Name: Modellering van een Enzyme Active Site met behulp van Moleculaire Visualisatie Freeware (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Leer biomoleculaire modellering van enzymactieve plaatsen met behulp van iCn3D, Jmol, PyMOL en UCSF ChimeraX. Deze tutorial toont stapsgewijs hoe je glucokinase structuren visualiseert met liganden en residuen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiering voor dit werk is verstrekt door de National Science Foundation:
Verbetering van de Undergraduate STEM Education Grant (Award #1712268)
Onderzoekscoördinatienetwerken in undergraduate in undergraduate biologieonderwijs (Award # 1920270)
We zijn Karsten Theis, PhD, Westfield University, dankbaar voor de nuttige discussies over Jmol.

De auteurs verklaren dat ze geen relevante of materiële financiële belangen hebben die betrekking hebben op het onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven.

Dit protocol schetst een tienstappenproces voor de modellering van een enzymactieve site, toegepast op vier populaire programma's voor biomoleculaire modellering. De kritieke stappen van het protocol zijn: het identificeren van de liganden op de actieve plaats, het selecteren van residuen binnen 5 Å om een actieve plaats te definiëren en het tonen van de interacties van het enzym met de actieve plaats liganden. Het onderscheiden van de liganden die relevant zijn voor de biologische functie is van het grootste belang, omdat dit de gebruiker in staat stelt om de aminozuurresiduen binnen 5 Å te definiëren die een rol kunnen spelen bij het binden van de liganden. Ten slotte stelt het gebruik van het programma om moleculaire interacties weer te geven de gebruiker in staat om de vaardigheden te ontwikkelen die nodig zijn om de moleculaire interacties te begrijpen die binding bevorderen.
Een beperking van computergebaseerde moleculaire modelleringsprotocollen is de afhankelijkheid van specifieke opdrachten en syntaxis. Hoewel biochemische protocollen tolerant kunnen zijn voor kleine veranderingen in de procedure, kunnen computergebaseerde onderzoeken enorm verschillende eindproducten opleveren als de procedure niet nauw wordt nageleefd. Dit is met name belangrijk bij het gebruik van opdrachtregelinterfaces waarbij programmaspecifieke syntaxis vereist is om een bepaalde uitvoer te bereiken, en een schijnbaar onbeduidende wijziging in interpunctie of hoofdlettergebruik kan ertoe leiden dat een opdracht mislukt. Er zijn verschillende Wiki's en handleidingen voor elk programma, waar een gebruiker opdrachtregelinvoer kan vinden en problemen kan oplossen; de gebruiker moet zorgvuldig letten op de details van de opdrachtsyntaxis. Hoewel de meeste moleculaire visualisatieprogramma's opdrachten ongedaan maken bevatten, vanwege de complexiteit van de interfaces, keert het ongedaan maken commando niet altijd getrouw de laatst uitgevoerde stap om. Daarom wordt het opslaan van de huidige werkstatus vaak aangemoedigd, vooral voor nieuwe gebruikers.
Verdere beperkingen kunnen voortvloeien uit de gegevens die worden gebruikt om het model zelf te maken. Hoewel de standaarden die inherent zijn aan de Protein Data Bank zorgen voor een zekere mate van consistentie, zullen gebruikers van moleculaire visualisatieprogramma's vaak onverwachte effecten tegenkomen in een eiwitweergave. Ten eerste worden de meeste structuren bepaald met behulp van röntgenkristallografie, die een enkel model van het eiwit biedt; NMR-structuren zijn echter vaak samengesteld uit meerdere modellen die één voor één kunnen worden gevisualiseerd. Ten tweede kunnen structuren bepaald op basis van kristallografie of cryogene elektronenmicroscopie-experimenten atomen bevatten waarvan de positie niet kan worden opgehelderd en verschijnen als hiaten in bepaalde representaties van het eiwit. Eiwitstructuren kunnen alternatieve conformaties van zijketens hebben, die, wanneer weergegeven in stick rendering, verschijnen als twee groepen die uit dezelfde aminozuurruggegraat steken. Zelfs korte delen van de ruggengraat kunnen dergelijke alternatieve conformaties hebben, en soms worden liganden in de actieve plaats in meer dan één bindende conformatie gesuperponeerd.
Voor een kristalstructuur omvatten de gedeponeerde 3D-coördinaten alle componenten van de asymmetrische eenheid, die voldoende informatie biedt om de herhalende eenheid van een eiwitkristal te reproduceren. Soms bevat deze structuur extra eiwitketens in vergelijking met de biologisch actieve vorm van het eiwit (bijv. Foetale hemoglobinemutant, PDB ID: 4MQK). Omgekeerd laden sommige programma's mogelijk niet automatisch alle ketens van de biologisch actieve eenheid. Het SARS-CoV2-hoofdprotease (PDB ID: 6Y2E) laadt bijvoorbeeld de helft van het biologisch actieve dimeer (bestaande uit twee eiwitketens) wanneer het wordt opgehaald met behulp van de commando's die in dit protocol worden beschreven in ChimeraX, PyMOL en Jmol. Hoewel een kleine wijziging van het commando het biologisch actieve dimeer zal laden, is deze overweging mogelijk niet eenvoudig voor de beginnende gebruiker van het modelleringsprogramma. Een ander probleem dat zich kan voordoen, is de identificatie van de actieve locatie of het substraat zelf. Kristallografische experimenten worden uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid aan moleculen, die kunnen worden gemodelleerd in de uiteindelijke structuur. Sulfaatmoleculen kunnen bijvoorbeeld fosfaatbindende plaatsen in de actieve site binden, of ze kunnen andere regio's binden die niet relevant zijn voor het mechanisme. Deze moleculen kunnen de juiste identificatie van de actieve site zelf verdoezelen en kunnen zelfs aan de student suggereren dat ze deel uitmaken van het mechanisme.
Vermoedelijk zal de gebruiker deze procedure willen toepassen op andere actieve/bindende sites. Om dit protocol toe te passen in de toekomstige werkzaamheden met betrekking tot de analyse van nieuwe eiwitactieve plaatsen, moet de gebruiker identificeren welke van de gebonden liganden relevant zijn om te functioneren. Sommige liganden zijn niet geassocieerd met de eiwitfunctie en zijn in plaats daarvan het resultaat van de oplosmiddel- of kristallisatieomstandigheden die worden gebruikt om het experiment uit te voeren (bijvoorbeeld het kaliumion dat aanwezig is in het 3FGU-model). De belangrijkste liganden moeten worden geïdentificeerd door het originele manuscript te raadplegen. Met oefening en, indien van toepassing, een goed begrip van de syntaxis van de regelopdracht, kan een gebruiker het protocol voor het gewenste modelleringsprogramma toepassen op elke enzymactieve site en andere macromoleculen van zijn keuze modelleren.
Het identificeren en analyseren van gebonden substraten en liganden staat centraal in de opheldering van moleculaire mechanismen en op structuur gebaseerde inspanningen voor het ontwerpen van geneesmiddelen, die direct hebben geleid tot verbeteringen in behandelingen voor ziekten, waaronder verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) enCOVID-19 47,48,49,50,51,52 . Hoewel individuele moleculaire visualisatieprogramma's verschillende interfaces en gebruikerservaringen bieden, bieden de meeste vergelijkbare functies. Het is belangrijk voor de ontwikkeling van biomoleculaire visualisatiegeletterdheid dat studenten biochemie op het hoogste niveau vertrouwd raken met structuurvisualisatie en de hulpmiddelen om dergelijke afbeeldingen te genereren4,20,53. Dit stelt studenten in staat om verder te gaan dan de interpretatie van tweedimensionale afbeeldingen in studieboeken en tijdschriftartikelen en om gemakkelijker hun eigen hypothesen te ontwikkelen uit structurele gegevens54, die ontwikkelende wetenschappers zullen voorbereiden om toekomstige volksgezondheidsproblemen aan te pakken en het begrip van biochemische processen te verbeteren.
Samenvattend beschrijft dit protocol actieve sitemodellering met behulp van vier toonaangevende gratis macromoleculaire modelleringsprogramma's. Onze community, BioMolViz, hanteert een niet-softwarespecifieke benadering van biomoleculaire modellering. We hebben specifiek een kritiek of vergelijking van programmafuncties vermeden, hoewel een gebruiker die elk programma bemonstert waarschijnlijk zal merken dat ze de voorkeur geven aan bepaalde aspecten van macromoleculaire modellering in het ene programma versus het andere. We nodigen lezers uit om het BioMolViz Framework te gebruiken, dat de op biomoleculaire visualisatie gebaseerde leerdoelen en -doelstellingen beschrijft die in dit protocol zijn gericht, en bronnen te verkennen voor het onderwijzen en leren van biomoleculaire visualisatie via de BioMolViz-communitywebsite op http://biomolviz.org.

