Identificatie van de bron van uitgescheiden eiwitten in de nier door Brefeldin A-injectie

Onze techniek stelt ons in staat om de bron en de relatieve bijdrage van cytokineproducerende cellen in beschadigde nieren te identificeren. Door Brefeldin A te gebruiken om eiwitsecretie te voorkomen, kunnen we meer informatie verzamelen over de cellen die cytokinen produceren in vaste organen, zoals het celtype en de toestand van deze cellen.

Ons protocol moet gemakkelijk kunnen worden aangepast aan veel orgaansystemen. Aangezien Brefeldin A een celdoorlatend klein molecuul is, zou het de secretie in de meeste celtypen moeten remmen, waardoor cytokines en andere uitgescheiden eiwitten kunnen worden gedetecteerd.

Stuitinjectie is technisch de meest uitdagende stap omdat het stuitje van de muis vrij klein is. We raden aan om deze stap te oefenen voordat u ons protocol op proefdieren uitvoert.

[Docent] Begin met het half aan, half van het verwarmingskussen te zetten gedurende 10 minuten om ervoor te zorgen dat de muizen warm zijn. Nadat u de muis in een fixatiemiddel hebt geplaatst, desinfecteert u de staart driemaal met een povidonjodium- en alcoholdoekje. Houd de staart horizontaal en visualiseer de laterale staartaders. Breng vervolgens een naald van 28 gauge in en houd de naald en spuit evenwijdig aan de ader in de richting van het hoofd. Injecteer 200 microliter van de 1,25 milligram per milliliter BFA-oplossing. De ader moet helder worden wanneer het bloed wordt vervangen door de injectieoplossing. Verwijder vervolgens de naald en druk voorzichtig op de staart totdat het bloeden stopt. Breng de muizen terug naar de kooi en controleer ze op extra bloedingen of tekenen van angst. Gebruik een spuit van 20 milliliter en perfuseer de muis met 10 tot 20 milliliter PBS door de linkerventrikel met een stroomsnelheid van twee tot vier milliliter per minuut totdat het perfusaat helder wordt. Verwijder de nieren door de nierslagader en -ader dicht bij de papil te houden en het bloedvat aan de kant weg van de nier door te snijden. Verwijder vervolgens voorzichtig het nierkapsel door het met de hand of met een fijne steriele tang af te pellen. Gebruik een hydrofobe barrièremarkeerstift en schets de weefselsecties, met een afstand van ten minste vijf millimeter van het weefsel tot de hydrofobe barrièrecontour. Voeg vervolgens 50 microliter blokkeerbuffer met 3% ezelserum en 0,1% triton in 1% runderserumalbumine TBS toe aan de sectie. Incubeer kamertemperatuur gedurende een uur in een bevochtigde kamer. Verdun de primaire antilichamen met PBS in de juiste concentratie. Om cytokines te detecteren, verdunnen antilichamen gericht tegen TGF bèta één, PDGF-D of CTGF in 50 microliter PBS. Voeg anti-Alpha SMA primair antilichaam geconjugeerd met Cy3 toe aan de primaire antilichaamoplossing in verdunningen van 1:200 om de myofibroblasten te labelen. Verwijder de blokkeerbuffer en voeg de primaire antilichamen toe aan de sectie, zodat deze niet uit de cirkelvormige hydrofobe omtrek lekt. Incubeer een nacht bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer. Verwijder de bevochtigde kamer uit de broedmachine en was de objectglaasjes drie keer gedurende vijf minuten met PBS. Verdun vervolgens de juiste secundaire antilichamen bij één tot 200 met PBS. Incubeer de monsters met 50 microliter secundaire antilichaamoplossingen gedurende een uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Haal de glaasjes uit de bevochtigde kamer en was ze vijf minuten met PBS. Verdunde lotustetragonolobuslectine geconjugeerd met fluoresceïne in PBS met calcium en magnesium in een concentratie van 10 microgram per milliliter. Incubeer vervolgens de weefsels met 50 microliter LTL-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Verwijder de objectglaasjes uit de bevochtigde kamer en was ze vijf minuten met PBS met calcium en magnesium. Incubeer de weefsels met 50 microliter DAPI om DNA-kernen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te kleuren. Was een keer met PBS. Voeg 20 microliter antifade-montagereagens toe aan het weefsel om de dekglaasjes te monteren en plaats vervolgens langzaam het dekglaasje. Wacht 24 uur totdat het antifade-reagens is gestold voordat u de beeldvorming uitvoert. Zet de omgekeerde microscoop aan met een geautomatiseerde XY-tafel en selecteer het 20x objectief. Plaats het objectglaasje op de microscooptafel en zoek het weefselgedeelte. Open vervolgens de software voor het verzamelen van afbeeldingen en klik op live om het liveweergavevenster te openen. Zoek het weefselgedeelte en zorg ervoor dat het scherp is. Klik op het menu Verkrijgen en selecteer Grote afbeelding scannen. Stel het te scannen gebied in door de objecttafel met de joystick naar het meest linkse deel van het weefselgedeelte te verplaatsen en klik vervolgens op de pijl naar links. Herhaal dit voor de bovenste, meest rechtse en onderste weefselsegmenten. Klik op het acquisitiemenu en zorg ervoor dat het selectievakje voor meerkanaals opname is aangevinkt. Om meerkanaalsfoto's vast te leggen, klikt u op het tabblad lambda, klikt u op elk kanaal en stelt u de belichtingstijd in op een niveau waarop de vlekken zichtbaar zijn zonder enig deel van het beeld te verzadigen. Herhaal dit voor elk te verzamelen kanaal. Klik vervolgens op Scannen. Open de software voor het verzamelen van afbeeldingen en klik op Bestand. Klik vervolgens op Openen en selecteer de afbeelding. Klik met de rechtermuisknop op het afbeeldingsvenster en kies Veelhoekige ROI. Geef een overzicht van de ROI met een tool uit de vrije hand. Geef vervolgens een overzicht van de LTL-positieve tubuluscellen of alfa SMA-positieve interstitiële cellen. Klik op het tabblad Meting en vervolgens op de drempelwaarde. Stel de bovenste en onderste drempellimieten in door de schuifregelaars aan weerszijden van het positieve signaalgebied aan te passen. Klik vervolgens op het tabblad ROI. Klik ten slotte op het exportpictogram om de waarden op te slaan. Gebruik spreadsheetsoftware om de percentages van het positieve signaalgebied per ROI-gebied te berekenen.

