bollen.
Klik in de Jmol-console en typ vervolgens MG selecteren en vul vervolgens 50% De liganden in de kettingen zijn identiek gekleurd. Om ze van elkaar te onderscheiden, is het handig om de liganden opnieuw te kleuren. In de console voer ik een multiline-commando uit, dat ik heb gekopieerd-geplakt van een spiekbriefje dat ik uitwerk in de aanvullende Jmol-video.
Het resultaat van dit protocol zou een model moeten zijn dat er zo uitziet met de actieve plaats van het eiwit weergegeven als sticks. En de liganden toonden ons stokken in een zachter kleurenschema. Gele lijnen geven de bindingsinteracties aan en individuele residuen worden naar wens geëtiketteerd.
De PyMOL-interface bevat vervolgkeuzemenu's, de structuurviewer, het deelvenster namenobjecten en het menu met muisbedieningen. De hoofdopdrachtregel is ook gelabeld in deze afbeelding. We beginnen het oerprotocol bij stap 4.4, waarbij residuen binnen vijf angstroms worden geselecteerd om een actieve locatie te definiëren.
Om de liganden te selecteren, klikt u op elk van hen. Er verschijnt een nieuwe selectie, die kan worden hernoemd door op de A-knop te klikken. Verwijder met het toetsenbord de letters sele en typ ligans in plaats daarvan.
Druk op enter. We kunnen deze selectie gebruiken om het gebied eromheen te definiëren. Klik eerst op de A-knop en selecteer het duplicaat van het menu-item.
Klik in deze nieuwe selectie, sel01, op A en selecteer het menu-item Naam wijzigen. Verwijder met het toetsenbord de bestaande letters en typ actief. Dit is nog steeds het selecteren van onze drie liganden, dus we zullen het opnieuw moeten wijzigen met behulp van de A-actieknop.
Klik op de knop, selecteer wijzigen en vouw de selectie uit met vijf angstroms. Nu hebben we de liganden en de residuen binnen vijf angstroms gevangen. De S op de S-knop staat voor show.
Klik hierop om het eiwit op verschillende manieren weer te geven. We laten deze drop zien als stokken. Klik in de lege ruimte om de selectie te wissen.
Dit heeft de aminozuren binnen vijf angstroms gevangen, maar niet het water. We kunnen opnieuw de selectie dupliceren en nu aanpassen om alleen het water te selecteren. In de A-knop acties, dupliceren.
Selectie 2 verschijnt. Laten we dit hernoemen naar actief water. Deze keer gebruiken we de A-knop om te wijzigen, rond om de atomen rond onze selectie te selecteren.
Atomen binnen vier angstroms. Deze heeft het water geselecteerd maar ook enkele atomen van de zijketens. Als u dit verder wilt wijzigen, gebruikt u de A-knop om oplosmiddel te wijzigen en te beperken.
Nu kunnen we zien dat alleen de watermoleculen worden verlicht. Ook in de A-knop kunnen we een preset toepassen. Selecteer preset, bal en stick en nu worden de watermoleculen weergegeven als bolletjes.
Het eindresultaat van het protocol is een model dat er zo uitziet met de actieve plaats in liganden weergegeven als stokken die op een contrasterende manier zijn gekleurd. Gele streepjeslijnen tonen polaire bindingsinteracties en afzonderlijke resten worden gelabeld met behulp van de selecties die zijn gemaakt in het deelvenster Objecten namen. Fouten in de uitvoering van het protocol kunnen leiden tot suboptimale resultaten.
Bijvoorbeeld, het hele eiwit wordt weergegeven als stokjes. Om problemen op te lossen, moet de gebruiker eerst de stickweergave voor de hele structuur verbergen. En geef vervolgens de stickweergave opnieuw weer voor alleen het object dat actief wordt genoemd met de S-knop.
Hier worden de modellen die met elk programma worden gegenereerd, naast elkaar weergegeven. Hoewel er verschillen zijn in de weergave van het enzym, zijn dezelfde belangrijke kenmerken en interacties te zien in elk van de vier modellen. Een gebruiker die geïnteresseerd is in het beheersen van een van de programma's met een opdrachtregel, wil leren getypte opdrachten toe te passen en te wijzigen.