Het begrijpen van representaties van de moleculaire wereld is van cruciaal belang om een expert te worden in de biomoleculairewetenschappen 1, omdat de interpretatie van dergelijke beelden de sleutel is tot het begrijpen van de biologische functie2. De inleiding van een leerling tot macromoleculen komt meestal in de vorm van tweedimensionale leerboekafbeeldingen van celmembranen, organellen, macromoleculen, enz., Maar de biologische realiteit is dat dit driedimensionale structuren zijn, en een goed begrip van hun eigenschappen vereist manieren om betekenis te visualiseren en te extraheren uit 3D-modellen.
Dienovereenkomstig heeft de ontwikkeling van biomoleculaire visuele geletterdheid in hogere divisie moleculaire life science-cursussen aandacht gekregen, met een aantal artikelen die rapporteren over het belang en de moeilijkheden van het onderwijzen en beoordelen van visualisatievaardigheden1,3,4,5,6,7,8,9 . De reactie op deze artikelen is een toename van het aantal klassikale interventies, meestal binnen een semester in een enkele instelling, waarbij moleculaire visualisatieprogramma's en -modellen worden gebruikt om moeilijke concepten te targeten2,10,11,12,13,14,15 . Daarnaast hebben onderzoekers geprobeerd te karakteriseren hoe studenten biomoleculaire visualisatieprogramma's en / of modellen gebruiken om een specifiek onderwerp16,17,18,19te benaderen. Onze eigen groep, BioMolViz, heeft een raamwerk beschreven dat overkoepelende thema's in visuele geletterdheid onderverdeelt in leerdoelen en doelstellingen om dergelijke interventies te begeleiden20,21,en we leiden workshops die faculteiten trainen om het kader te gebruiken in het achterwaartse ontwerp van beoordelingen om visuele geletterdheidsvaardigheden te meten22.
Centraal in al dit werk staat een kritische vaardigheid: het vermogen om structuren van macromoleculen te manipuleren met behulp van programma's voor biomoleculaire visualisatie. Deze tools zijn onafhankelijk ontwikkeld met behulp van verschillende platforms; daarom kunnen ze vrij uniek zijn in hun werking en gebruik. Dit vereist programmaspecifieke instructies en de identificatie van een programma waarmee een gebruiker vertrouwd is, is belangrijk om de verdere implementatie te vergemakkelijken.
Naast de basisprincipes van het manipuleren van structuren in 3D (roteren, selecteren en wijzigen van het model), is een belangrijk doel om de actieve plaats van een eiwit te modelleren. Dit proces stelt een leerling in staat om zijn begrip te ontwikkelen in drie overkoepelende thema's beschreven door het BioMolViz Framework: moleculaire interacties, liganden / modificaties en structuur-functierelaties20,21.
Vier populaire keuzes van programma's voor biomoleculaire visualisatie zijn: Jmol / JSmol23,iCn3D24,PyMOL25en UCSF Chimera26,27. We moedigen degenen die nieuw zijn bij Chimera aan om UCSF ChimeraX te gebruiken, de volgende generatie van het Chimera moleculaire visualisatieprogramma, de momenteel ondersteunde versie van het programma.
In dit protocol laten we zien hoe we elk van deze vier programma's kunnen gebruiken om de actieve plaats van menselijk glucokinase te modelleren met een gebonden substraat analoog complex (PDB ID: 3FGU), en om metingen weer te geven om specifieke bindingsinteracties te illustreren28. Het model vertegenwoordigt een katalytisch complex van het enzym. Om de actieve plaats in de prekatalysetoestand vast te leggen, werd een niet-hydrolyseerbaar analoog van ATP gebonden aan de actieve glucokinase-plaats. Deze fosfoaminofosfonzuur-adenylaatester (ANP) bevat een fosfor-stikstofbinding in plaats van de gebruikelijke fosfor-zuurstofkoppeling op deze positie. De actieve site bevat ook glucose (aangeduid met BCG in het model) en magnesium (aangeduid met MG). Bovendien is er een kaliumion (K) in de structuur, als gevolg van kaliumchloride dat wordt gebruikt in het kristallisatie-oplosmiddel. Dit ion is niet kritisch voor de biologische functie en bevindt zich buiten de actieve plaats.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig01.jpg"> Figuur 1: ATP/ANP structuren. Adenosinetrifosfaat (ATP) structuur vergeleken met de fosfoaminofosfonzuur-adenylaat ester (ANP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het protocol toont de selectie van de gebonden liganden van het substraat analoog complex en de identificatie van actieve-site residuen binnen 5 Å van het gebonden complex, dat aminozuren en watermoleculen vangt die in staat zijn om relevante moleculaire interacties te maken, waaronder hydrofobe en van der Waals interacties.
De weergave wordt in eerste instantie gemanipuleerd om het grootste deel van het eiwit in een cartoonweergave weer te geven, met de aminozuurresiduen van de actieve plaats in stokweergave om de relevante atomen van het eiwit te tonen en de moleculaire interacties te benadrukken. Na stap 3 van het protocol voor elk programma zijn deze representaties toegepast en is de weergave van het eiwit vergelijkbaar tussen programma's(figuur 2). Aan het einde van het protocol is de eiwitcartoon verborgen om de weergave te vereenvoudigen en zich te concentreren op de actieve site.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig02.jpg"> Figuur 2: Structuurvergelijking tussen programma's. Vergelijking van de structuur van 3FGU in elk programma volgens de stap De representatie aanpassen (stap 2 of 3 van elk protocol). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
CPK-kleuring wordt toegepast op de actieve plaats aminozuren en gebonden liganden29,30. Dit kleurschema onderscheidt atomen van verschillende chemische elementen in moleculaire modellen die worden weergegeven in lijn-, stok-, bal- en stok- en ruimtevullende representaties. Waterstof is wit, stikstof is blauw, zuurstof is rood, zwavel is geel en fosfor is oranje in het CPK-kleurenschema. Traditioneel wordt zwart gebruikt voor koolstof, hoewel in modern gebruik de koolstofkleuring kan variëren.
Waterstofatomen zijn niet zichtbaar in kristalstructuren, hoewel elk van deze programma's in staat is om hun locatie te voorspellen. Het toevoegen van de waterstofatomen aan een grote macromoleculaire structuur kan het zicht vertroebelen, dus ze worden niet weergegeven in dit protocol. Dienovereenkomstig zullen waterstofbruggen worden getoond door te meten vanuit het midden van twee heteroatomen (bijv. Zuurstof naar zuurstof, zuurstof naar stikstof) in deze structuren.