[Presentator] TGF bèta-positieve blaasjes op dag drie na toediening van cisplatine of zoutoplossing worden weergegeven in de representatieve beelden. TGF bèta-positieve blaasjes worden waargenomen in PTC's gelabeld met LTL in met cisplatine behandelde nieren in aanwezigheid van BFA. Deze blaasjes werden echter niet waargenomen in niet-beschadigde of BFA-onbehandelde nieren.

[Docent] Modificatie onthulde een toename van het TGF bèta-positieve gebied met BFA-behandeling bij door cisplatine geïnduceerde acute nierbeschadiging. Net als bij TGF-bèta accumuleerden PTGF-D positieve of CTGF-positieve blaasjes ook met BFA-behandeling bij cisplatine geïnduceerde AKI. Kwantificering toonde aan dat PDGF-D-positieve en CTGF-positieve gebieden ook significant waren verhoogd met BFA in LTL-positieve proximale tubuluscellen BFA-injectie verhoogde de plasma-BUN-spiegels niet significant op dag drie na cisplatine-injectie. TGF bèta-positieve blaasjes werden waargenomen in alfa SMA-gelabelde interstitiële cellen in cisplatine AKI met BFA-behandeling. Modificatie toonde aan dat de TGF bèta-positieve gebieden in het alfa SMA-positieve gebied significant waren verhoogd met BFA-behandeling in cisplatine AKI. Net als bij TGF bèta-positieve blaasjes, namen CTGF-positieve blaasjes ook toe bij behandeling met BFA. Kwantificering toonde aan dat BFA-behandeling de verhouding tussen CTGF-positief gebied en alfa-SMA-positief gebied verbeterde in door cisplatine geïnduceerde AKI. Vergeleken met door cisplatine geïnduceerd letsel, waren TGF-bèta-positieve blaasjes in PTC's veel kleiner in de chronische fase van AA. Er was minimale positieve kleuring bij LTL-positieve PTC's. De signaalintensiteit van TGF bèta in nierbeschadigingsmolecuul één positieve PTC's was echter verhoogd met BFA-behandeling. Het gemiddelde intensiteitsniveau van TGF bèta was drie keer hoger met BFA-injectie dan zonder BFA.

De meest kritieke stap is ervoor te zorgen dat de injectie van de staartader succesvol is. Een mislukte injectie zou de resultaten in de war sturen. Zoek dus naar de tekenen van succes, zoals de ader die helder wordt met de injectie en zoek naar de tekenen van falen zoals zwelling over de staarten.

De Brefeldin A-injectie kan worden gecombineerd met een aantal testen, waaronder western blot- of flowcytometrie, om de cytokineproductie op orgaan- of eencellige schaal te evalueren.

Met behulp van deze techniek hebben we nieuwe cytokinen kunnen identificeren die worden uitgescheiden door nierepitheelcellen waarvan eerder werd gedacht dat ze afkomstig waren van andere celtypen. Het kan worden gebruikt om langdurige debatten over de bijdrage van specifieke celtypen aan letsel te beslechten.