Zoals ik al aangaf in het Jmol-protocol, is een handig hulpmiddel een commando-spiekbriefje. Een tekstbestand zonder opmaak met veelgebruikte codes om naar te verwijzen. Om een gevorderde gebruiker te worden, is het handig om te begrijpen welke delen van het protocol kunnen worden aangepast en aangepast.
Met oefening kunnen deze protocollen worden toegepast om elke enzym actieve plaats van belang te modelleren.
Overzicht
Dit artikel demonstreert de vaardigheid van biomoleculaire modellering door de actieve plaats van het enzym glucokinase te visualiseren met behulp van vier gratis programma's: iCn3D, Jmol, PyMOL en UCSF ChimeraX. De tutorial biedt stap-voor-stap instructies voor het modelleren en annoteren van de actieve plaats met gebonden liganden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomoleculaire modellering
- Eiwitvisualisatie
- Analyse van actieve plaatsen van enzymen
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitstructuren is cruciaal in de biologische wetenschappen.
- Actieve plaatsen zijn essentieel voor enzymfunctie en interactie met substraten.
- Er zijn verschillende softwaretools beschikbaar voor het visualiseren van macromoleculen.
- Deze studie richt zich op glucokinase, een enzym dat betrokken is bij glucosemetabolisme.
Doel van de studie
- Om onderzoekers te leren hoe ze actieve plaatsen van enzymen effectief kunnen modelleren.
- Om verschillende moleculaire visualisatietools te vergelijken.
- Om een uitgebreide gids te bieden voor het selecteren en weergeven van liganden en residuen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van iCn3D, Jmol, PyMOL en UCSF ChimeraX voor modellering.
- Stap-voor-stap protocol voor het selecteren van residuen binnen vijf angstrom van liganden.
- Visualisatie van aminozuren en watermoleculen in de nabijheid van liganden.
- Annotatie van belangrijke interacties en structurele kenmerken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle modellering van de actieve plaats van glucokinase met gebonden liganden.
- Duidelijke visualisatie van interacties tussen het enzym en substraten.
- Demonstratie van de mogelijkheden van elk softwaretool.
- Creatie van een gedetailleerde instructievideo voor elk programma.
Conclusies
- De studie biedt waardevolle inzichten in biomoleculaire modelleringstechnieken.
- Het benadrukt het belang van softwaretools in de structurele biologie.
- Onderzoekers kunnen actieve plaatsen van enzymen effectief visualiseren en analyseren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Biomolecular visualization enables target validation by revealing structural determinants of ligand binding and enzyme function. Modeling active sites supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying structure-function relationships. This skill enhances predictive confidence in lead identification and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of ligand-binding interactions in the glucokinase active site.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying key amino acid residues and water molecules involved in substrate recognition.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing structural insights that inform target confidence and druggability assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological models for downstream screening by defining active site residues within five angstroms of bound ligands.
- Operational Value: Promotes assay standardization and reproducibility through consistent visualization of binding interactions across iCn3D, Jmol, PyMOL, and UCSF ChimeraX.
- Scalability: Enables platform reuse for screening campaigns by providing transferable protocols for modeling any enzyme active site of interest.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural insights to preclinical validation by maintaining consistency in active site modeling across workflows.
- Mechanistic De-risking: Highlights polar binding interactions and residue labeling to support structure-based design and lead optimization.
- Disease Relevance: Models human glucokinase, a key enzyme in glucose metabolism, relevant to diabetes and metabolic disorder target programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by enabling structural analysis of enzyme-ligand complexes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing how ligands bind to the glucokinase active site.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized selection and display of residues and water molecules in proximity to ligands.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as hydrogen bond visualization and residue labeling that aid in comparing ligand-binding modes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable framework for modeling enzyme active sites in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for modeling any enzyme active site, reducing redundant training and increasing cross-team consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in enzyme-ligand interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and cross-platform consistency in biomolecular visualization.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in early discovery, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and binding site accessibility.
Implementation Considerations
- Requires foundational knowledge in structural biology and protein-ligand interactions.
- Needs access to computational infrastructure capable of running iCn3D, Jmol, PyMOL, or UCSF ChimeraX.
- Demands cross-team standardization of visualization protocols to ensure consistent interpretation of active site models.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different enzyme systems or ligand types.
- Limited by user proficiency in command-line interfaces and selection tools across the four software platforms.