Programma Overzichten Downloadbare grafische gebruikersinterfaces (GUI's): PyMOL (versie 2.4.1), ChimeraX (versie 1.2.5) en Jmol (versie 1.8.0_301) zijn gui-gebaseerde moleculaire modelleringstools. Deze drie interfaces zijn voorzien van opdrachtregels om getypte code in te voeren; veel van dezelfde mogelijkheden zijn beschikbaar via menu's en knoppen in de GUI. Een gemeenschappelijk kenmerk in de opdrachtregel van deze programma's is dat de gebruiker eerdere opdrachten kan laden en opnieuw kan uitvoeren met behulp van de pijltoetsen omhoog en omlaag op het toetsenbord.
Webgebaseerde GUI's: iCn3D (I-see-in-3D) is een WebGL-gebaseerde viewer voor interactieve weergave van driedimensionale macromoleculaire structuren en chemicaliën op het web, zonder dat u een afzonderlijke toepassing hoeft te installeren. Het maakt geen gebruik van een opdrachtregel, hoewel de volledige webversie een bewerkbaar opdrachtlogboek bevat. JSmol is een JavaScript- of HTML5-versie van Jmol voor gebruik op een website of in een webbrowservenster en lijkt qua werking sterk op Jmol. JSmol kan worden gebruikt om online tutorials te maken, inclusief animaties.
Proteopedia31,32, FirstGlance in Jmol33en de JSmol-webinterface (JUDE) aan de Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling zijn voorbeelden van dergelijke Jmol-gebaseerde online ontwerpomgevingen34. De Proteopedia wiki is een leermiddel waarmee de gebruiker een macromolecuulstructuur kan modelleren en pagina's met deze modellen kan maken binnen de website35. De Proteopedia scene authoring tool, gebouwd met behulp van JSmol, integreert een GUI met extra functies die niet beschikbaar zijn in de Jmol GUI.
Jmol en iCn3D zijn gebaseerd op de programmeertaal Java; JSmol gebruikt Java of HTML5 en PyMOL en ChimeraX zijn gebaseerd op de programmeertaal Python. Elk van deze programma's laadt eiwitgegevensbankbestanden, die kunnen worden gedownload van de RCSB Protein Data Bank onder een 4-cijferige alfanumerieke PDB ID36,37. De meest voorkomende bestandstypen zijn Protein Data Bank (PDB)-bestanden met de extensie .pdb en Crystallographic Information File (CIF of mmCIF) met de extensie .cif. CIF heeft PDB vervangen als het standaardbestandstype voor de Protein Data Bank, maar beide bestandsindelingen werken in deze programma's. Er kunnen kleine verschillen zijn in de manier waarop de volgorde/structuur wordt weergegeven bij het gebruik van CIF in tegenstelling tot PDB-bestanden; de bestanden werken echter op dezelfde manier en de verschillen zullen hier niet in detail worden behandeld. De Molecular Modeling Database (MMDB), een product van het National Center for Biotechnology Information (NCBI), is een subset van VOB-structuren waaraan categorische informatie is gekoppeld (bijv. Biologische kenmerken, geconserveerde eiwitdomeinen)38. iCn3D, een product van de NCBI, is in staat om PDB-bestanden met de MMDB-gegevens te laden.
Om een model te bekijken, kan de gebruiker het gewenste bestand downloaden van de speciale pagina Eiwitgegevensbank voor de structuur (bijvoorbeeld https://www.rcsb.org/structure/3FGU) en vervolgens het vervolgkeuzemenu Bestand van het programma gebruiken om de structuur te openen. Alle programma's zijn ook in staat om een structuurbestand rechtstreeks via de interface te laden, en die methode wordt gedetailleerd in de protocollen.
De ChimeraX-, Jmol- en PyMOL-GUI's bevatten elk een of meer vensters van de console die kunnen worden gewijzigd door de hoek te slepen. iCn3D en JSmol bevinden zich volledig in een webbrowser. Wanneer u iCn3D gebruikt, moet de gebruiker mogelijk in de pop-upvensters scrollen om alle menu-items weer te geven, afhankelijk van de schermgrootte en resolutie.
De protocollen die hier worden beschreven, bieden een eenvoudige methode om de actieve plaats van het enzym weer te geven met behulp van elk programma. Opgemerkt moet worden dat er meerdere manieren zijn om de stappen in elk programma uit te voeren. In ChimeraX kan dezelfde taak bijvoorbeeld worden uitgevoerd met behulp van vervolgkeuzemenu's, de werkbalk bovenaan of de opdrachtregel. Gebruikers die geïnteresseerd zijn in het leren van een specifiek programma in detail worden aangemoedigd om de online tutorials, handleidingen en Wiki's te verkennen die beschikbaar zijn voor deze programma's39,40,41,42,43,44,45,46.
Bestaande handleidingen en zelfstudies voor deze programma's presenteren de items in dit protocol als afzonderlijke taken. Om een actieve site weer te geven, moet de gebruiker de vereiste bewerkingen synthetiseren uit de verschillende handleidingen en zelfstudies. Dit manuscript vormt een aanvulling op bestaande zelfstudies die beschikbaar zijn door een lineair protocol te presenteren voor het modelleren van een gelabelde actieve site met moleculaire interacties, waardoor de gebruiker een logica krijgt voor actieve sitemodellering die kan worden toegepast op andere modellen en programma's.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig03.jpg"> Figuur 3: Chimerax GUI. ChimeraX GUI-interface met de vervolgkeuzemenu's, werkbalk, structuurviewer en opdrachtregel gelabeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig04.jpg"> Afbeelding 4: iCn3D GUI. iCn3D GUI-interface met de vervolgkeuzemenu's, werkbalk, structuurviewer, opdrachtlogboek, pop-up van geselecteerde sets en pop-upmenu's met volgorde en annotaties gelabeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig05.jpg"> Figuur 5: Jmol GUI. Jmol GUI-interface met de vervolgkeuzemenu's, werkbalk, structuurviewer, pop-upmenu en console / opdrachtregel gelabeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig06.jpg"> Figuur 6: PyMOL GUI. PyMOL GUI-interface met de vervolgkeuzemenu's, structuurviewer, namen / objectpaneel, muisbedieningsmenu en opdrachtregel gelabeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>ChimeraX (Versie 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td>Elke</td></tr><tr><td>iCn3D (alleen web-gebaseerd: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Java (voor Jmol) https://java.com/en/download/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jmol (Versie 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis (optioneel)</td><td></td><td></td><td>Elke</td></tr><tr><td>PyMOL (Versie 2.4.1 - educatief): https://pymol.org/2 educatief gebruik alleen versie: https://pymol.org/edu/?q=educational</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modellering van een enzyme active site met behulp van moleculaire visualisatie freeware

Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Biomoleculaire visualisatievaardigheden zijn van het grootste belang voor het begrijpen van sleutelbegrippen in de biologische wetenschappen, zoals structuur-functierelaties en moleculaire interacties. Verschillende programma's stellen een leerling in staat om 3D-structuren te manipuleren, en biomoleculaire modellering bevordert actief leren, bouwt computationele vaardigheden op en overbrugt de kloof tussen tweedimensionale tekstboekafbeeldingen en de drie dimensies van het leven. Een cruciale vaardigheid op dit gebied is om een eiwitactieve plaats te modelleren, waarbij delen van het macromolecuul worden weergegeven die kunnen interageren met een klein molecuul of ligand, op een manier die bindende interacties vertoont. In dit protocol beschrijven we dit proces met behulp van vier vrij beschikbare macromoleculaire modelleringsprogramma's: iCn3D, Jmol / JSmol, PyMOL en UCSF ChimeraX. Deze gids is bedoeld voor studenten die de basisprincipes van een specifiek programma willen leren, evenals instructeurs die biomoleculaire modellering in hun curriculum opnemen. Het protocol stelt de gebruiker in staat om een actieve site te modelleren met behulp van een specifiek visualisatieprogramma, of om een voorbeeld te nemen van verschillende van de beschikbare gratis programma's. Het model dat voor dit protocol is gekozen, is humaan glucokinase, een isovorm van het enzym hexokinase, dat de eerste stap van glycolyse katalyse katalyseert. Het enzym is gebonden aan een van zijn substraten, evenals een niet-reactief substraatanaloog, waarmee de gebruiker interacties in het katalytische complex kan analyseren.

Een succesvol uitgevoerd protocol voor elk van de programma's zal resulteren in een moleculair model ingezoomd op de actieve site, met actieve site residuen en liganden weergegeven als sticks, de eiwit cartoon verborgen, en liganden weergegeven met een contrasterend kleurenschema. Interagerende aminozuurresiduen moeten worden geëtiketteerd met hun identificatiemiddelen en waterstofbinding en ionische interacties moeten worden weergegeven met lijnen. De aanwezigheid van deze kenmerken kan worden bepaald door visuele inspectie van het model.
Om deze inspectie te vergemakkelijken en de gebruiker in staat te stellen te bepalen of ze de stappen van het protocol correct hebben uitgevoerd, hebben we geanimeerde figuren verstrekt die na elke stap een beeld van de structuur weergeven. Voor ChimeraX, iCn3D, Jmol en PyMOL wordt dit geïllustreerd in respectievelijk figuren 7-10.
Figuur 7: ChimeraX protocol output. Geanimeerde figuur ter illustratie van stappen 1.1-1.8 van het ChimeraX-protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure%207.mp4" target="_blank">Klik hier om deze figuur te downloaden.</a>
Figuur 8: iCn3D protocol output. Geanimeerde afbeelding ter illustratie van stap 2.1-2.8 van het iCn3D-protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure%208.mp4" target="_blank">Klik hier om deze figuur te downloaden.</a>
Figuur 9: Jmol protocol output. Geanimeerde figuur ter illustratie van stappen 3.1-3.8 van het Jmol-protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure%209.mp4" target="_blank">Klik hier om deze figuur te downloaden.</a>
Figuur 10: PyMOL protocol output. Geanimeerde figuur ter illustratie van stappen 4.1-4.8 van het PyMOL-protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure%2010.mp4" target="_blank">Klik hier om deze figuur te downloaden.</a>
De meest voorkomende fout die de uitkomst van deze protocollen kan beïnvloeden, is een foutieve selectie, waardoor een deel van de structuur wordt weergegeven in een ongewenste weergave. Dit is meestal het gevolg van verkeerd klikken, hetzij op de structuur zelf, hetzij in een van de knoppen van het weergavemenu. Een voorbeeld van een suboptimaal resultaat is een model met residuen buiten de actieve plaats die als stokken worden weergegeven. De gebruiker kan beginnen te analyseren of deze fout is opgetreden door de residuen die als sticks worden weergegeven visueel te inspecteren en ervoor te zorgen dat ze zich in de buurt van de actieve liganden bevinden. Een geavanceerde methode om te evalueren of de weergegeven residuen zich al dan niet binnen 5Å van de actieve locatieliganden bevinden, is het gebruik van de meetinstrumenten die in elk programma zijn ingebouwd om de afstand tussen een nabijgelegen ligand en het residu van de actieve locatie te meten. De meetinstrumenten vallen buiten het bestek van dit manuscript; we moedigen geïnteresseerde gebruikers echter aan om de vele online tutorials te verkennen waarin dit type analyse wordt beschreven.
We presenteren een specifiek voorbeeld van een suboptimale uitvoering van dit protocol, als gevolg van een verkeerde klik op het paneel namen /objecten in de PyMOL. Deze fout geeft het hele eiwit weer als sticks, in plaats van alleen de actieve site weer te geven met behulp van deze weergave, zoals geïllustreerd in figuur 11.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig11.jpg"> Figuur 11: Negatief resultaat. Voorbeeld van een negatief resultaat. Het verkeerd selecteren van de volledige cartoon in PyMOL en het weergeven van stokken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om problemen op te lossen, moet de gebruiker de sticks voor het hele model verbergen (met het label 3FGU in het deelvenster namen /objecten) en vervolgens de stickweergave weergeven voor alleen de selectie met de naam "actief", met behulp van de knoppen / opdrachten verbergen en weergeven in PyMOL. Het herstellen van het model van dit type fout is relatief eenvoudig zodra de gebruiker in staat is om geschikte selecties voor verschillende delen van het model te maken en deze effectief weer te geven en te verbergen. Het is verleidelijk om het protocol opnieuw op te starten en de stappen een andere keer te doorlopen; we moedigen de gebruiker echter aan om niet bang te zijn om "off script" te gaan en met het model te experimenteren. Onze ervaring is dat het verwerken van weergavefouten de voortgang bij het begrijpen van het modelleringsprogramma vergemakkelijkt.
Een side-by-side weergave van de uiteindelijke uitvoer van een succesvol uitgevoerd protocol voor elk programma wordt weergegeven in Figuur 12. De weergaven zijn op dezelfde manier georiënteerd om de gebruiker in staat te stellen het uiterlijk van de modellen die in verschillende programma's zijn gemaakt, te vergelijken.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig12.jpg"> Figuur 12: Definitieve structuurvergelijking tussen programma's. Vergelijking van de structuur van elke actieve siterendering aan het einde van het protocol. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. Het PyMOL active site label bevat alle actieve site residuen en de liganden. De andere uitgangen hebben alleen waterstofgebonden zijketens gelabeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Een belangrijke vaardigheid in biomoleculaire modellering is het weergeven en annoteren van actieve plaatsen in eiwitten. Deze techniek wordt gedemonstreerd met behulp van vier populaire gratis programma's voor macromoleculaire visualisatie: iCn3D, Jmol, PyMOL en UCSF ChimeraX.

Modellering van een Enzyme Active Site met behulp van Moleculaire Visualisatie Freeware

Biomolecular visualization skills are paramount to understanding key concepts in the biological sciences, such as structure-function relationships and ...

Het visualiseren van biologische macromoleculen is een kritische vaardigheid voor studenten en professionals in de biologische wetenschappen. In dit protocol laten we zien hoe we de actieve plaats van het enzym glucokinase kunnen modelleren met behulp van vier vrij beschikbare programma's voor moleculaire modellering. Deze tutorial belicht verschillende stappen van het protocol voor elk programma, waaronder het selecteren van gebonden liganden en het gebruik van de liganden om aminozuren en watermoleculen binnen vijf angstroms weer te geven.De ondersteunende informatie van dit manuscript bevat een speciale video voor elk programma, waarin alle stappen van het protocol met verdere uitleg worden beschreven. De structuur zal PDBID modelleren. 3FGU vertegenwoordigt het katalytische complex van het enzym glucokinase.De enzym actieve site is gebonden aan twee van zijn substraten, beta-D-glucose, die de identificatie BGC en een magnesiumion, MG, heeft gegeven. Bovendien is dit substraatanaloog, een fosfoaminofosforzuur, adenylaatester, ANP gebonden aan de glucokinase-actieve plaats. Dit niet-hydrolyseerbare analoog van adenosinetrifosfaat, ATP voorkomt dat de fosforyleringsreactie optreedt, die de actieve plaats complexe prekatalyse vangt. De interface van het UCSF ChimeraX-modelleringsprogramma bevat vervolgkeuzemenu's, een werkbalk, de structuurviewer en een opdrachtregel.We beginnen het protocol met stap 1.4, waarbij residuen binnen vijf angstroms worden geselecteerd om een actieve site te definiëren. Om de liganden te selecteren, drukt u op control shift en klikt u op een atoom of binding in elk van de drie liganden. Druk op de pijl-omhoog totdat alle drie de liganden zijn gemarkeerd met een groene gloed.Definieer de selectie voor toekomstig gebruik door in het vervolgkeuzemenu te klikken, selecteer define selector, typ liganden voor de selectienaam en klik op OK. Nogmaals, selecteer zone met behulp van het menu Selecteren. Schakel dit in op resten en zorg ervoor dat het bovenste vakje is aangevinkt.Klik op OK. Merk op dat de delen van de cartoon binnen vijf angstroms van deze liganden worden gemarkeerd. Om de zijketens als stokken weer te geven en de actieve watermoleculen van de site weer te geven, gebruikt u het menu met atoombindingen om ze weer te geven.Of schakel ze hier in met deze knoppen. Als u de selectie wilt wissen, klikt u ergens in de lege ruimte. Het eindresultaat van dit protocol moet een model zijn met de actieve plaats van het eiwit en de liganden weergegeven als stokken die op een contrasterende manier zijn gekleurd.Belangrijke polaire bindingsinteracties worden weergegeven met stippellijnen en sommige van de residuen die contacten maken, zijn gelabeld. De iCn3D-interface bevat vervolgkeuzemenu's, de structuurviewer en een opdrachtlogboek. In deze weergave worden de pop-upmenu's voor selectiesets en volgorde en annotaties weergegeven, die worden weergegeven wanneer de gebruiker opdrachten uitvoert waarvoor deze nodig zijn.We beginnen het protocol bij stap 2.4, waarbij residuen binnen vijf angstroms worden geselecteerd om een actieve locatie te definiëren. Om de liganden te selecteren, gebruikt u het vervolgkeuzemenu selecteren en klikt u op selecteren op 3D, zorg ervoor dat het residu is aangevinkt. Houd de alt-knop op een pc of de optieknop op een Mac ingedrukt en klik op de eerste ligand.Druk vervolgens op control en klik op de resterende twee ligans om ze aan de selectie toe te voegen. Sla de selectie op met behulp van het vervolgkeuzemenu, klik op selecteren, sla selectie op, voer een naam in en klik op opslaan. Het pop-upmenu Geselecteerde sets wordt nu weergegeven met de drie liganden geselecteerd.Selecteer nu de residuen binnen vijf angstroms van de liganden. Gebruik het vervolgkeuzemenu selecteer op afstand. In het pop-upmenu dat verschijnt, wijzigt u de speer van het tweede item met een straal in vijf angstroms door in het blok te typen, klik op display.En sluit vervolgens het venster door op de X in de rechterbovenhoek te klikken. Sla de vijf angstrom actieve site op door op het vervolgkeuzemenu te klikken, selecteer selectie opslaan en gebruik het toetsenbord om een naam in te voeren. Klik vervolgens op Opslaan.Maak nu een nieuwe selectie die de twee sets combineert. Deze kunnen worden gecombineerd in het pop-upmenu met geselecteerde sets. Klik op een pc met de besturing op de twee sets of klik op een Mac-opdracht.Klik nogmaals op het vervolgkeuzemenu, selecteer selectie opslaan en typ een nieuwe naam en klik vervolgens op Opslaan. Om interacties zoals waterstofbruggen weer te geven, gebruikt u het analysemenu en selecteert u interacties. We zullen hier alleen geïnteresseerd zijn in waterstofbruggen en zoutbruggen.Dus we zullen de rest van deze uitvinken. We selecteren drie liganden. En voor de tweede set, de resten binnen vijf angstroms.Klik op 3D-weergave-interacties en sluit het venster. Dit toont enkele van de residuen die op elkaar inwerken, maar het toont niet de volledige vijf angstrom actieve site. Om dat weer te geven, wordt het menu select sets opnieuw gebruikt.Klik op vijf angstrom vol en klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu op stijl zijkettingen, sticks. Om CPK-kleuren toe te passen, klikt u op het vervolgkeuzemenu kleur en klikt u op atoom. Het eindresultaat van het protocol zou een model moeten zijn dat er zo uitziet met de actieve plaats van het eiwit en het ligand weergegeven als stokjes die op een contrasterende manier zijn gekleurd.Belangrijke bindingsinteracties worden weergegeven met stippellijnen en alle residuen binnen een van de selecties die tijdens het protocol zijn gemaakt, worden gelabeld. De Jmol-interface bevat vervolgkeuzemenu's, een werkbalk, de structuurviewer, een pop-upmenu en de Jmol-console met de opdrachtregel. We beginnen het Jmol-protocol bij stap 3.4, waarbij residuen binnen vijf angstroms worden geselecteerd om een actieve plaats te definiëren.De Jmol-console is de beste manier om de resten binnen vijf angstroms te selecteren. Typ dit commando om residuen binnen vijf angstroms van de drie liganden te selecteren. Er worden 193 atomen geselecteerd, maar deze vertegenwoordigen niet de volledige aminozuurresiduen.Om deze te selecteren, gebruikt u de getypte opdracht, selecteert u within(group, selected) en drukt u op enter. Er worden extra selectiehalo's weergegeven. Om deze resten als sticks weer te geven, klikt u met de rechtermuisknop om het pop-upmenu te openen, plaatst u de muisaanwijzer op stijl, schema en klikt u vervolgens op sticks.Merk op dat er hier nog steeds enkele lege halo's zijn. Dit zijn de watermoleculen in de actieve plaats. Om alleen de watermoleculen te selecteren, kunnen we dit commando opnieuw uitvoeren en vervolgens wijzigen.Klik in de console en gebruik vervolgens de pijltoetsen omhoog om die opdracht te vinden en klik op Enter om deze opnieuw uit te voeren. Om de watermoleculen als atomen weer te geven, willen we de selectie van het ligand en het eiwit verwijderen. We typen twee commando's om dat te doen.Onze ligans worden beschouwd als heterogroepen, maar water wordt ook als één beschouwd. Dus binnen dit commando moeten we definiëren dat we het water niet verwijderen. Druk op enter en nu worden alleen de watermoleculen geselecteerd.Klik op het vervolgkeuzemenu, beweeg de muisaanwijzer over atoom en klik op 20% van de straal van Van der Waals. Het groene magnesiumion wordt nog steeds weergegeven als stokjes. Vaker worden ionen weergegeven als bollen.Klik in de Jmol-console en typ vervolgens MG selecteren en vul vervolgens 50% De liganden in de kettingen zijn identiek gekleurd. Om ze van elkaar te onderscheiden, is het handig om de liganden opnieuw te kleuren. In de console voer ik een multiline-commando uit, dat ik heb gekopieerd-geplakt van een spiekbriefje dat ik uitwerk in de aanvullende Jmol-video.Het resultaat van dit protocol zou een model moeten zijn dat er zo uitziet met de actieve plaats van het eiwit weergegeven als sticks. En de liganden toonden ons stokken in een zachter kleurenschema. Gele lijnen geven de bindingsinteracties aan en individuele residuen worden naar wens geëtiketteerd.De PyMOL-interface bevat vervolgkeuzemenu's, de structuurviewer, het deelvenster namenobjecten en het menu met muisbedieningen. De hoofdopdrachtregel is ook gelabeld in deze afbeelding. We beginnen het oerprotocol bij stap 4.4, waarbij residuen binnen vijf angstroms worden geselecteerd om een actieve locatie te definiëren.Om de liganden te selecteren, klikt u op elk van hen. Er verschijnt een nieuwe selectie, die kan worden hernoemd door op de A-knop te klikken. Verwijder met het toetsenbord de letters sele en typ ligans in plaats daarvan.Druk op enter. We kunnen deze selectie gebruiken om het gebied eromheen te definiëren. Klik eerst op de A-knop en selecteer het duplicaat van het menu-item.Klik in deze nieuwe selectie, sel01, op A en selecteer het menu-item Naam wijzigen. Verwijder met het toetsenbord de bestaande letters en typ actief. Dit is nog steeds het selecteren van onze drie liganden, dus we zullen het opnieuw moeten wijzigen met behulp van de A-actieknop.Klik op de knop, selecteer wijzigen en vouw de selectie uit met vijf angstroms. Nu hebben we de liganden en de residuen binnen vijf angstroms gevangen. De S op de S-knop staat voor show.Klik hierop om het eiwit op verschillende manieren weer te geven. We laten deze drop zien als stokken. Klik in de lege ruimte om de selectie te wissen.Dit heeft de aminozuren binnen vijf angstroms gevangen, maar niet het water. We kunnen opnieuw de selectie dupliceren en nu aanpassen om alleen het water te selecteren. In de A-knop acties, dupliceren.Selectie 2 verschijnt. Laten we dit hernoemen naar actief water. Deze keer gebruiken we de A-knop om te wijzigen, rond om de atomen rond onze selectie te selecteren.Atomen binnen vier angstroms. Deze heeft het water geselecteerd maar ook enkele atomen van de zijketens. Als u dit verder wilt wijzigen, gebruikt u de A-knop om oplosmiddel te wijzigen en te beperken.Nu kunnen we zien dat alleen de watermoleculen worden verlicht. Ook in de A-knop kunnen we een preset toepassen. Selecteer preset, bal en stick en nu worden de watermoleculen weergegeven als bolletjes.Het eindresultaat van het protocol is een model dat er zo uitziet met de actieve plaats in liganden weergegeven als stokken die op een contrasterende manier zijn gekleurd. Gele streepjeslijnen tonen polaire bindingsinteracties en afzonderlijke resten worden gelabeld met behulp van de selecties die zijn gemaakt in het deelvenster Objecten namen. Fouten in de uitvoering van het protocol kunnen leiden tot suboptimale resultaten.Bijvoorbeeld, het hele eiwit wordt weergegeven als stokjes. Om problemen op te lossen, moet de gebruiker eerst de stickweergave voor de hele structuur verbergen. En geef vervolgens de stickweergave opnieuw weer voor alleen het object dat actief wordt genoemd met de S-knop.Hier worden de modellen die met elk programma worden gegenereerd, naast elkaar weergegeven. Hoewel er verschillen zijn in de weergave van het enzym, zijn dezelfde belangrijke kenmerken en interacties te zien in elk van de vier modellen. Een gebruiker die geïnteresseerd is in het beheersen van een van de programma's met een opdrachtregel, wil leren getypte opdrachten toe te passen en te wijzigen.Zoals ik al aangaf in het Jmol-protocol, is een handig hulpmiddel een commando-spiekbriefje. Een tekstbestand zonder opmaak met veelgebruikte codes om naar te verwijzen. Om een gevorderde gebruiker te worden, is het handig om te begrijpen welke delen van het protocol kunnen worden aangepast en aangepast.Met oefening kunnen deze protocollen worden toegepast om elke enzym actieve plaats van belang te modelleren.

modeling-an-enzyme-active-site-using-molecular-visualization-freeware

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Kanalen voor het transport van watermoleculen in enzymen beïnvloeden actieve plaats solvatatie en katalyse. Hierin presenteren we een protocol voor de engineering van deze extra katalytische motieven op basis van in silico computermodellen en experimenten. Dit zal ons begrip van de invloed van oplosmiddel dynamiek op enzymkatalyse verbeteren.

Ontrafelen Entropic Rate Versnelling geïnduceerd door Solvent Dynamiek in Membrane Enzymen

PathWhiz is een uitgebreide, online traject tekenprogramma voor het genereren van biochemische en biologische pathways. Het maakt gebruik van publiek toegankelijke databanken en gemakkelijk uit te breiden paletten bestaande uit pre-getekende pathway componenten. Dit protocol beschrijft hoe u nieuwe wegen gemakkelijk op te bouwen, te repliceren en bestaande paden bewerken en verspreiden eerder getekende paden naar verschillende organismen.

Een Web tool voor het genereren van hoge kwaliteit Machine-leesbaar biologische pathways

Een protocol voor het online onderzoek van eiwitsequentie-structuur-dynamiek relaties met behulp van Bio3D-web wordt gepresenteerd.

Onderzoek naar eiwitsequentie-structuur-dynamiek Relaties met Bio3D-web

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

We presenteren een algemeen protocol voor het identificeren van korte stukken van homologe gastheer-pathogen eiwit sequenties (SSHHP'S) ingebed in de virale poly eiwit. SSHHP'S worden herkend door virale proteasen en richten de gerichte vernietiging van specifieke gastheer proteïnen op door verschillende groep IV virussen.

Analyse van virale SSHHP'S in groep IV met gebruikmaking van in vitro en silico-methoden

Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.

Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het structuurgestuurde ontwerp van eiwit-ligandbindingsinteractie tussen Sanglifehrin A en Cyclophiline A/Ganoderiol-F, essentieel voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen. De stabiliteit van het ligand-receptorcomplex werd geëvalueerd met behulp van moleculaire dynamica-simulatie.

Structuurgeleid ontwerp en ontwikkeling van nieuwe cyclophiline A-remmers en ganoderiol-F-derivaten: een in-silico-benadering

Computationele methoden zijn veelbelovend voor het versnellen van de ontdekking van geneesmiddelen, maar ze zien vaak de dynamische aard van eiwitstructuren over het hoofd. Hier bespreken we ensemble-gebaseerde docking-analyse om indirect eiwitflexibiliteit op te nemen, waardoor de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van inspanningen voor het ontdekken van geneesmiddelen mogelijk wordt verbeterd.

Integratie van de flexibiliteit en dynamiek van de doeleiwitstructuur bij het ontdekken van computationele geneesmiddelen met behulp van ensemble-gebaseerde dockinganalyse

Deze studie gebruikte in-silico-strategieën om Enumerated Etravirine te identificeren als een veelbelovend therapeutisch middel voor HIV. Onze bevindingen over moleculaire interacties en dynamiek ondersteunen het rationele ontwerp van nieuwe NNRTI's als mogelijke alternatieven voor de behandeling van hiv.

Kwantitatieve structuur-activiteitsrelatie, activiteitsvoorspelling en moleculaire dynamiek van niet-nucleotide reverse transcriptaseremmers

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Leer biomoleculaire modellering van enzymactieve plaatsen met behulp van iCn3D, Jmol, PyMOL en UCSF ChimeraX. Deze tutorial toont stapsgewijs hoe je glucokinase structuren visualiseert met liganden en residuen.

Modellering van een Enzyme Active Site met behulp van Moleculaire Visualisatie Freeware

Meer video's verkennen